专利名称：一种通过共培养制备五倍子酸的方法 酶是活体组织的起生物催化剂作用的特异性蛋白质。酶在正常温度和压力下就能够完成那些在高温和/或高压下需要高代价的能源才能完成或根本无法完成的反应。也就是说，酶在工业上的用途正在日益增多。多种微生物产生胞外酶。它们主要是水解酶并且主要与大分子被降解成能够被活细胞所摄取的单元的过程有关。由于微生物被广泛用于酶的生产中，所以正在不断地探索多种重要工业化学品的新型制备方法。生物技术领域中的新发展产生了微生物酶的新用途。除了在食品业和发酵业中的传统用途外，微生物酶在涉及有机溶剂介质特殊生物活性化合物的生物转化中起着重要的作用。随着微生物在生产生物质和微生物代谢物中的应用，微生物细胞也可被用来催化化合物向更贵重化合物的转化。微生物方法比使用化学试剂具有特异性方面以及在相对低压和低温下操作方面的优势。具有各种工业用途的重要酶是鞣酶(单宁酰基水解酶)，其为一种属于水解酶类的胞外酶。单宁是分子量为500-3000的水溶性酚类化合物，其具有与蛋白质、纤维素、明胶和果胶结合的特性而且按照它们的构型可被分成两个不同的类别，即水解鞣酸类和缩合鞣酸类。鞣酶被广泛用于食品和化学工业。而且，鞣酶还被用于制酒过程，在该过程中，鞣酶水解绿原酸和奎尼酸，从而改善制酒过程中的味道。鞣酶还具有制造浆栎果酒的潜力。鞣酶还可与乳糖酶一起用来处理葡萄汁和未发酵葡萄汁以便去除酚类物质从而使饮料稳定。鞣酶明显降低了冷藏引起的啤酒混浊度。通过采用鞣酶对麦芽汁酚醛进行酶水解可以避免啤酒贮藏过程中出现的褪色和混浊现象。而且，在速溶茶的生产中鞣酶还被用于鲜绿茶嫩芽的预转化处理。鞣酶还被用于天然存在的五倍子酸酯的结构测定。通常被称作鞣酶的单宁酰基水解酶催化水解鞣酸类如单宁酸中的酯和缩酚酸键的水解，从而释放出葡萄糖和五倍子酸。五倍子酸(3，4，5-三羟基苯甲酸)具有多种用途。在制药业中，五倍子酸被用于制造三甲氧苄二氨嘧啶。它是一种抗菌剂并且与磺胺联合用药从而为医疗提供了广谱作用。TMP抑制二氢叶酸还原酶从而阻断二氢叶酸向四氢叶酸的转化。五倍子酸在制造三甲氧苄二氨嘧啶过程中的消耗系数是4.8。在制革业中，五倍子酸被用于鞣酸类的均化，以便制备出高级的皮革鞣酸类。五倍子酸还被用于普通墨水和染剂如照相显影剂的制造。还发现在酶合成五倍子酸酯如棓酸丙酯中的用途，五倍子酸酯主要被用作脂肪和油以及饮料中的抗氧化剂。五倍子酸被用于无机酸、二羟丙酮和生物碱的检测中和作为生产连苯三酚的合成中间体，所述连苯三酚被用于毛皮、皮革、头发等的染色。
用于生产鞣酶的各种真菌菌种在本技术领域中是已知的。据报道包括细菌(短小芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、棒杆菌属菌种、肺炎克雷伯氏菌)、真菌(壳二孢属、青霉属)和酵母菌(假丝酵母属)在内的许多微生物都能产生鞣酶。
Tourrat等报道了由一株黑曲霉菌来生产鞣酶。他们发现当在恒定空气流的条件下进行浸没培养发酵时鞣酶的活性达到最大值。通过气体图表法测定了酶活性而且据报道最大酶活性为5.5n Kat/ml。
R.Banerjee等报道了最新分离的米根霉生物合成鞣酶的活性。使摇瓶培养的实验条件最佳化。测得的最大酶活性为6.12U/ml。
R.Banerjee等还报道了利用米根霉通过固态发酵生产鞣酶。
Deschamp等报道了通过对细菌菌株(多粘芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、肺炎克雷伯氏菌和棒杆菌属)进行几个小时的培养来生产胞外鞣酶，同时释放出五倍子酸和葡萄糖。
Raj Kumar等报道了产黄青霉鞣酶的分离、纯化和某些特性。
在高达30℃和4.0-6.0的pH范围内所述酶都是稳定的。以单宁酸为底物测得的Km值为0.48×10-4M。20mM的金属盐抑制酶活性。
从Yamada等那得知在生物反应器中利用固定在藻酸钠和CaCl2上的产黄青霉由刺云实单宁连续生产五倍子酸。他们还报道了鞣酶在制酒业中的用途。
对单宁向五倍子酸的生物转化了解得还不多。可得到的文献主要涉及其中五倍子酸产率非常低的化学方法。Kar，B等报道了以倍子种皮和米根霉作为原材料通过SSF和SmF方法将鞣酸类生物转化成五倍子酸的方法。
