专利名称：Trim28基因及其表达产物的应用的制作方法蛋白激酶是由人类基因组中最大的ー类基因所编码，其作用是通过将磷酸基团转移至底物蛋白上，来调控各种蛋白的活性、信号转导通路及细胞生物学过程，人类基因组编码超过57个激酶家族之中的518种蛋白激酶，大约有55%已知的原癌基因编码蛋白激酶，其余多数的原癌基因则编码可激活蛋白质激酶或被激酶磷酸化的特异蛋白。所有蛋白激酶參与细胞信号通路，參与心血管疾病、糖尿病、感染性疾病、关节炎和其它免疫紊乱、神经系统如老年性痴呆症，阿默海茨症AD等发病机制，现已发现与超过400种 人类疾病与蛋白激酶相关。美国FDA的制药和生物技术公司中有四分之一的药物研究开发方案集中在研发新的蛋白激酶抑制剂，这些药物应用于治疗包括肿瘤、炎症、心力裳竭、糖尿病和神经系统疾病，超过60种的蛋白激酶抑制剂正在临床试验之中，其中许多已开发上市，如诺华(Novartis)的Gleevec ，阿利斯康(AstraZeneca)的Iressa ,施贵宝的 Tarceva (Genentech and OSI Pharmaceuticals),拜尔的 Nexavar (Bayer),辉瑞的Sutent (Pfzer), Sprycel (Bristol-Myers Squibb),和葛兰素史克的Tykerb (GlaxoSmithKline)]，制药公司清楚地认识到蛋白激酶抑制剂的重要性，已成为药物研发的热点。肝癌严重威胁着我国人民的生命健康。肝癌的诊断，尤其早期诊断是临床诊疗和预后的关键。肝癌的治疗在过去20年来已取得很大的进展，外科手术切除及肝脏移植属于“根治性”治疗，仍是肝癌治疗的首要选择。随着肝癌早期诊断水平的提高及肿瘤治疗生物学概念的改变，肿瘤局部非手术治疗在肝癌治疗中的地位日益提高。经导管动脉内化疗栓塞(TACE)已成为不能切除肝癌治疗的首选方法，是中晚期肝癌治疗的重要手段。该方法可使90%以上的肝癌患者受益，但总体疗效有待提高。此外，经皮肝穿刺瘤内无水こ醇治疗(PEI)也是较常用的局部化疗方法，对癌直径< 3cm的肝癌及门静脉癌栓的治疗有一定价值。但目前肝癌的化疗药物基本沿用其他肿瘤的治疗药物，针对性差，疗效不佳，因此，迫切需要寻找新的作用靶点，研究和开发肝癌特异的新药物，提高化疗的特异性和有效性。近几年来随着对肝癌基础研究的深入，生物治疗在肝癌的综合治疗中取得了较大进展，成了继手术、放疗、化疗后肿瘤治疗的第四大疗法，如免疫治疗、基因治疗，包括抗血管生成、自杀基因治疗、肿瘤疫苗治疗、siRNA技术等。但许多生物治疗的临床疗效仍不十分满意，且绝大多数还处在实验研究阶段，相关的关键理论和实验技术仍需进ー步研究和发展。TR頂28基因编码的蛋白通过与许多转录因子中都存在的Kruppel相关box抑制结构域相互作用而发挥转录调控功能。该蛋白定位于核，结合特定的染色质区域。本发明中首次公开了干扰TRIM28基因能够抑制肝癌细胞的生长，提示TRIM28基因是ー种新型的制备肝癌治疗药物的靶点。
本发明要解决的技术问题之ー是提供ー种TRM28基因及其表达产物在制备治疗肝癌的药物中的应用。本发明要解决的技术问题之ニ是提供三对TR頂28基因的siRNA，该三对siRNA可用于制备治疗肝癌的药物。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一方面，提供了ー种TRIM28基因在制备治疗肝癌的药物中的应用。所述治疗肝癌的药物包括通过RNA干扰抑制TR頂28基因表达的双链核糖核酸、 DNA载体、腺病毒或腺相关病毒载体、能够抑制TRIM28蛋白激酶活性的化合物、多肽、单克隆抗体。为了实现本发明中TRM28基因作为制备肝癌治疗药物的靶点，本发明通过如下技术方案实现I、化学合成双链核糖核酸分子，其序列特异性针对TRIM28基因序列，利用脂质体包裹递送至肝癌细胞内，干扰TR頂28基因的表达，CCK-8法测量肝癌细胞Huh-7，Hep3B,MHCC-97H，MHCC-97L生长活性。本发明中实验结果证明特异性针对TR頂28基因的小核糖核酸分子能够抑制肝癌细胞体外的生长，说明TRIM28基因可用作制备肝癌治疗药物的靶基因。本发明中用于特异性干扰TRIM28基因的小核糖核酸序列设计原则如下(I)从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找“AA” ニ连序列，并记下其3’端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在45% -55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5’和3’端的非编码区(untranslated regions, UTRs),原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNA核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。(2)将潜在的序列和相应的基因组数据库(人，或者小鼠，大鼠等等)进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST(www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)。