专利名称：一种含金纹细蛾几丁质酶基因重组质粒的构建和应用的制作方法几丁质(chitin)又称甲壳素、壳多糖，是通过β-1，4-糖苷键连接成不分支的 N-乙酞氨基葡萄糖胺的同聚物，它是自然界中许多生物的结构性组分，主要存在于无脊椎动物、藻类、真菌等生物体中。昆虫几丁质是昆虫表皮和围食膜的重要组成成分，在昆虫生长、发育的各个时期都需要一定量的几丁质。昆虫几丁质酶是一种参与昆虫几丁质代谢的重要内切型蛋白酶，它通过破坏几丁质的β-1，4-糖苷键初步将几丁质降解成低分子量的寡聚物。昆虫的几丁质酶存在于中肠、蜕皮腺及某些昆虫(如蜜蜂)的毒腺中，在昆虫的消化、变态、侵染等生理活动中的发挥着重要的作用。在昆虫的整个生命周期中，往往不只表达一种几丁质酶基因，有的多达18种几丁质酶类似基因。不同的几丁质酶基因在昆虫不同的生命阶段发挥着相应的功能。利用 southern杂交、RT-PCR等技术对多种昆虫几丁质酶基因的时空表达进行系统研究，结果表明I型几丁质酶基因在昆虫整个生长发育阶段都有一定水平的表达，是昆虫体内最重要、 最基本一种几丁质酶。I型几丁质酶基因也是目前研究得最为深入、广泛的一类几丁质酶基因，迄今为止，已从鳞翅目、双翅目、鞘翅目昆虫中发现并报道了 50余种I型几丁质酶基因。 昆虫I型几丁质酶的分子量在45 85kD之间，酶的活性范围在pH 4. 0 8. 0之间，等电点在5. 0 7. 0之间，大多属于18家族几丁质酶，其蛋白质由4个结构域组成N端信号肽、 催化区、连接区和几丁质结合区，在催化区和结合区各有一段保守氨基酸序列，是克隆基因时设计引物的重要依据。不同种类的昆虫其I型几丁质酶基因的结构特点基本相同，以最先发现的烟草天蛾I型几丁质酶基因为例说明该基因全长M52bp，包含一个1662bp的开放阅读框，编码5M个氨基酸，由烟草天蛾基因组中的11个外显子和9个内含子转录而来。由于昆虫几丁质酶在昆虫各项生理活动中的重要作用，将其纳入到害虫防治上成为近几年各国学者的研究热点。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种被广泛认可和使用的微生物杀虫剂，Arora等报道，几丁质酶Chi36的加入使得Bt对斜纹夜蛾幼虫的半致死浓度降低了 30% ；杆状病毒是昆虫专一性的病原微生物，在农业害虫的防治中有很大的应用前景，范晓军等用重组有东亚钳蝎昆虫神经毒素基因和烟草天蛾几丁质酶基因的双价重组苜蓿银纹夜蛾杆状病毒和野生型杆状病毒分别感染中国棉铃虫，结果表明重组病毒的半致死浓度比野生型病毒明显减小；昆虫几丁质酶基因在转基因植物中的组成型表达也获得了较好的防治害虫效果，Gatehous等将昆虫几丁质酶基因转入马铃薯中表达，获得的转基因马铃薯增强了对蚜虫的抗性。Ding等对来源于烟草天蛾、细菌、放线菌和植物的4种几丁质酶转基因烟草进行试验，均以1 % 2 %的浓度加入到新生的甲虫幼虫食物中，结果发现来源于细菌和植物的几丁质酶转基因烟草对幼虫的成活率及生长情况没有产生明显的影响，而取食了含昆虫几丁质酶转基因烟草食物的幼虫在卵孵化后的几天内死亡。这说明昆虫几丁质酶对增强植物抗虫效果更为有效。张宏斌等人分别在家蚕和棉铃虫体内提取几丁质酶，在其最适条件下，和酵母、青霉菌一起在LB固体培养基上培养，抑菌圈实验表明几丁质酶对这种真菌的生长有明显抑制作用。这些研究表明昆虫几丁质酶对害虫和真菌的抑制的确有一定的效果。昆虫和一些病原真菌的外壳作为物理化学屏障来抵抗不良环境和捕食者，其主要由几丁质和蛋白质组成，将昆虫几丁质酶应用于害虫防治和真菌防治中，利用几丁质酶来分解昆虫的外壳、真菌细胞壁等含几丁质的组织来抑制其正常的生理活动，是一种安全、有效、可行的新型生物防治策略。