然而，现有技术的方法具有种种缺点，即需要较长的时间而且所报道的产率也非常低。
发明目的因此本发明的目的是提供一种利用混合培养法制备五倍子酸的方法，该方法与传统技术相比所需要的时间较少。
本发明的另一个目的是提供一种利用混合培养技术制备五倍子酸的方法，该方法的产率较高并且采用了新的底物。


本发明提供了一种通过共培养制备五倍子酸的方法，该方法包括提供在液体中互相交换的富含单宁的混合底物和培养基，向底物中加入含有真菌米根霉和臭曲霉的诱导接种物以便获得发酵物质和五倍子酸，用有机溶剂从培养基和发酵物质中提取五倍子酸，然后蒸发掉有机溶剂从而得到五倍子酸。
根据本发明，被用作混合底物的原料是组成比为1∶3至3∶1的诃子果粉(诃子，无籽类型，PUNJAB变种)和倍子种皮粉(Caesalpiniadigyna)。这些原料是富含单宁的底物。诃子种子含有33-45％的单宁而倍子种皮含有约58％的单宁。从IIT，Kharagpur校园的土壤中分离出的丝状真菌米根霉(RO IIT RB13，NRRL-21498)和臭曲霉(GMRB013)的两株菌已被使用。将所述微生物保存在2％的麦芽提取物琼脂斜面培养基上。在斜面培养基上对所述微生物进行传代培养。对麦芽提取物琼脂(MEA)培养基进行灭菌并将其部分转移到无菌试管中并以形成斜面的位置使之冷却。
凝固后，在无菌斜面上接种米根霉(RO IIT RB13，NRRL-21498)和臭曲霉(GMRB013，MTCC3557)的纯培养物后保存在培养箱中。斜面培养物后来被用于进一步的操作或保存。因为鞣酶是一种适应酶，所以需制备一种前诱导接种物，制备步骤包括对改良的Czapekdox培养基中的单宁酸进行灭菌并用由斜面培养物制备的孢子悬浮液进行接种。然后将它们放置在震荡BOD培养箱中来制备诱导接种物。将这种诱导接种物用于后来对MSSF(改进的固态发酵法)的研究。
以0.5∶2至1∶1的微生物配比，其中最佳配比为1∶1联合使用所述的两种微生物。通常发现，在实施共培养技术的过程中，所产生的鞣酶和五倍子酸比在纯培养条件下的产量高，而且所需的培养周期也缩短了。
在改进的盘式反应器中采用改进的固态发酵法进行分批发酵。被用作混合底物的原料是组成比为1∶3至3∶1的诃子果粉和倍子种皮粉。该底物混合物被放置在盘式反应器的浮板上。常用的盘式反应器通过设置带孔浮板而得到改进。这一改进提供了一个独特的优势，就是促进了发酵过程中的散热从而避免了生物质的变性。以0.2∶1至0.8∶1(固体-液体比例)的配比从盘中的浮板底下抽取液体改良Czapekdox培养基。Czapekdox培养基是通过以单宁酸代替葡萄糖作为碳水化合物源来进行改良的。因此，放置在浮板上的混合底物与盘中的液体培养基接触。然后对改进的盘式反应器进行高压灭菌。通过添加适量的米根霉和臭曲霉的诱导接种物对浮板上的底物进行发酵，即通过共培养方法，将约1×105至2×108个孢子/ml，优选地2×106个孢子/ml添加到20gms的底物中。添加到底物中的微生物将底物转化成所需产物，该产物沥滤到液体培养基中。取出发酵物质，添加水并进行加热。然后将其冷却到室温并利用有机溶剂如乙醚和乙酸乙酯萃取五倍子酸。
已经对生产五倍子酸的最佳pH、温度、湿度和接种量的影响、粒径和含水量进行了评估。
本发明将借助下列非限制性实施例得到更详细的解释。
实施例产鞣酶微生物的分离利用饵诱技术从I.I.T.，Kharagpur校园的土壤中分离出两株丝状真菌米根霉(RO IIT RB13，NRRL-21498)和臭曲霉(GMRB013)。在2％的麦芽提取物琼脂斜面上保存所分离的微生物。
在斜面上微生物的传代将100ml的麦芽提取物琼脂(MEA)培养基灭菌。灭菌后，将其中的5ml转移到无菌试管中并以形成斜面的位置进行冷却。凝固后，在无菌斜面上以1∶1的比例划线接种米根霉(RO IIT RB13，NRRL-21498)和臭曲霉(GMRB013)并在30℃的培养箱中培养72-96小时。
然后将斜面培养基用于进一步的操作或保存在4℃的冰箱中。
诱导接种物的制备由于鞣酶是一种适应酶，所以需要制备前诱导接种物。将50ml的含有2％单宁酸的Czapekdox培养基置于100ml的锥形瓶中。然后在121℃下灭菌15分钟并置于用由培养斜面制备的2ml孢子悬浮液进行接种。然后在30℃的BOD培养箱中振荡培养72小时。将该诱导接种物用于对SSF的进一步研究。
