专利名称：氨氯地平和阿托伐他汀的协同作用的制作方法冠状动脉疾病(CAD)是发达世界中死亡率的主要原因，也有相当高的发病率。通常，CAD患者有若干种伴发病况，包括高血压、糖尿病和异常脂血症，这增加了产生不良结果的总体危险并使治疗复杂化。在抗高血压治疗中，亲脂性二氢吡啶型钙通道阻滞剂(CCB)氨氯地平磺酸盐(AML)是一种容许限度非常好的具有确定的安全性和有效性记录的用于治疗高血压和心绞痛的药剂。最近，在Norvasc?(AML)血管作用试验的远景随机化评估(PREVENT)中显示了AML在对CAD患者的治疗中的潜在治疗作用。该三年期试验以安慰剂作对照评估了AML对确诊的CAD患者的冠状动脉和颈动脉中的动脉粥样硬化损害的发生和进展的作用(Byington RP，Miller ME，Herrington D等，“Norvasc血管作用试验的远景随机化评估(PREVENT)的基本原理、设计和基准特征”，《美国心脏病学杂志》1997；801087-1090)。PREVENT结果显示了AML治疗的令人印象深刻的临床益处，包括主要的确诊发病或过程总共减少了30％(Byington RP，Chen J，Furberg CD，Pitt B，“氨氯地平对心血管发病和过程的作用”，《美国心脏病学会志》1999；33314A)。AML治疗还与颈动脉粥样硬化进展的明显减慢有关，如利用B-模式超声波检查评估法测量的(Byingyton R，Riley W，Booth D等，“氨氯地平对确诊有心脏病的患者的颈动脉粥样硬化进展的作用”，《美国高血压杂志》1999；1242A-43A)。AML在CAD中表现出的临床益处是其他CCB在以前从未报道过的，包括已用于检验此问题的二氢吡啶型药剂也没有过(Waters D，Lesperance J，Francetich M等，“用于评定钙通道阻滞剂对冠状动脉粥样硬化进展的作用的可控临床试验”，《循环》1990；821940-1953；Lichtlen PR，Hugenholtz PG，RafflenbeulW等，“钙通道阻滞剂硝苯地平对人冠状动脉疾病的延迟作用INTACT(关于抗动脉粥样硬化治疗的国际硝苯地平试验)研究结果”，《心血管药物治疗》1990；4S1047-S1068；Borhani NO，MercuriM，Borhani PA等，“多中心伊拉地平利尿剂动脉粥样硬化研究(MIDAS)的最终结果。随机化可控试验。”《美国医学会志》1996；276785-791)。这一观察结果引起了对AML的潜在的抗动脉粥样化性能的兴趣，包括与钙通道调制无关的抗氧化剂作用(Mason RP，Leeds PR，Jacob RF等，“钙拮抗剂氨氯地平和抗氧化剂在小脑粒细胞中对神经元过度编程性细胞死亡的抑制”，《神经化学杂志》1999；721448-1456；Tulenko TN，Laury-Kleintop L，Walter MF，Mason RP.，“胆固醇、钙与动脉粥样硬化钙通道阻滞剂在动脉粥样化保护中有作用吗？”《国际心脏病学杂志》1997；62(2增刊)55S-66S；Kramsch DM，Sharma RC.，“降低脂质疗法的限制氨氯地平作为抗动脉粥样硬化剂的益处”，《人类高血压杂志》1995；9(增刊1)S3-S9)。促血清脂质减少疗法也被证明在降低与CAD有关的发病率和死亡率方面是非常有用的。在HMG-CoA还原酶抑制剂当中，阿托伐他汀钙(atorvastatin calcium)(AT)已显示可作为非常有效的促血清脂质减少疗法(Nawrocki JW，Weiss SR，Davidson MH等，“一种新的HMG-CoA还原酶抑制剂-阿托伐他汀使原发性高胆固醇血症患者的LDL胆固醇降低了25％到60％”，《动脉硬化、血栓及血管生物学》1995；15678-682；Bakker-Arkema RG，Davidson MH，GoldsteinRJ等，“新的HMG-CoA还原酶抑制剂阿托伐他汀对高甘油三酯血症患者的功效与安全性”，《美国医学会志》1996；275128-133)。