专利名称：双基因特异性表达的转基因抗真菌病害油菜培育方法 菌核病是油菜的主要病害，该病是由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的子囊孢子直接侵染衰老叶片，或先侵染飘落在衰老叶片上的花瓣后再产生菌丝侵入叶片和植株本体(李强生等，油菜菌核病病原菌浸染条件的研究，2000，安徽农业科学，28(3)314-315..)。几丁质是核盘菌菌丝体细胞壁的主要组成部分。几丁质酶破坏真菌菌丝尖端新合成的几丁质而抑制病菌的生长(Broglie等，Transgenic plants with enhanced resistance to the fungal pathogen，1991，Rhizoctonia solani.Science 2541194--1197.)。通过将几丁质酶基因转移到油菜中可使其几丁质酶活性显著提高，增强油菜对菌核病等真菌病害的田间耐性(Crison等，Field tolerance tofungal pathogens of Brassica napus constitutively expression a chimeric chintinases gene，1996.，Nature Biotechnolgy，(14)318-643.)。草酸是核盘菌侵染寄主植物后分泌的毒素。草酸氧化酶分解草酸、缓解核盘菌在油菜体内的毒性，转草酸氧化酶基因的转基因油菜的抗病性也得到了一定程度的增强(Poulsen等，Genitic transformation ofBrassica napus，1996，Plant Breeding115209-225；.Thompson C，Degradation of oxalic acid by transgenic oilseed rapeplants expressiong oxalate oxidase，1996，Euphytica 85169～172.)。但研究发现，具有单一抗病机制的单基因转化往往不能表现出理想的抗病性(Lamb等，Jach等，Enhancedquantitative resistance against fungal disease by combinatorial expression ofdifferent barley antifungal proteins in transgenic tobacco，1995，Plant J.897～109)。以前的研究还表明，组成型表达的几丁质酶基因或草酸氧化酶基因可能严重影响转基因植株正常的发育和结实(Medford等，Alteration ofendogenous cytokinins in transgenic plantsusing a chimeric isopentenyl transferase gene.，1989.，Plant Cell 1403～413.1989；Thompson等，Degradation of oxalic acid by transgenic oilseed rape plants expressiong oxalate oxidase.，1995.，Euphytica 85169～172.)，SAG12是拟南芥衰老叶片相关基因启动子，可以使受其调控的基因在衰老叶片中特异性表达(Lohman KN等.Molecular analysis of naturalsenescence in Aradopsis thaliana，1994，Physiologia Plantarum 92，332～328)。上述技术虽然在一定程度上解决现有油菜品质性状的改良或者某些抗性的改善等方面产生一些积极的效果，但是这些效果往往比较单一，存在着消耗植物体内能源和生理扰乱问题，最终导致改善的效果可能会有较大的损失。
本发明的第一个目的在于克服现有技术存在的缺陷，将几丁质酶基因和草酸氧化酶基因与拟南芥衰老叶片启动子SAG12相嵌合，使两外源基因仅在转基因油菜的衰老叶片中表达，这不仅会大大增强油菜的抗病性，减轻转基因植株的能源消耗和生理扰乱，还将使转基因作物更具有实用性。另外，由于在进化上花瓣是由叶片演化而来，是叶的变态，上述基因还可能在SAG12的启动下在花瓣中尤其是将要飘落的花瓣中特异性表达，使核盘菌难以侵染花瓣，从而减轻核盘菌对植株的再侵染。本发明的另一个目的是创造一种实用性强的高抗真菌病害的转基因油菜，将上述两种基因用活体转化方法(In planta)共同转化油菜，调控外源基因在油菜中的表达部位和表达时期，以大幅度减轻转基因对植株正常发育和结实的影响，从而获得抗真菌性病害的双价转基因油菜品种，或者创造油菜育种新种质材料，从而减轻转基因植株的能源消耗和生理扰乱，该方法将克服现有转基因技术效率不高、单基因转化油菜抗病性不强和能源损耗大之不足。