专利名称：一种重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白冻干粉针剂的制作方法类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是人类最常见的自身免疫性疾病之 一，患病率约1%，与人类白细胞抗原DR4/DR1明显相关，具有一定的遗传倾向。RA的临床 特征多为手、足、腕、膝、臀等的关节滑膜发炎，最终导致关节损伤。滑膜炎引起大量淋巴细 胞浸润，主要包括巨噬细胞、T淋巴细胞和浆细胞，同时血管增生。关节损伤主要发生于滑 膜与软骨和骨毗邻处。月中瘤坏死因子 α (Tumor Necrosis Factor Alpha, TNF α )禾口淋巴毒素 (Lymphotoxin,LT)是通过与其共同受体TNFR75和TNFR55结合而发挥生物学作用的，大量 实验证据表明可溶性TNFR75和TNFR55 (即受体的膜外部分)可以通过与TNF α和LT的有 效结合而阻断TNFa和LT在生物体内的生物学作用。TNF α抗体治疗RA的原理是细胞因子之间能相互诱导促成或抑制，形成所谓的细 胞因子网络。细胞因子网络失调是RA的主要发病机制及病理原因。炎性滑膜内，不仅促炎 细胞因子水平上调，抗炎细胞因子以及包括可溶性受体在内的细胞因子抑制剂也上调了。 20世纪90年代早期，人们发现TNF α、IL-U IL_6、GM-CSF, IL-8等都出现在滑膜中并促进 炎症发生。TNFa成为有效的RA治疗目标的证据主要有三个方面(1)类风湿性滑膜细胞 离体培养试验，加入抗TNF α抗体(抗-TNF α)能使培养物中IL-1的生物活性降低，后来 发现滑膜中GM-CSF、IL-6、IL-8水平也降低，表明IL_6、GM_CSF、IL-8阻断能使其他促炎因 子的生成减少；(2)用抗体或TNF受体(TNFR)-Fc融合蛋白来抑制TNF α，对II型胶原诱导 的关节炎模型动物有明显益处，即使在疾病发作后再开始治疗，多数情况下效果也很显著； (3)免疫组织学方法证实，受LPS刺激后，新冷冻组织中TNF及其受体的表达上调，说明TNF 与其受体间的相互作用在体内非常重要，进一步表明TNFa可能是很好的RA治疗目标。目前用于临床的TNFa阻断药物都是生物蛋白类药物，或是基于受体的药物，或 是抗体。其主要优点是特异性很强，但缺点也很明显，如质量不稳定、复溶效果不好等。
本发明提供了一种重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白冻干粉针剂及其制备 方法。该重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白粉针剂，含有人肿瘤坏死因子受体-Fc融 合蛋白和药理允许的保护剂和缓冲剂。保护剂选自蔗糖、聚乙二醇、聚乙烯片吡咯烷酮、甘露醇、海藻糖、乳糖、右旋糖苷 和葡萄糖中的一种或多种；缓冲剂选自氨丁三醇、醋酸钠、柠檬酸钠和磷酸二氢钠中的一种 或多种。优选地，保护剂选自蔗糖、聚乙烯片吡咯烷酮和右旋糖苷中的一种或多种；缓冲剂 选自醋酸钠或氨丁三醇。优选地，所述粉针剂含有重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白125份、保护剂比例为10-50份、缓冲剂比例为0.5-2份。更优选地，含有重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合 蛋白125份、保护剂比例为35-45份、缓冲剂比例为1.0-1.4份。进一步优选地，含有125重 量份的重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白、45重量份的保护剂、1. 4重量份的缓冲剂。重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白制备过程中所选的过滤系统的滤膜或滤 芯材质为混合纤维素、醋酸纤维素、硝酸纤维素、活性炭纤维、玻璃纤维、加强型尼龙、聚偏 二氟乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚醚砜或尼龙66中的一种或多种，孔径为0. 