在涉及稳定的和晚期的CAD患者的最新临床研究中，与血管成形术加常规医疗护理相比，用阿托伐他汀进行的攻击性降低脂质治疗显著延迟了第一次局部缺血发病的时间并将心血管发病的总发生率减少了36％(Pitt B，Waters D，Brown WV等，“攻击性降低脂质治疗与血管成形术结合用于稳定的冠状动脉疾病”，《新英格兰医学杂志》1999；34170-76)。此外，AT的羟基化代谢物已表明在脂蛋白制剂中显示出抗氧化剂作用(Aviram M，Rosenblat M，Bisgaier CL，Newton RS.，“阿托伐他汀和吉非贝齐的代谢物而不是母体药物是对抗脂蛋白氧化的强抗氧化剂”，《动脉粥样硬化》1998；138271-280)。但是，目前不存在能同时治疗高血压和高脂血症的药物组合物。这样的药物组合物会有若干种好处。例如，个体患者常常存在的动脉和相关心脏病的多种危险因素可以同时成为治疗目标。另外，只需容易地服用一个联合剂量可显著增强患者对治疗方案的顺应性。因此，本发明的目的是提供用于治疗与动脉和相关心脏病有关的多个病理学过程的联合治疗。这些包括但不限于高血压和高脂血症。研究开发这种联合治疗的有用而又方便的剂量浓度和形式也是本发明的目的。优选地，这种药物组合物对动脉和相关心脏病的这些特点具有协同作用，使得这种组合物各组分的单个作用因它们的联合得到增强。因此，本发明包括治疗使开发能同时靶向导致动脉粥样硬化的多个基本疾病过程的药物成为必需的CAD的治疗目标，由此改变疾病的过程。因此，使用本发明，如果抗高血压剂与HMG-CoA还原酶抑制剂结合在单一释放系统中使用的话，CAD治疗就可能具有增加的正面结果。发明概述出乎意料地，当AML与AT联合时，它们具有防止人低密度脂蛋白(LDL)和脂质膜中脂质过氧化的协同作用；除了它们确凿的对异常脂血症和高血压的治疗作用外，还出现了这种协同作用。该联合形式的活性被认为是协同的，因为测得的作用明显超过这两种药物的任何加和作用。因此，这些药剂具有迄今未被鉴别出过的协同抗氧化剂作用，这种性能将使得这些药剂能够增加LDL和血管细胞膜在动脉粥样化形成过程中对氧化修饰的抗性。的确，脂质的氧化修饰是内皮和基本平滑肌损伤的确凿原因(Ross R.，“动脉粥样硬化--一种炎性疾病”，《新英格兰医学杂志》1999；340115-126；DiazMN，Frei B，Vita JA，Keaney JF.，“抗氧化剂与动脉粥样硬化性心脏病”，《新英格兰医学杂志》1997；337408-416)。能保护对抗脂质过氧化的亲脂性药剂在各种动脉粥样硬化模型以及临床研究中显示减少了损害的发展(Diaz MN，Frei B，Vita JA，Keaney JF.，“抗氧化剂与动脉粥样硬化性心脏病”，《新英格兰医学杂志》1997；337408-416)。另外，与促血清脂质减少治疗有关的益处也是因为其对血浆极低密度脂蛋白(VLDL)、LDL和高密度脂蛋白(HDL)浓度的作用，结果这种作用就减少了致动脉粥样化的氧化脂蛋白的形成可能性。本发明中描述了支持AML(Norvasc?)和AT(Lipitor?)联合用于单一释放系统来治疗心血管疾病的科学分析。具体地说，在动脉粥样硬化中含氧基团损害的关键目标-人LDL和富含多不饱和脂肪酸(PUFA)的脂质膜中对钙通道阻滞剂AML和HMG-CoA还原酶抑制剂AT(包括其活性羟基化代谢物(ATM))的协同抗氧化剂活性进行评估。这些药剂的协同作用用在胆固醇的存在下制备的膜中来证明。AML与ATM的联合形式在低至10.0nM的浓度下就引起了脂质含氧基团损害的显著而持久的减少。与在治疗浓度下的这些药物的联合形式相联系的剂量依赖性抗氧化剂活性是高度协同的，不能被内源性药剂维生素E有效地再生。用AML和AT的联合形式也观测到了对脂质过氧化的协同抑制。但是，当AML与其他HMG-CoA还原酶抑制剂(包括洛伐他汀和美伐他汀)联合时，没有观测到抗氧化剂活性。根据X射线衍射和化学分析确定，所述的这种药物联合形式的显著活性可归因于与膜双层的强物理化学相互作用，这与这些药物对钙转运和胆固醇代谢的已特征化的作用无关。这种协同抗氧化剂的益处构成了这些化合物的新的药物作用机理以及令人信服的通过降低血浆中LDL的浓度和改善LDL和细胞膜对抗氧化的保护而将活性成分Norvasc?和Lipitor?联合用于治疗心血管疾病的基本原理。这种新的性能补充了这些药物对高血压和异常脂血症的确定作用。