发明的具体技术方案由以下步骤实现以聚合酶链式反应(PCR)扩增的方法从芸苔属以外的植物基因组中克隆几丁质酶基因(该基因来源文献见Broglie，K.E.等，Ethylene-regulated gene expressionmolecular cloning ofthe genes encoding an endochitinase from Phaseolus vulgaris.，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83(18)6820-6824.)和草酸氧化酶基因(该基因的来源见文献Zhang，Z.等，Germin-like oxalateoxidase，a H2O2-producing enzyme，accumulates in barley attacked by the powdery mildewfungus.，1995，Plant Journal 8139-145.)的氨基酸编码序列，或用限制性内切酶切下克隆在质粒中的几丁质酶基因和草酸氧化酶基因的氨基酸编码序列，从十字花科植物基因组中克隆衰老叶片特异表达的启动子序列(该启动子序列来源于文献Gan，S.and Amasino，R.M.Inhibitionof leaf senescence by autoregulated production of cytokinin.，1995，.Science 270(5244)1986-1988)，或用限制性内切酶切下克隆在质粒中的拟南芥衰老叶片特异表达启动子SAG12的DNA序列，然后用基因工程方法将几丁质酶基因和草酸氧化酶基因的氨基酸编码序列与衰老叶片特异表达启动子拼接成双基因表达载体，用活体转化方法将此构建物转入油菜受体中，通过筛选和育种途径，培育出在真菌性病害尤其是菌核病发病高峰期在病菌初始侵染部位具有较高抗病性的油菜新品种或新种质。其操作步骤如下一种培育抗真菌性病害的油菜新品种的方法，其特征在于A、利用聚合酶链式反应(RCR)或用限制性内切酶分离植物几丁质酶基因和草酸氧化酶基因的氨基酸编码序列和双子叶植物基因组衰老叶片特异表达的启动子序列；B、通过基因重组方法构建适合于在植物中表达的重组双基因的表达载体C、利用活体转基因方法将外源几丁质酶基因和草酸氧化酶基因导入油菜受体，获得转化植株 D、借助报告基因和RCR方法鉴定阳性转化株，分单株收种E、种植上季选留的种子，取叶片接种病菌和草酸胁迫鉴定，挑选有希望的株系，利用PCR方法鉴定阳性单株，进一步用分子杂交方法鉴定阳性转化株的整合拷贝数，将含1至少数几个拷贝的抗病转化株自交留种；F、种植收获的E步骤的种子，继续接种病菌和草酸胁迫鉴定，进一步考察转基因油菜抗病能力和农艺性状，从表型稳定、抗病性及农艺性状有较大改善的2-3个株系中选择其纯合的单株；G、进一步培育成油菜新品系或育种新资源。附图及其说明
图1本发明的器官和发育特异性表达双基因载体ApSCO的构建示意图其中A是本发明的中间载体pSAGOxO的结构示意；B是本发明的中间载体pSCON的结构示意；C是本发明的中间载体pSPCHiN的结构示意；D是本发明的中间载体pApSON的结构示意；E是本发明的目标载体ApSCO的结构示意；本发明的积极效果在于1、将几丁质酶基因和草酸氧化酶基因这两种在抗病机理上十分不同的基因组合在一起，构成了抵抗菌核病害的双重屏障，使油菜植株表现超强抗病性，创造了一种培育抗真菌性病害油菜育种的新方法；2、由于使用了叶片衰老特异性启动子，转基因油菜仅仅在需要抵抗病菌的特定时期和特定器官中表现抗病性，可以减轻转基因植株的能源消耗和生理扰乱；3、利用活体转化技术大大提高了转基因的效率，开拓了油菜转基因的新途径；4、本发明可以直接应用于其它抗病作物新品种和新资源的创新；5、本发明采用转基因方法，结合分子生物学技术辅助育种，使油菜特定新品种的选育周期缩短、并使育种的效率得到了较大的提高。
详细的技术细节由以下实例给出，但并不限制本发明的保护范围。

实施例1器官和发育特异性表达双基因载体ApSCO的构建1.1含SAG12启动子、几丁质酶基因和细胞膜引导肽基因的中间载体pSPCHiN的构建用EcoRV和NcoI双酶切拟南芥叶片衰老启动子SAG12的质粒载体pSG449后，电泳回收1.3kb的片段，并用Klenow片段补平，插入到大麦草酸氧化酶基因载体pHvOxOa的EcoRV位点，得到重组质粒pSAGOxO(见附