22 μ m。该过滤 系统不仅可以有效截留细菌和细菌孢子，药液残留少，达到快速除菌的效果，而且不吸附蛋 白，保证了该制剂的成品率。重组人肿瘤坏死因子受体-FC融合蛋白粉针剂的制备方法，包括以下步骤称取 重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白、保护剂和缓冲剂，加预冷至4 10°C注射用水充分 混勻，用盐酸或氢氧化钠调其PH至7. 1-7. 7，药液经0. 22 μ m的的除菌过滤系统除菌过滤。 得rhTNFR-Fc半成品；冷冻干燥得重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白粉针剂。其中所述冷冻干燥具体包括以下步骤1)预冻阶段预冻温度为-45 V -30 V，保持预冻温度1 3小时；2)升华干燥阶段真空度1 3bar，温度为_35°C _25°C，保持6 12小时；3)解析干燥阶段真空度 1 3bar，分别在-20°C、-15°C、-10°C、-5°C、5°C、10°C、 20°C、30°C各恒温干燥2 6小时。与现有技术相比，本发明的重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白粉针剂，成品 率高，稳定性好，外形饱满，质地均勻，复溶迅速。而且，其PH、澄清度与颜色、含量、无菌等多 项指标均符合质量标准并优于现有技术。本发明的重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白 冻干粉针剂制备工艺能够保证产品质量稳定可控、干燥效果好、产品水分含量低。制备时采 用的除菌过滤系统和冻干工艺，还可以显著缩短生产时间，减少污染和交叉污染概率。2)升华干燥阶段真空度3bar，温度为_29°C，保持11小时；3)解析干燥阶段真空度 2bar，分别在 _20°C、-10°C、_5°C、10°C、20°C、30°C各恒 温干燥3个小时，即得注射用重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白粉针剂。实施例5TNFR-Fc12. 50g 甘露醇3. IOg 葡萄糖0. 40g 醋酸钠0. 13g注射用水定容至IOOOml按照处方准确称量，加注射用水充分混勻后，用盐酸调其pH至7. 30。将药液经 0.22 um的材质为聚偏二氟乙烯的滤盘加压除菌过滤。得rhTNFR-Fc半成品。将半成品分装于玻璃西林瓶中(lml/瓶)，放入冻干机中，开启冻干机，过程如下1)预冻阶段预冻温度为_45°C，保持预冻温度3小时；2)升华干燥阶段真空度lbar，温度为-30°C，保持11小时；3)解析干燥阶段真空度 lbar，分别在 _20°C、-10°C、_5°C、10°C、20°C、30°C各恒 温干燥3h、6h、2h、2. 5h、2h、3. 5h，即得注射用重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白粉针 剂。实施例6TNFR-Fc12. 50g乳糖0. 70g甘露醇0. 90g氨丁三醇0. IOg注射用水定容至IOOOml按照处方准确称量，加注射用水充分混勻后，用盐酸调其pH至7. 40。将药液经 0.22 um的材质为聚醚砜的滤盘加压除菌过滤。得rhTNFR-Fc半成品。将半成品分装于玻璃西林瓶中(lml/瓶)，放入冻干机中，开启冻干机，过程如下1)预冻阶段预冻温度为-30°C，保持预冻温度3小时；2)升华干燥阶段真空度3bar，温度为_35°C，保持12小时；3)解析干燥阶段真空度31^1~，分别在-201、-151、-51、51、201、301各恒温 干燥2. 5个小时，即得注射用重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白粉针剂。实施例7TNFR-Fc12. 50g蔗糖0. 85g聚乙烯片吡咯烷酮0. 15g醋酸钠0. 05g注射用水定容至IOOOml按照处方准确称量，加注射用水充分混勻后，用盐酸调其pH至7. 70。将药液经 0.22 um的材质为聚四氟乙烯的滤盘加压除菌过滤。