本发明提供一种LrCHI基因克隆和重组原核表达质粒pRSET-LrCHI的构建方法， LrCHI为金纹细蛾几丁质酶基因。本发明克隆得到的金纹细蛾几丁质酶基因LrCHI是一种未知基因，其开放阅读框由1737bp组成，编码578个氨基酸，预测分子量为64. 4kDa,等电点pi为5. 49，其序列是 SEQ ID NO :1，应用NCBI上的Blast进行同源性分析，结果显示与鳞翅目昆虫几丁质酶基因序列之间同源性较高，均超过75%。该基因为本发明人首次发现并报道，同时也是金纹细蛾的首个报道的基因。本发明提供一种金纹细蛾几丁质酶基因(LrCHI)的重组质粒载体pRSET-LrCHI， 它包含pRSET载体片段和金纹细蛾几丁质酶基因(LrCHI)SEQ ID NO :1。所述的重组质粒中的质粒片段pRSET是一种原核表达载体，由PUC质粒改造而来， 其包含的主要元件为=LrCHI与pRSET重组的多克隆位点；在IPTG的诱导下可高效表达外源基因LrCHI的T7启动子；或便于后续的蛋白纯化的6XHis ；或有利于重组子的筛选的氨苄青霉素抗性基因。本发明所述的重组质粒PRSET-LrCHI中，金纹细蛾几丁质酶基因LrCHI 和质粒片段PRSET都有xho I和hindIII酶切位点。本发明提供一种金纹细蛾几丁质酶基因(LrCHI)的重组质粒载体pRSET-LrCHI， 其外源基因金纹细蛾几丁质酶基因(LrCHI)插入到载体pRSET的多克隆位点后，置于其T7 启动子下。本发明提供一种金纹细蛾几丁质酶基因(LrCHI)的重组质粒载体pRSET-LrCHI， 其重组质粒含氨苄青霉素抗性基因和6XHis蛋白标签序列。本发明提供一种构建重组质粒载体pRSET-LrCHI的方法，包括以下步骤(1)、取预蛹期金纹细蛾中肠，提取中肠总RNA ；(2)、金纹细蛾几丁质酶基因(LrCHI)SEQ ID NO=I的克隆；(3)、将质粒载体pRSET与步骤2获得的含SEQ ID NO=I的PCR产物酶切后连接。本发明提供一种构建重组质粒载体pRSET-LrCHI的方法，利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)从金纹细蛾体内扩增得到了金纹细蛾几丁质酶基因(LrCHI)SEQ ID N0:1，并将其连接到质粒PRSET上，构建含金纹细蛾几丁质酶基因(LrCHI)的原核表达载体。上述步骤还包括步骤4即对重组质粒进行酶切、PCR、测序鉴定。本发明提供构建重组质粒载体pRSET-LrCHI的方法中，步骤1的金纹细蛾为实验室人工饲养，饲料配方为玉米面300g，豆饼粉100g，酵母粉100g，维生素C IOg,复合维生素Bi. 5g，山梨酸1. 5g，柠檬酸2. 5g，丙酸5ml，琼脂粉25g，水1300ml。饲养至预蛹期的金纹细蛾取幼虫中肠备用。步骤1的中肠总RNA的提取方法包括将新鲜组织研磨成勻浆、离心、静置，用溶剂进行分离。具体为离心管中分别加入氯仿后离心，取上清液再分别加入异丙醇，静置离心， 弃去上清液，再加入乙醇，离心，弃去上清夜，沉淀中加入50 μ IDEPC灭菌水，用枪头吸打混勻，65°C水浴加热10分钟，保存于液氮中。目前克隆一个未知基因的方法有很多，诸如RNA指纹技术、cDNA文库删选、cDNA末端快速扩张技术(RACE)等，本发明采用的是RACE来克隆LrCHI，RACE技术主要由以下几步组成RNA的提取和反转录合成cDNA ；根据相对保守的氨基酸序列设计兼并引物克隆保守区之间的片段；依据得到的保守序列设计多条3’和5’ RACE引物，利用3’和5’ RACE方法分别克隆出基因的3’端和5’端。