本发明的其他目的、特性和优点将从以下结合附图对优选实施方案所做的详细描述变得清晰可见，在附图中附图的简要描述

图1显示了在含有生理水平的胆固醇的膜中，AML和ATM在低药物治疗浓度(100.0nM)下对脂质过氧化的协同作用。x是脂质过氧化的抑制百分数，y是用100nM浓度的氨氯地平(AML)、阿托伐他汀代谢物(ATM)和二者的联合形式(AML+ATM)进行的治疗。数值为n＝6的均值±标准偏差。***指示与对照和其他治疗相比p＜0.001。
图2显示了AML和ATM的联合形式在宽浓度范围(0.01至10.0μM)下的剂量依赖性抗氧化剂作用。x是脂质过氧化的抑制百分数，y是用指示的微摩尔浓度下的AML和ATM的联合形式进行治疗。数值为n＝6的均值±标准偏差。***指示与对照和其他治疗相比p＜0.001。
图3显示了在相同浓度(10.0μm)下作为时间函数的AML/ATM联合形式优于维生素E的抗氧化剂活性。x是脂质过氧化的抑制百分数，y是用均为10μM浓度的氨氯地平和阿托伐他汀代谢物的联合形式(AML+ATM)，深色条，或维生素E(E)，用交叉线画成阴影的条，进行的治疗。数值为n＝6至12的均值±标准偏差。***指示与对照和其他治疗相比p＜0.001。
图4显示了在两种不同浓度下AML/ATM比AML/AT的抗氧化剂活性对比情况。x是脂质过氧化的抑制百分数，y是用在指示的微摩尔浓度下的氨氯地平和阿托伐他汀代谢物的联合形式(AML+ATM)，深色条，或氨氯地平和阿托伐他汀的联合形式(AML+AT)，用交叉线画成阴影的条，进行的治疗。数值为n＝5至6的均值±标准偏差。***指示与对照和其他治疗相比p＜0.001。
图5显示了在5A图中引起抗氧化剂活性的ATM随着共振稳定计算(图5B到5D)的质子夺取反应位点(S1、S2和S3)。
图6显示了当与不同的HMG-CoA还原酶抑制剂联合时在相同的浓度下AML抗氧化剂活性的对比作用。x是脂质过氧化的抑制百分数，y是用氨氯地平和阿托伐他汀代谢物的联合形式(AML+ATM)，深色条；氨氯地平和阿托伐他汀的联合形式(AML+AT)，深色条；氨氯地平和美伐他汀的联合形式(AML+M)，用交叉线画成阴影的条；或氨氯地平和洛伐他汀的联合形式(AML+L)，没有脂质过氧化抑制，进行的治疗；所有均为1.0μM浓度。数值为n＝6至12的均值±标准偏差。***指示与对照和其他治疗相比p＜0.001。
图7显示了AML和ATM在人LDL样品中的协同抗氧化剂作用，与Trolox C(可溶性维生素E)比较。在图A中，x是在532nm吸光度下测量的硫代巴比妥活性物质(TBARS)的形成，y是以小时计算的时间。对照用实心圆加实线指示，Trolox C(可溶性维生素E)用实心的倒三角加短虚线指示，单独的AML用空心菱形加长虚线指示，单独的ATM用空心圆加长短交替的虚线指示，而AML和ATM用实心方块加点状虚线指示。在图B中，x是在532nm吸光度下测量的硫代巴比妥活性物质(TBARS)的形成，y是用浓度均为3.0μM的氨氯地平(AML)，深色条；阿托伐他汀代谢物(ATM)，用交叉线画成阴影的条；或氨氯地平和阿托伐他汀代谢物(AML+ATM)，深色条，进行的治疗。数值为均值±标准偏差。***指示与对照和其他治疗相比p＜0.001。
图8显示了ATM、AML和它们的各个基团的计算焓。
图9显示了分离的与联合的AML和ATM相比的脂质膜相互作用的X射线衍射测定。x是相对电子密度，y是距离脂质双层中间的埃值。在三幅图中，对照均为实线。在图A中，AML是虚线；在图B中，ATM是虚线；在图C中，AML和ATM的联合形式是虚线。每幅图中的深色面积是对照和治疗电子密度曲线之间的电子密度差异。
图10显示了利用X射线衍射分析测定的分离的比联合的AML和ATM对膜双层尺寸的作用。x是以埃计算的膜宽度的变化，y是用AML，深色条；ATM，用交叉斜线画成阴影的条；AT，深色条；以及AML和ATM的联合形式，用斜线画成阴影的条，进行的治疗。数值为均值±标准偏差。***指示与对照和其他治疗相比p＜0.001。