得rhTNFR-Fc半成品。将半成品分装于玻璃西林瓶中(lml/瓶)，放入冻干机中，开启冻干机，过程如下1)预冻阶段预冻温度为-30°C，保持预冻温度1小时； 2)升华干燥阶段真空度2bar，温度为_25°C，保持12小时；3)解析干燥阶段真空度 3bar，分别在-20 V、-15 °C、-10 °C、_5 °C、5 °C、10 V、 20°C、3(TC各恒温干燥4个小时，即得注射用重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白粉针 剂。实施例8TNFR-Fc12. 50g聚乙二醇l.OOg右旋糖酐4. OOg醋酸钠0. 14g注射用水定容至IOOOml按照处方准确称量，加注射用水充分混勻后，用盐酸调其pH至7. 10。将药液经 0. 22 μm的材质为聚丙烯的滤盘加压除菌过滤。得rhTNFR-Fc半成品。将半成品分装于玻璃西林瓶中(lml/瓶)，放入冻干机中，开启冻干机，过程如下1)预冻阶段预冻温度为_35°C，保持预冻温度3小时；2)升华干燥阶段真空度2bar，温度为_25°C，保持11小时；3)解析干燥阶段真空度 lbar，分别在 _20°C、-10°C、_5°C、10°C、20°C、30°C各恒 温干燥3. 5个小时，即得注射用重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白粉针剂。实施例9TNFR-Fc12. 50g右旋糖酐5. OOg柠檬酸钠0. 20g注射用水定容至IOOOml按照处方准确称量，加注射用水充分混勻后，用盐酸调其PH至7. 44。将药液经 0. 22 μm的材质为聚丙烯的滤盘加压除菌过滤。得rhTNFR-Fc半成品。将半成品分装于玻璃西林瓶中(lml/瓶)，放入冻干机中，开启冻干机，过程如下1)预冻阶段预冻温度为_45°C，保持预冻温度2小时；2)升华干燥阶段真空度3bar，温度为-35°C，保持6小时；3)解析干燥阶段真空度 3bar，分别在 _20°C、-10°C、_5°C、10°C、20°C、30°C各恒 温干燥2. 5h、3. 5h、3h、2h、4h、2. 5h，即得注射用重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白粉 针剂。对比例处方选用市售同品种粉针的处方重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白12. 50gD-甘露醇4. OOg蔗糖l.OOg氨丁三醇0. 12g制备方法同实施例1。实施例10稳定性试验。分别按照实施例1-9及对比例制备样品三批，每批各取60瓶，采用加速稳定性试 验和长期试验考察其贮存稳定性。其中三批样品中选择稳定性相对较差一点的与对比例相 对较好一点的进行比对，并将数据列入以下表格。加速试验在25°C 士2°C的条件下进行，时间为6个月。所用设备能控制温度士2°C， 并对实际温度进行监测。在试验期间第1个月、2个月、3个月、6个月末取样一次，按稳定性 重点考察项目检测。长期试验在6°C 士2°C的条件下进行，分别于0个月、3个月、6个月、9 个月、12个月末按稳定性重点考察项目进行检测；12个月以后，分别于18个月、24个月、36 个月继续考察，取样进行检测(其中无菌检查按照中国药典2005版三部附录VIIA检查，纯 度检查按照还原SDS-PAGE电泳法测定)，结果显示与0月对比均无显著性变化，且比对比例 具有更稳定的特征，结果见表1、表2。表1、加速稳定性实验结果


本发明属于医药技术领域，具体涉及一种重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白冻干粉针剂及其制备工艺。它由人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白加入药理允许的保护剂和缓冲剂，经优化的冻干方法制成质量稳定的粉针剂。其保护剂为蔗糖、聚乙二醇、聚乙烯片吡咯烷酮、甘露醇、海藻糖、乳糖、右旋糖苷、葡萄糖中的一种或多种；缓冲剂为氨丁三醇、醋酸钠、柠檬酸钠、磷酸二氢钠中的一种或多种。