本发明提供构建重组质粒载体pRSET-LrCHI的方法中，步骤2)的具体方法是预蛹期取金纹细蛾中肠，提取中肠总RNA ；以mRNA为底物，合成cDNA —链；以cDNA —链为模板，用PCR技术扩增金纹细蛾几丁质酶基因(LrCHI)；用带有Bio I和HindIII酶切位点的引物扩增金纹细蛾几丁质酶基因(LrCHI)全长。本发明提供构建重组质粒载体pRSET-LrCHI的方法中，根据相对保守的氨基酸序列设计兼并引物克隆保守区之间的片段；依据得到的保守序列设计多条3’和5’RACE引物， 利用3’和5’ RACE方法分别克隆出基因的3’端和5’端。步骤2的金纹细蛾几丁质酶基因(LrCHI)SEQID NO 1的克隆分为保守域、3’端和5’端三个部分分别先后克隆，保守域扩增使用的兼并引物为SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3，3，端克隆使用的反转录引物为SEQ ID NO :4，3，端克隆使用的PCR扩增引物为SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6，5，端克隆使用的反转录引物为SEQ ID NO :7，5’端克隆使用的PCR扩增引物为SEQ ID NO 8禾P SEQ ID NO :9。本发明提供构建重组质粒载体pRSET-LrCHI的方法中，步骤3采用Bio I.Hindlll 对质粒和PCR产物片段进行双酶切。本发明通过下述步骤构建并表达重组质粒pRSET-LrCHI (1)、金纹细蛾的饲养；(2)、预蛹期取金纹细蛾中肠，提取中肠总RNA ；(3)、以mRNA为底物，合成cDNA —链；(4)、以cDNA —链为模板，用PCR技术扩增金纹细蛾几丁质酶基因；(5)、用带有Β ο I和HindIII酶切位点的引物扩增LrCHI全长；(6)、用Xho I和HindIII双酶切质粒pRSET和LrCHI全长，连接两个酶切片段；(7)、对重组质粒进行酶切、PCR、测序鉴定；(8)、原核表达 pRSET-LrCHI。本发明提供的金纹细蛾几丁质酶基因(LrCHI)可应用于降解几丁质来完成昆虫消化、变态、侵染生理功能中。本发明提供的金纹细蛾几丁质酶基因(LrCHI)可应用于抑制真菌。本发明提供的金纹细蛾几丁质酶基因(LrCHI)可应用于抑制青霉菌。本发明构建的重组质粒pRSET-LrCHI可成功表达，并应用于降解几丁质来完成昆虫消化、变态、侵染生理功能中。本发明构建的重组质粒pRSET-LrCHI可应用于抑制真菌。本发明构建的重组质粒pRSET-LrCHI可应用于抑制青霉菌。本发明所述重组质粒pRSET-LrCHI主要应用于真菌的抑制，pRSET-LrCHI在大肠杆菌中表达出几丁质酶后，将其进行青霉菌生长抑制实验，研究抑菌效果。为实现上述目的，本发明采用下述技术方案1、转化大肠杆菌B21。2、IPTG 诱导下表达 LrCHI。3、检测蛋白粗提液对青霉菌的抑制效果。图1为重组质粒pRSET-LrCHI图谱图2为预蛹期金纹细蛾幼虫虫态图3为PCR产物琼脂糖凝胶电泳4为酶切检测琼脂糖凝胶电泳5IPTG诱导pRSET-LrCHI的表达结果图6表达产物对青霉菌的生长抑制效果图Oligo dTΙμΙRNA2μΙH2O6μΙ2xTs bufferΙΟμΙEnzyme MixΙμΙ反应条件为42°C孵育45min后85 °C使蛋白质变性5min。