(3)选出合适的目标序列进行合成。通常ー个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列体外评估干扰TRIM28基因表达，肝癌细胞克隆形成能力、软琼脂克隆形成能力、细胞周期、细胞凋亡等细胞生物学特性的改变。2、体外评估干扰TRIM28基因表达，肝癌细胞克隆形成能力、软琼脂克隆形成能力、细胞周期、细胞凋亡等细胞生物学特性的改变。3、利用各种载体，包括DAN载体、腺病毒、腺相关病毒载体来干扰TRIM28基因的表达，达到体内干扰TRIM28基因的效果，检测它们对裸鼠皮下移植瘤、肝脏原位接种瘤的治疗效果，从而实现抑制肝癌细胞体内増殖的目的。4、获得能够特异性抑制TR頂28基因激酶活性的多肽、单克隆抗体，达到抑制TRIM28激酶活性的目的，从而实现抑制肝癌细胞体内増殖的目的。在本发明中，可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对TRIM28蛋白特异的抗体。例如，将提纯的人TRIM28基因产物或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗体。同样，表达人TRIM28蛋白或它的抗原的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。根据本发明制备的抗体可以是单克隆抗体，这些单克隆抗体可用杂交瘤及时制备。本发明的抗体包括可以阻抑TRM28功能的抗体，也可以是不影响人TRM28功能的抗体。每ー类抗体都可以通过对人TRM28基因产物的片段或功能域致免疫而产生，而人TRM28基因产物及其片段可以用重组方法产生或用多肽合成仪进行合成。与非修饰形式的TRIM28基因产物结合的抗体，可以利用在原核细胞例如E. coli中产生的基因产物来免疫动物而得到。与翻译后修饰形式如糖基化或磷酸化TRIM28蛋白或多肽结合的抗体，可以利用在真核细胞如酵母或昆虫细胞中产生的基因产物来免疫动物而得到。5、获得能够特异性抑制TR頂28基因激酶活性的化合物，达到抑制TR頂28激酶活性的目的，从而现实抑制肝癌细胞増殖的目的。在本发明中，TRIM28蛋白激酶特异性抑制剂可以使用一系列已知的方法来制备。例如，建立特异性激酶活性检测体系，对小分子化合物库进行高通量筛选；或者利用计算机 辅助的方法进行激酶结构建模，分子对接的方法预测出高可信度的抑制物，再通过实验验证等。在本发明的另一方面，提供用于制备治疗肝癌的药物的TRIM28基因的三对siRNA，分别为TR頂28-si I，TRIM28-si2, TR頂28_si3。其中，TR頂28-sil的正义链具有如SEQ ID NO. I所示序列，TR頂28-si I的反义链具有如SEQ ID NO. 2所示序列。TRIM28-si2的正义链具有如SEQ ID NO. 3所示序列，TR頂28-si2的反义链具有如SEQ ID NO. 4所示序列。TR頂28-si3的正义链具有如SEQ ID NO. 5所示序列，TRM28_si3的反义链具有如SEQID NO. 6所示序列。本发明实验证实通过TR頂28基因序列特异性siRNA干扰可以显著抑制肝癌细胞的生长，因此TRIM28基因及其表达产物可用于肝癌治疗的药物靶点，提供了新的肝癌治疗的基因靶点。总之，本发明TRIM28基因为防治肝癌提供了新的治疗靶点和有效新药。下面结合附图与对本发明作进ー步详细的说明图I为实施例I中RNAi筛选技术体系示意图。图2为实施例I中全激酶组规模RNAi细胞学筛选生长相关激酶的总体分布情况示意图。其中，图3A的横坐标參数表示在四株肝癌细胞H印3B，Huh-7，MHCC-97H，MHCC-97L中姆个siRNA影响细胞活性的程度,纵坐标參数表示细胞学筛选中姆个siRNA的变异系数情況。图3B显示了细胞RNAi筛选中四株细胞Z值的频数分布情況。图3为实施例I中细胞RNAi筛选中每株细胞Z值区段频数累计分布曲线及根据5 %可信区间、IO %分析区间取得相应的临界Z值，用于获取筛选中有意义的s i RNA及对应的激酶基因。图4为实施例I中在筛选体系中5%可信区间、10%分析区间内四株肝癌细胞生长必须的siRNAs及相应激酶数量示意图。图5为实施例I中RNAi筛选体系鉴定干扰TR頂28基因对四株肝癌细胞生长活性的影响情况示意图，结果显示RNA干扰TR頂28基因能够抑制肝癌细胞Hep3B、Huh-7、MHCC-97H的生长。
实施例3免疫检测I.抗原蛋白获得(I)利用基因工程表达可从Genebank数据库中获得人TR頂28基因的cDNA序列，通过PCR扩增获得编码框，插入原核生物或真核生物表达载体中，表达TRM28蛋白，并按基因工程表达产物的纯化体系纯化蛋白。2.抗体制备可采用以下几种方法制备抗体(I)细胞融合法用上述制备的TRIM28蛋白免疫动物(包括兔子、山羊等)，获得脾脏细胞，再与骨髄瘤细胞融合，并按常规单克隆抗体制备技术制备单克隆抗体。
