专利名称：成熟油菜种子次生休眠特性的化学检测方法次生休眠(secondary dormancy)特性是造成油菜种子基因扩散的重要原因。所谓次生休眠，是指原来不休眠或解除休眠后的种子由于干旱等不适宜环境条件的影响而诱发的休眠。次生休眠特性使得油菜产区地下种子库可以持续存在，地下种子一旦条件适宜便发芽长大，成为杂草和污染源。因此，次生休眠特性是油菜生产和转基因油菜环境安全评估的重要性状。油菜是世界四大油料作物之一。油菜品种的次生休眠程度到底如何、遗传多样性怎么样？发掘休眠性弱的品种，有利于防止基因扩散；选择休眠性强的品种，有利于防止收获前发芽；探明油菜次生休眠发生的原因与规律，有利于找到改变油菜休眠特性的方法。对油菜种子次生休眠特性的检测与筛选是开展上述研究工作的必要前提。我国对油菜种子次生休眠特性的研究比较薄弱，相关的检测方法更是缺乏报道。在国外，测定种子次生休眠特性的方法通常采用PEG化学诱导法(Gulden. A ThesisSubmitted to the College of Graduate Studies and Research in Partial Fulfilmentof the Requirements for the Degree of Doctor of Philosophy in the Department ofPlant Sciences University of Saskatchewan Saskatoon. 2003)。其不足之处在于实验周期很长，完成一次完整的次生休眠检测需要45-50天。在我国，油菜从田间收获脱粒至秋播仅间隔60天左右，如果采用上述检测方法，科研人员在油菜种子收获后几乎没有剩余时间开展其他研究工作。
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供成熟油菜种子次生休眠特性的快速化学检测方法。本发明提供的方案是采用两步法快速检测油菜种子的次生休眠特性。第一步是用渗透势为-17. 5 bar的PEG6000溶液在温度25° C、黑暗条件下浸泡种子7天诱导次生休眠；第二步是检测种子发芽率和生活力，具有生活力但不能发芽的种子判断为休眠种子。所述的方法包括以下步骤(I)诱导休眠用渗透势为-I. 75Mpa (-17. 5bar)的PEG6000溶液处理种子，诱导次生休眠，即取100粒成熟油菜种子放入直径9cm垫有双层滤纸的培养皿中，注入9ml -17. 5bar的PEG6000溶液浸泡，同时做4 8组平行样。将培养皿装入ー个箱子，25。C黑暗保存，诱导次生休眠；(2)检测休眠率步骤(I)完成后在500 - 600 nm緑色安全光照下将种子清洗后转移到装有9ml去离子水的培养皿中，继续在25° C黑暗条件下保存，非休眠种子将发芽；在500 - 600 nm緑色安全光照下剔除发芽的种子。所有剩下的种子清洗后再换入装有5ml去离子水的培养皿中，置于交替的光照和温度条件下(光照0/6000LX，温度3/30° C，时间12 h /12 h)处理，如果能够发芽，则属于次生休眠种子实验对照以不经次生休眠处理(用9ml水代替PEG6000)的发芽结果为对照。所述步骤(I)中PEG6000溶液在25 ° C条件下配置，渗透势为-I. 75Mpa(-17. 5bar)。所述步骤(I)中25° C黑暗保存7天。所述步骤(2)中25° C黑暗条件下保存7天；交替的光照和温度条件下(光照0/6000LX，温度 3/30。C，时间 12 h /12 h)处理 3 天。所用的油菜种子为成熟油菜的干种子。本发明与现有技术相比，其有益效果是实验周期大大缩短，完成全部检测工作仅需17天；实验结果准确、重复性好。通过本发明，已筛选出次生休眠性具有显著差异的油菜品种，为进一歩掲示油菜次生休眠发生机制提供了重要的技术支持，同时也可为其他植物种子次生休眠特性的检测提供技术參考。图I为次生休眠性特强品种，经PEG诱导后加水，只有少量的种子发芽(为非休眠种子)，剰余的大部分种子未发芽(为休眠种子)，次生休眠率达80%左右； 图2为次生休眠性特弱品种，经PEG诱导后加水，只有极少数种子未发芽(为休眠种子)，次生休眠率低于3% ； 图3为次生休眠性特强品种(作父本)与次生休眠性特弱品种(作母本)的杂交后代，经PEG诱导后加水大部分种子未发芽(为休眠种子)，次生休眠率达70%左右；