实施例4几丁质酶基因的克隆及结构分析目前克隆一个未知基因的方法有很多，诸如RNA指纹技术、cDNA文库删选、cDNA末端快速扩张技术(RACE)等，本发明采用的是RACE来克隆LrCHI，RACE技术主要由以下几步组成RNA的提取和反转录合成cDNA ；根据相对保守的氨基酸序列设计兼并引物克隆保守区之间的片段；依据得到的保守序列设计多条3’和5’ RACE引物，利用3’和5’ RACE方法分别克隆出基因的3’端和5’端。1)保守域的扩增通过对已发表公布的几十种昆虫几丁质酶氨基酸序列进行同源性分析，结果表明在其序列内部存在两段高度保守的序列，YDFDGLDLDffEYP和GAMTWAIDMD，依此设计兼并引物 5，-GGMTGGGARCTGACTGCTGC-3，(SEQ ID NO 2)和 5，-CCTTGTARGCGTAGGGGCAYTTGCC-3，( SEQ ID NO 3)，并以反转录而成的cDNA为底物PCR扩增金纹细蛾几丁质酶的保守域，电泳结果如图3的1泳道所示，得到了大约450bp的片段。2)3，端扩增根据真核生物mRNA所特有的poly(A)结构，设计含一段已知序列的接头引物5’_TGGAGACCAGCGTTTCTGAGATTC (T) 18-3‘ (SEQ ID NO 4)作为反转录引物，再根据已获得的保守域序列设计3’race的上游引物CCACGTACCTGATCTTTGCCAGGAGC (SEQ ID NO :5)，利用下游接头引物 5，-TGGAGACCAGCGTTTCTGAGATTC-3，(SEQ ID NO :6) PCR 扩增几丁质酶基因的 3 端。 扩增结果见图3的2泳道。3)5，端扩增因为已经得到了 LrCHI的3’端序列，可依此设计特异引物 5，-TCCTTGATCCAGTTCATCTTG (SEQ ID NO :7)ATCT_3，作为 5，端扩增的反转录引物，不难发现该引物的A/T含量较高，使得其在反转录的温度条件下易于与模板结合。由于真核生物 mRNA的5’端没有寡聚尾，因此5’ race的扩增需要在其cDNA的3’端人为地加上一段同聚核苷酸尾，在此基础上进行扩增其5’端扩增。本发明实施过程中是对纯化后金纹细蛾的 cDNA进行同聚胞嘧啶加尾，再以上游接头引物5，-TGGAGACCAGCGTTTCTGAGATTC (G) 10-3，(SE Q ID NO 8)和下游依据保守序列设计的特异引物5’-GGTGTACGGAGCAGGATCGCCACC-3’ (SEQ ID NO 9)进行PCR扩增，得到金纹细蛾几丁质酶基因的5’端。扩增结果见图3的3泳道。4)结构分析对实施例4中的基因序列拼接后获得SEQ ID NO 1 (LrCHI)的序列全长，由1737bp 组成，编码578个氨基酸，预测其蛋白质的分子量和等电点分别为64. 2kDa、5. 42。利用NCBI 中的blast程序对本发明中发现的LrCHI进行同源相似性分析，结果显示其核酸序列与其他昆虫几丁质酶的同源性较高(均在75%以上)，与棉铃虫几丁质酶基因的同源性更是高达98 %，这说明本发明的确是克隆得到了一种新的昆虫几丁质酶序列。 实施例5重组质粒pRSET-LrCHI的构建1、PCR扩展全长以cDNA为底物，用带有酶切位点)(ho KHindIII的引物扩增LrCHI全长。PCR条件为