(2)利用噬菌体表面展示库，克隆免疫动物的脾脏IgG可变区并表达成基因工程单克隆抗体。(3)利用纯化的蛋白免疫动物，制备多抗血清。实施例4TR頂28基因的小干扰核糖核酸(siRNA)体外化学合成小干扰核糖核酸(siRNA)具有快速、简单和特异性强等特点，在抗肿瘤治疗等方面有广泛的应用前景。针对TRIM28基因mRNA设计合成三条siRNAs，对应靶序列分别如下TR頂28-si I :正义链GGGUCAGGAGAUGAUCCCUACUCAA (SEQ ID NO : I);反义链TTGAGTAGGGATCATCTCCTGACCC(SEQ ID NO :2)；TRIM28-si2 :正义链CAGUGCUGCACUAGCUGUGAGGAUA(SEQ ID NO :3);反义链UAUCCUCACAGCUAGUGCAGCACUG(SEQ ID NO :4)；TRIM28-si3 :正义链GCCCUGAGACCAAACCUGUGCUUAU(SEQ ID NO :5);反义链AUAAGCACAGGUUUG⑶CUCAGGGC(SEQ ID NO :6)。另外设置无关序列作为阴性对照siRNA，其序列如下正义链，5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’(SEQ ID NO :7)，反义链，5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’(SEQ ID NO :8)在96孔板中每孔接种3X IO3 Huh_7，H印B，MHCC_97H和MHCC-97L细胞(来源于中国科学院细胞库)，待细胞密度达到40%左右吋，利用脂质体(Lipofectamine 2000)转染试剂分别将上述3种siRNA按终浓度50nmol/L转染进Huh_7，!fepB，MHCC-97H和MHCC-97L细胞中，4h后换成含10%胎牛血清的DMEM。以24h为I个检测单位培养7d，每天检测I次该细胞密度。每孔待测细胞液中加IOyL CCK-8，37°C孵育lh。利用酶标仪在450nm波长下检测其吸光度以代表细胞存活能力，绘制生长曲线。实验结果表明特异性干扰TRIM28表达的小干扰核糖核酸(siRNA)能够抑制肝癌细胞系MHCC-97H的生长，肝癌细胞的存活率明显低于对照组的细胞，说明人TRIM28基因的表达下调能在一定程度上抑制肝癌细胞生长。序列表〈110〉上海人类基因组研究中心<120>TRM28基因及其表达产物的应用<130>CPC-NP-11-15116<160>8 <170>PatentIn version 3. 3
<210>1<211>25<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_RNA〈222〉(I) ·· (25)<223>siRNA〈400〉Igggucaggag augaucccua cucaa 25<210>2<211>25<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_RNA〈222〉(I) ·· (25)<223>siRNA<400>2ttgagtaggg atcatctcct gaccc 25<210>3<211>25<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_RNA〈222〉(I) ·· (25)<223>siRNA<400>3cagugcugca cuagcuguga ggaua 25<210>4<211>25<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉
<221>misc_RNA〈222〉(I) ·· (25)<223>siRNA<400>4
uauccucaca gcuagugcag cacug 25<210>5<211>25<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_RNA
〈222〉(I) ·· (25)<223>siRNA<400>5gcccugagac caaaccugug cuuau 25<210>6<211>25<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_RNA〈222〉(I) ·· (25)<223>siRNA<400>6auaagcacag guuuggucuc agggc 25<210>7<211>21<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_RNA〈222〉(I) ·· (21)<223>siRNA<400>7uucuccgaac gugucacgut t21<210>8<211>21<212>RNA〈213〉人工序列〈220〉<221>misc_RNA〈222〉(I) ·· (21)<223>siRNA
<400>8
acgugacacg uucggagaat t 2

本发明公开了一种TRIM28基因及其表达产物的应用，用于制备肝癌治疗的产品。本发明的TRIM28基因及其表达产物可作为制备治疗肝癌药物的靶基因，提供新的肝癌治疗途径。