实施方案的详细描述氨氯地平加阿托伐他汀/阿托伐他汀代谢物在脂质膜中的协同抗氧化剂作用在用富含0.5∶1摩尔比的胆固醇和PUFA二亚油酰磷脂酰胆碱的磷脂重新构成的膜囊中测试AML、AT和ATM的分离的和联合的剂量依赖性抗氧化剂活性。在这些实验中使用膜囊是出于以下几个原因1)这种系统是定义明确的并可高度再生；2)亚油酸代表了氧化损害的最初目标并且是血管细胞膜和脂蛋白颗粒共有的；3)这种膜系统不含钙通道或HMG-CoA还原酶；和4)这种系统中的脂质过氧化可以在没有外源性化学引发剂诸如高浓度的铁和抗坏血酸盐的情况下在37℃下自发地开始。在这些实验中，氧化以逐渐的、依赖于时间的方式发生，在72小时内用分光光度法测量。
在图1中，AML和ATM的协同抗氧化剂活性在由能再现生理样条件的浓度的胆固醇和磷脂组成的膜囊中加以证明(Tulenko TN，ChenM，Mason PE，Mason RP.，“胆固醇对动脉平滑肌膜的物理作用动脉粥样化形成过程中不混溶胆固醇区域和双分子层宽度变化的证据”，《脂质研究杂志》1998；39947-956)。在100.0nM下，在这种富含胆固醇的膜制品中，只有单独的ATM产生了对这种脂质过氧化的任意显著的抑制(对照的9％)。但是，当这两种药剂联合时，抑制程度上升至33％，显著高于用单独的药剂测得的作用(p＜0.01)。联合形式的抗氧化剂活性是非常清晰可见的药物在100.0nM浓度下抑制了脂质过氧化物的形成(＞5×102μM)(对照的脂质过氧化物形成的浓度为1.6mM)。这种药物联合形式产生了对宽浓度范围的高剂量依赖性作用(图2)。低至10.0nM时也观测到了显著抑制(p＜0.05)，IC50为500.0nM。对于联合形式在10.0μM浓度下观测到大于90％的抑制(＞1mM脂质过氧化物形成)(图2)。在低于微摩尔的浓度下观测到了抑制这一事实表明用AML和ATM的联合形式观测到的益处是有重要治疗意义的。
联合形式的抗氧化剂作用以不能被即使在抬高的浓度(10，0μm)下的维生素E再现的方式随时间持续(图3)。这种观测结果与认为维生素E或α-生育酚在脂质过氧化过程中逐渐消耗的观念是一致的。与之相比，AML/ATM联合形式的活性没有受到温育期长度的影响，其中总脂质过氧化物浓度在72小时时间点升至2.2mM。
AML和ATM的联合形式在抑制脂质过氧化物形成方面比AML和AT的联合形式显著更有效(图4)。在100.0nM和1.0μM浓度下，AML和ATM的联合形式的作用分别比AML和AT的联合形式的作用大45％和86％。ATM的由其另外的羟基引起的增加的极性可促进与形式上带电的AML的更强的相互作用，导致与磷脂分子的显著相互作用，如利用X射线衍射分析证明的。ATM的另外的羟基还提供了能供给自由基分子的另外的可夺取质子(图5)。失去质子后，剩下的未配对自由电子可在代谢物的共振结构中有效地稳定，如图5中所示。如图6中所显示的，当AML分别与另外两种他汀(美伐他汀和洛伐他汀)联合时不能再现用AML和ATM的联合形式观测到的类似作用，这指示了AML和ATM的联合形式的显著抗氧化剂活性。
体内研究的结果已表明了亲脂性抗氧化剂在降低心血管发病率和死亡率、尤其是CAD的发病率和死亡率中的重要作用。对氧化损害具有更大抗性的LDL颗粒显示出减小的细胞毒性，较小的与内皮衍生的一氧化氮产生的相互影响，且没有导致泡沫细胞的形成(DiazMN，Frei B，Vita JA，Keaney JF.，“抗氧化剂与动脉粥样硬化性心脏病”，《新英格兰医学杂志》1997；337408-416)。补充抗氧化剂已显示增加了LDL对氧化修饰的抗性并减小了内皮细胞的细胞毒性(Belcher JD，Balla J，Balla G等，“维生素E、LDL与内皮。简单口服补充维生素在体外阻止了氧化LDL介导的血管损伤”，《动脉硬化与血栓》1993；131779-1789)。亲脂性抗氧化剂普罗布考减少了用胆固醇喂食的灵长目动物体内动脉粥样硬化斑的形成，这是与LDL的对氧化损害的抗性增加相关的作用(Sasahara M，Raines EW，Chait A等，“普罗布考对非人灵长目动物的高胆固醇血症诱导的动脉粥样硬化的抑制。