图4为次生休眠性特强品种(作母本)与次生休眠性特弱品种(作父本)的杂交后代，经PEG诱导后加水大量种子发芽(为非休眠种子)，次生休眠率仅5%左右。

对本发明的作进ー步说明。实施例I :中国油菜品种次生休眠特性的遗传多祥性
以江苏、湖北、安徽、陕西等我国主要的冬油菜产区的85个甘蓝型普通油菜品种(其中36个为常规品种，其余为杂交品种，且均为当地主栽品种)的成熟种子为材料，考察我国油菜品种次生休眠特性的遗传多祥性。(I)诱导休眠用渗透势为-I. 75Mpa (-17. 5bar)的PEG6000溶液处理种子，诱导次生休眠每个品种取100粒种子放入直径9cm垫有双层滤纸的培养皿中，注入9ml-I. 75Mpa (-17. 5bar)的PEG6000溶液浸泡；每个品种同时做4 8组平行样；将培养皿装入ー个箱子，25° C避光保存7天，诱导次生休眠。(2)检测休眠率完成后在500 - 600 nm緑色安全光照下将种子转移装有9ml去离子水的培养皿中，继续在25° C黑暗条件下保持7天，非休眠种子将发芽；在500 - 600 nm緑色安全光照下剔除发芽的种子；所有剩下的种子清洗后再换入装有5ml去离子水的培养皿中，置于交替的光照和温度条件下(光照0/6000LX，温度3/30° C，时间12 h /12 h)处理3天，如果能够发芽，则属于次生休眠种子。
实验对照以不经次生休眠处理(用9ml水代替PEG6000)的发芽结果为对照。结论我国油菜品种间次生休眠性特差异极为显著，次生休眠性特强品种的次生休眠率达80%左右，次生休眠性特弱品种的次生休眠率则低于3%。如附图I所示次生休眠性特强品种，经PEG诱导后加水，只有少量的种子发芽(为非休眠种子)，剰余的大部分种子未发芽(为休眠种子)，次生休眠率达80%左右；图2所示为次生休眠性特弱品种，经PEG诱导后加水，只有极少数种子未发芽(为休眠种子)，次生休眠率低于3%。实施例2 :次生休眠性特强、特弱品种杂交后代的次生休眠特性
选取次生休眠性特强品种和次生休眠性特弱品种作亲本，分别配置正反交组合，检测 次生休眠差异品种杂交后代成熟种子的休眠特性表现。(I)诱导休眠用渗透势为-I. 75Mpa (-17. 5bar)的PEG6000溶液处理种子，诱导次生休眠每个杂交后代取100粒成熟种子放入直径9cm垫有双层滤纸的培养皿中，注入9ml -I. 75Mpa (-17. 5bar)的PEG6000溶液浸泡，每个杂交后代同时做4 8组平行样；将培养皿装入ー个箱子，25° C避光保存I天，诱导次生休眠。(2)检测休眠率完成后在500 - 600 nm绿色安全光照下将种子转移装有9ml去离子水的培养皿中，继续在25° C黑暗条件下保持7天，非休眠种子将发芽。在500 - 600nm緑色安全光照下剔除发芽的种子。所有剩下的种子清洗后再换入装有5ml去离子水的培养皿中，置于交替的光照和温度条件下(光照0/6000LX，温度3/30° C，时间12 h /12 h)处理3天，如果能够发芽，则属于次生休眠种子。实验对照以不经次生休眠处理(用9ml水代替PEG6000)的发芽结果为对照。结论次生休眠性特强品种(作父本)与次生休眠性特弱品种(作母本)的杂交后代，次生休眠率达70%左右；次生休眠性特强品种(作母本)与次生休眠性特弱品种(作父本)的杂交后代，次生休眠率仅5%左右。如附图3所示为次生休眠性特强品种(作父本)与次生休眠性特弱品种(作母本)的杂交后代，经PEG诱导后加水大部分种子未发芽(为休眠种子)，次生休眠率达70%左右；图4为次生休眠性特强品种(作母本)与次生休眠性特弱品种(作父本)的杂交后代，经PEG诱导后加水大量种子发芽(为非休眠种子)，次生休眠率仅5%左右。


本发明公开一种成熟油菜种子次生休眠特性的化学检测方法，所述的方法包括以下步骤第一步是用渗透势为-17.5bar的PEG6000溶液在温度25°C、黑暗条件下浸泡种子7天诱导次生休眠；第二步是检测种子发芽率和生活力，具有生活力但不能发芽的种子判断为休眠种子。本发明完成一次完整的次生休眠检测仅17天，且获得的实验结果准确、重复性好，从而解决了油菜次生休眠化学检测周期较长的难题，为进一步揭示油菜次生休眠的发生机制提供了重要的技术支持，同时也可为其他植物种子次生休眠检测提供技术参考。