图1A)。用BamHI酶切含有几丁质酶(chitinase)基因和葡聚糖酶基因的质粒载体pHGC39，回收含有几丁质酶基因和nos终止子的1.4kb片段，插入pSAGOxO的BamHI位点，得到重组质粒pSOCN(见附
图1B)。用EcoRI酶切含草酸氧化酶基因的载体pSOCHiN，回收不含该基因的6.1kb片段，与含细胞膜引导肽基因pr16的质粒载体pBS的EcoRI/HindIII双酶切片段平端连接，得到中间载体pSPCHiN。质粒pSPCHiN含有pSAG12启动子，pr16引导肽基因，几丁质酶基因和tnos终止子(见附
图1C)。
1.2含草酸氧化酶基因的中间载体ApSON的构建用BamHI和XbaI双酶切载体pHGC39，回收13kb片段，补平末端，与载体pSAGOxO被XbaI和HindIII双酶切回收并补平末端的3.1kb片段连接，得到载体ApSON(见附
图1D)。
1.3器官和发育特异性表达双基因载体ApSCO的构建用XbaI和HindIII双酶切中间载体pSPCHiN，回收3.7kb片段，插入到载体ApSON的EcoRV位点中，得到重组质粒ApSCO(见附
图1E)。
实施例2以活体转化法(in planta)转化甘蓝型油菜吸取甘油冷冻保存的含有载体ApSCO的农杆菌100μl，接种于10ml新鲜的LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，PH7.0)培养基中，在28℃左右150rpm振荡培养过夜。将上述培养物10ml接种于1L含有50mg·L-1的卡那霉素的LB培养基中，在28℃左右150rpm振荡培养24小时以上，直至OD660＝1-1.5。
将培养好的农杆菌悬液在8000g下离心8分钟，沉淀后的农杆菌用1升新鲜的LB培养基重新悬浮。实验采用农杆菌悬浮液直接浸染油菜花序的方法，浸染前确保花上没有露水和泥土，然后选择那些花即将开放的分枝，并且把分枝上已经开放的花剪掉。浸染时将整个分枝浸于农杆菌悬浮液中并上下摇动1分钟左右。在确保所有花都已被浸染后，用纸袋将处理过的花序套住。
整个过程自第一次浸染后每天或隔天进行一次，共10至15次。每次浸染选择清晨和傍晚进行，以避免太阳紫外线过强使农杆菌活性降低。雨天暂停浸染。
于终花期将花序上的纸袋取下，管理好植株。待种子成熟时，将经过活体转化法处理过的分枝剪下单独收获种子，晒干后脱粒并干燥储藏。
实施例3转基因油菜植株的筛选与分子生物学鉴定3.1卡那霉素筛选活体转化法(in planta)处理种子在经过活体转化(in planta)处理的种子中选择较饱满者，用0.1％的升汞浸泡12到15分钟，然后经无菌水清洗三次后，均匀拨撒于含有卡那霉素270mg·L-1的MS固体培养基上(见Murashige T and Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobaccotissue culture.，1962，Physiologia Plantarum 15473-497)。四到五天后，萌发的幼苗中转入外源基因者具有卡那霉素抗性，可以正常存活；未转入外源基因的幼苗不具有卡那霉素抗性，子叶叶片边缘褐化，在子叶及第一片真片表面出现白斑，叶柄变紫变红，最终死掉。将存活下来的幼苗移栽至营养钵，经DNA检测确信外源基因的存在后移至土壤中。
3.2转基因油菜植株的PCR检测a)微量法提取油菜叶片总DNA取转基因植株的幼嫩叶片，放在1.5ml的Eppendof管中，加入0.2ml微量提取液。每10mlDNA微量提取液含1ml Tris-HCl(1M，PH8.0)，1ml EDTA(0.5M，PH8.0)，5ml NaCl(2M)，69.44μl新鲜的ME。用钻头将Eppendof管中叶片磨碎。再加入0.7ml微量提取液剧烈振荡，然后在冰上静置30min。在Eppendof管中加入0.5ml苯酚，上下颠倒混合后在12000rpm下离心5min，吸取2/3体积上清移置新的1.5ml Eppendof管中，再加入0.6倍体积的异丙醇，在12000rpm下离心6min，倒掉上清，待沉淀吹干后用30μl TE溶解。
b)PCR检测以提取的植株叶片总DNA为模板，根据nptII基因的表达序列设计并合成引物5’-CGTAAAGCACGAGGAAGC-3’和5’-AATGAACTCCAGGACGAGG-3’。设计PCR反应总体积为20μl，其中模板500ng，7dNTP 0.2mmol·L-1，引物浓度0.5μmol·L-1。将各组分均匀混合在9600热循环仪上进行PCR反应94℃ 3min；94℃ 1min，68℃ 1min，72℃ 2min，35个循环；72℃延伸10min4℃保存，通过凝胶电泳检测PCR扩增片段。电泳检测扩增完毕，在1×TAE缓冲液中，1％的琼脂糖凝胶，100v电压下电泳分离扩增产物。