利用混合底物通过共培养方法进行改进的固态发酵在改进的盘式反应器中利用改进的固态发酵法进行分批发酵。
被用作混合底物的原料中的诃子种子粉(诃子)与倍子种皮粉(Caesalpinia digyna)的比例为1∶3至3∶1。将该底物混合物放置在盘式反应器的浮板上。以0.2∶1至0.8∶1的比例(固-液比)从盘中的浮板下抽取液体Czapek dox培养基。将这种装有底物的浮板放置在盘中的液体上面以便进行改进的固态发酵。因此，被放置在浮板上的混合底物与盘中的液体培养基接触。然后在121℃下将所述改进的盘式反应器高压灭菌15分钟。通过向每20gms的底物中加入2×106个孢子/ml的米根霉和臭曲霉诱导接种物即通过共培养方法对浮板上的底物进行发酵。被添加到底物中的微生物将底物转化成所需产物，该产物沥滤到液体培养基中。
五倍子酸的提取利用有机溶剂乙酸乙酯来分离五倍子酸。取出发酵物质，加入水，并加热到约60-70℃，因为五倍子酸在该温度下是可溶的而在冷水中不溶。然后将其冷却到室温。然后将有机溶剂加到其中并利用分离漏斗得到全部混合物。通过剧烈振荡立即将该混合物充分混合。可溶于有机溶剂的五倍子酸进入有机相中而其余物质保留在水相中。弃掉水相并收集有机层。该过程一直继续到五倍子酸被全部提取到有机层中。现在取出所收集的有机层用于在旋转真空蒸发器中从乙酸乙酯中分离出五倍子酸。进行分离的压力和温度分别是200毫巴和70℃。或者，采用乙醚萃取乙酸乙酯层，然后在旋转蒸发器中蒸发掉乙醚层从而获得纯五倍子酸。测得五倍子酸的得率范围是65.4至94.8％。为了获得最大的五倍子酸产量而对各种环境参数的最佳化进行了研究。
通过改进固态发酵法生产鞣酶和五倍子酸的物理化学参数的最佳化研究了利用两种微生物和混合底物在纯培养和共培养条件下进行MSSF时的各种环境参数对鞣酶和五倍子酸产量的影响pH的影响研究pH对鞣酶产量的影响是通过将Czapekdox培养基的初始pH从3.5变到7.0来进行的。测得的最佳pH是5，在该pH下鞣酶的活性是35.1U/ml并且所生产的五倍子酸是91.81％。
温度的影响研究温度对鞣酶和五倍子酸产量的影响是通过将湿润箱中的温度从25℃变到40℃来进行的，其中测得最佳温度为30℃。鞣酸和五倍子酸的产量分别是36.4U/ml和93.25％。
湿度的影响研究湿度对鞣酶产量和五倍子酸的百分得率的影响是通过将湿润室中的湿度从70％变到90％来进行的，其中最佳值为80％。鞣酶和五倍子酸的产量分别是36.4U/ml和93.25％。
接种量的影响实现最大鞣酶产量所需的最佳接种量是通过将接种量从1ml变到4ml后获得的，最佳接种量为3ml。
含水量的影响为了研究含水量对鞣酶产量的影响，将Czapekdox培养基向诃子底物中的添加比例从0.2∶1变到0.8∶1，其中最佳比例落到0.4∶1。在该含水量的条件下所产生的鞣酶和五倍子酸分别是35.3U/ml和92.41％。发现48小时的培养周期是利用混合底物通过共培养法生产五倍子酸的最佳培养周期，得到的鞣酶活性为33.1U/ml。
纯培养法和共培养法之间的比较试验表明共培养法具有下列表1中所示的优势。
条件纯培养纯培养 共培养利用米根霉与单利用臭曲霉与单 利用米根霉&臭曲一底物一底物 霉与混合底物(诃子)(诃子)1)温度 (25-40)℃ (25-40)℃(25-40)℃2)pH3.5-7 3.5-7 3.5-73)湿度 (70-90)％ (70-90)％ (70-90)％4)培养周期 24-96小时 24-96小时 24-96小时5)含水量(固-液 1∶0.25-1∶1.51∶0.25-1∶1.50.2∶1-8∶1比)6)反应器类型盘式 盘式 改进的盘式7)五倍子酸 44-87.67％51.19-92.45％ 65.42-94％


一种通过共培养制备五倍子酸的方法，该方法包括提供在液体中互相交换的富含单宁的混合底物和培养基，向底物中加入含有真菌米根霉和臭曲霉的诱导接种物以便获得发酵物质和五倍子酸，利用有机溶剂从培养基和发酵物质中提取五倍子酸，然后蒸发掉有机溶剂从而得到五倍子酸。