95 "C3min95 "C30s η55 "C40s72 "C2mirJ72 "CIOmn2、双酶切、连接及转化用购买于生工生物工程有限公司的Sanpr印质粒小量抽提试剂盒提取质粒 pRSET，具体操作步骤参见其生产说明书。用限制性内切酶)(ho I,HindIII酶切质粒pRSET 及PCR扩增产物LrCHI全长，酶切条件为25°C水浴30min。用DNA纯化试剂盒对酶切产物进行纯化，具体步骤参见Omega公司Microelute cycle-pure kit试剂盒说明书。将酶切、纯化后的质粒和PCR片段用T4连接酶进行连接，连接体系为20ul 质粒片段 Iul，PCR 产物片段;3ul，buffer 2ul，T4 连接酶 lul，dH20 13ul。22°C连接 1 小时。取5ul的连接体系，加到50ul的感受态T细胞中，42°C热激30s后立即冰浴aiiin， 加入LB营养液后37°C、200rpm孵育一小时。取200ul的菌液均勻地途到含X_gal、IPTG、 Ampr的固体培养基上，培养过夜。挑取白色重组子进行鉴定。
3、阳性重组子的鉴定对重组质粒进行Β ο I、HindIII双酶切鉴定，结果见图4对重组质粒进行PCR鉴定，结果见图3的4泳道将重组质粒送到生工生物工程有限公司北京测序部进行测序，以确保LrCHI以正确、完整的序列方向插入到PRSET的T7启动子下面。实施例6重组质粒PRSET-LrCHI在BL21中的表达1、pRSET-LrCHI 转化 BL21从_70°C中取出50ulBL21感受态(BL21感受态的制备参见经典分子生物学操作)，将5ul的重组质粒pRSET-LrCHI加入，轻弹混勻，冰浴25min，42°C热激30s，立即置于冰上2min，加250 μ L平衡至室温的LB液体培养基，200转/min，37°C孵育1小时，取IOOul 菌液均勻地涂于含50ug/ulAmp的平板上，37°C正放30min后倒置过夜培养。2、IPTG 诱导下表达 LrCHI在上述步骤下挑取单菌落至LB中，200转/min 37 °C下孵育至0D600 = 0. 4-0. 6。 取Iml的菌液作为空白对照保存于-20°C，往剩余的菌液中加入终浓度为ImM的IPTG，诱导表达4小时。将对照组和经IPTG诱导后的菌液在4000rpm下离心5min，弃掉上清，在菌体沉淀中加入IOOul的Tris-HCL buffer，使用超声波破碎仪对菌体进行破碎，13000rpm/min 离心lOmin，分离上清和沉淀，在沉淀中加入500ul的尿素使其溶解。分别取25ul上清和尿素溶解的沉淀与5ul的6X SDS混合，沸水浴变性lOmin，瞬间离心，取15ul的样品进行 SDS-PAGE凝胶电泳。电泳结果见图5，从图中可看出大肠杆菌表达了大约65kDa的目的蛋白。实施例7抑菌效果的检测取三个8 X 6 X IOmm的空心圆柱体，轻轻固定到固体培养基上，往三个圆柱体中分别加入IOOul无菌水、IOOul含LrCHI原核表达的上清液、IOOul的大肠杆菌破碎液，最后再往圆柱体中分别加入IOOul的青霉菌(0D = 0. 3)，37°C恒温培养20小时。实验结果显示青霉菌在含LrCHI原核表达的上清液中的生长菌圈的直径约为0. 8cm，而在菌液中只加入无菌水对照组的菌圈直径达1. 5cm，加入大肠杆菌破碎液对照组的菌圈直径也约为1. 5cm，青霉菌在含LrCHI原核表达的上清液中的生长相对于其他两种环境明显受到抑制，这一结果表明大肠杆菌的破碎液对青霉菌的生长没有显著的影响，而原核表达的LrCHI则可以抑制青霉菌的生长，原因可能是LrCHI催化水解了青霉菌细胞壁上的几丁质，破坏了其正常的生理结构，结果见图6。


本发明涉及一种新的金纹细蛾几丁质酶基因LrCHI，涉及昆虫几丁质酶基因的重组质粒载体及其构建和应用。金纹细蛾几丁质酶基因(LrCHI)可以抑制真菌，pRSET-LrCHI可以降解几丁质来完成其消化、变态、侵染等生理功能。