3.3转基因植株的Southern-blot分析用SDS法大批量地提取总DNA，用碱转移法进行Southern-blot分析(见孟金陵等，用RFLP标记分析甘蓝型油菜的遗传多样性，1996，遗传学报，23(4)293-306.)3.4反转录PCR(RT-PCR)用TRIZOL(Gibco公司产品)提取RNA(方法参见Gibco公司说明书)。用反转录酶(M-MLV RTase)和RNA抑制剂(购自Promega公司)进行反转录PCR(方法参见J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，1993年，科学出版社出版)。
实施例4转基因油菜植株的抗病性鉴定4.1离体叶片接种鉴定将核盘菌在25℃黑暗条件下培养1-2天后接种叶片(离体叶片的获得与接种方法参考Zhao，Meng 2002.Genetic analysis of loci associated with partial resistance to Sclerotiniasclerotiorum in rapeseed(Brassica napus L.).Theor.Appl.Genet.)病斑直径作为抗感反应的指标。根据测得的病斑直径可以计算出各株系的病斑指数DI＝∑(ng)/(CN)×100％，g为转基因植株病斑直径，n为每单株所测病斑数或叶片数，N为所测病斑或叶片总数，C为对照病斑直径。
4.2离体花瓣接种鉴定在油菜的盛花期，每棵单株剪下一只花枝。将该花枝插在一个三角瓶内，三角瓶放在一个托盘上，等待花瓣自然脱落。将自然脱落的花瓣放在新鲜嫩绿的叶片上，然后在花瓣上接一个菌丝块，在26℃培养箱内暗培养48小时后观察。
4.3离体叶片草酸抗性鉴定在油菜生育期的大约十叶期，摘取贴近地面的无破损，无病虫害的衰老叶片(带柄)编号放入一次性塑料袋。将叶片的叶柄插在一个三角瓶内，三角瓶内盛有浓度为20mmol/L的草酸溶液，对照为水。在28℃，每天光照12小时，三天后观察性状。
离体叶片受草酸毒害的分级标准为0级，液面以上部分无病状；1级，叶柄有棕腐病斑；2～5级，棕腐病斑和枯萎面积占总叶面的比例分别为＜1/4，1/4～1/2，1/2～3/4及＞3/4。根据草酸毒害级别求草酸毒害指数TI＝∑(ng)/(5N)×100％，g为毒害级别，n为每级别中植株数或叶片数，N为植株或叶总数，5为最高级别。
本发明的效果的举例1.本实验通过活体转化方法在T0代获得99株转基因植株。对T1代的6个株系的抗性分析表明，转基因株系离体叶片接种核盘菌后的平均病斑直径为1.47±0.22cm，仅为对照的1/2，病情指数和草酸毒素指数均大幅度下降(表1)。离体花瓣接种平均病斑直径也比对照小32.4％。
表1 T1代转基因油菜植株的病情指数和草酸毒素指数比较株系编号 病情指数 病斑直 病斑直径 对照品种 毒素毒素抗性(％) 径 变异系数 病斑直径 指数变异系数(cm) (cm) (％)Z3 52.90 1.510.34 2.85 45.00 0.62Z6 50.70 1.450.25 2.85 34.50 0.68N1 51.50 1.320.27 2.57 56.00 0.64N2 61.70 1.590.33 2.57 50.00 0.58X8 48.10 1.470.13 3.06 42.50 0.34X2048.70 1.490.08 3.06 55.40 0.16平均值 52.27 1.470.22 2.83 47.20.502.外源抗病基因在转基因植株中特异性表达。转基因植株衰老叶片平均病斑直径扩展速率比幼嫩叶片小72％，接种24小时后，转基因植株衰老叶片平均病斑直径比幼嫩叶片小61.9％。所有当选转基因株系后代育性良好，表型正常。


本发明公开了一种利用RCR或限制性内切酶分离植物几丁质酶基因和草酸氧化酶基因的氨基酸编码序列和双子叶植物基因组衰老叶片特异表达的启动子序列，通过基因重组技术构建适合于在植物中表达的重组双基因的表达载体。利用活体或离体转基因方法将外源几丁质酶基因和草酸氧化酶基因导入油菜受体，获得转化植株。通过分子辅助选择并结合常规育种提高了油菜对真菌性病害的抗性，创造了一种抗病油菜新品种或创造油菜新资源材料的新方法。本发明的转基因油菜仅仅在需要抵抗病菌的特定时期和特定器官中表现抗病性，可以减轻转基因植株的能源消耗和生理扰乱。本发明也可以用于其他植物的育种上。