I.动脉粥样硬化的程度与LDL对氧化的抗性相关吗？”《临床检查杂志》1994；94155-164)。这种抗氧化剂抑制了特征清楚的动脉粥样硬化动物模型-Watanabe遗传性高脂血症(WHHL)兔体内损害的形成，与胆固醇降低作用无关(Carew TE，Schwenke DC，Steinberg D，“普罗布考的与其促血清胆固醇减少作用无关的抗动脉粥样化作用对Watanabe遗传性高脂血症兔抗氧化剂可在体内选择性抑制低密度脂蛋白在富含巨噬细胞的脂肪条中的降解并减慢动脉粥样硬化进展的证据”，《美国国家科学院院报》1987；847725-7729)。除了这些动物研究以外，用安慰剂对照的临床研究表明普罗布考使CAD患者在冠状动脉气囊血管成形术后的再狭窄减少了47％，推测是由其抗氧化剂作用引起的(Tardif JC，Cote G，Lesperance J等，“普罗布考和多元维生素在预防冠状血管成形术后再狭窄中的作用”，多元维生素和普罗布考研究组。《新英格兰医学杂志》1997；337365-372)。在一个单独的研究中，利用血管内超声技术测定，证明普罗布考与抗氧化剂维生素不同，对经历过血管成形术的患者的血管重建具有有益作用(Cote G，TardifJ-C，Lesperance J等，“普罗布考对冠状血管成形术后血管重建的作用”，《循环》1999；9930-35)。
因此，对可获得的资料的回顾提供了将亲脂性抗氧化剂用于阻止与CAD相联系的炎性过程的机械论理论。通过增加LDL和血管细胞膜对氧化损害的抗性，具有抗氧化活性的药剂可有效地阻止动脉粥样化形成过程中血管壁的病理学改变。这些过程包括但不限于泡沫细胞形成、内皮机能障碍和毒性、白细胞和血小板粘着、以及继发于正常一氧化氮产生损失的动脉血管痉挛。这些细胞观测结果支持了指示某些抗氧化剂的血清浓度与和冠状疾病相联系的不利后果之间的逆关联的流行病学分析结果(Stampfer MJ，Hennekens CH，Manson JE，Colditz GA，Rosner B，Willett WC.，“妇女的维生素E消耗与发生冠状疾病的危险”，《新英格兰医学杂志》1993；3281450-1456；Rimm EB，Stampfer MJ，Ascherio A，GiovannucciE，Colditz GA，Willett WC.。“男性的维生素E消耗与发生冠状心脏病的危险”，《新英格兰医学杂志》1993；3281450-1456；EnstromJE，Kanim LE，Klein MA.，“美国人群样本的维生素C摄取量和死亡率”，《流行病学》1992；3194-202；Riemersma RA，Wood DA，Macintyre CC，Elton R，Gey KF，Oliver MF.，“低血浆维生素E和C增加了苏格兰男性发生心绞痛的危险”，《纽约科学院院报》1989；570291-295；Ramirez J，Flowers NC.，“白细胞抗坏血酸及其与男性冠状动脉疾病的关系”，《美国临床营养学杂志》1980；332079-2087；Hennekens CH，Buring JE，Manson JE等，“长期补充β胡萝卜素对恶性肿瘤和心血管疾病发生率的作用的缺乏”《新英格兰医学杂志》1996；3341145-1149；Losonczy KG，Harris TB，Havlik RJ，“维生素E和维生素C补充使用与老年人所有原因的和冠状心脏病死亡率的危险用于老年流行病学研究的确定人群”，《美国临床营养学杂志》1996；64190-196)。这些流行病学研究中，有一些显示了具有有限的阻止氧化修饰能力的抗氧化剂维生素E的益处。这项研究的结果预报了在减少与CAD相联的血管损伤方面AML和ATM的联合形式将比维生素E显著更有效。
氨氯地平与羟基阿托伐他汀代谢物在人LDL中的协同抗氧化剂作用也对AML和ATM在人LDL制剂中的分离的和联合的抗氧化剂作用进行评估。这些药剂抑制LDL过氧化的能力在体外加入铜(10.0μM)后通过测量脂质过氧化的标志物硫巴比妥活性物质(TBARS)的浓度来评定。图7显示LDL的氧化速率的特征是乙状曲线动力学，具有开始的迟滞期，接着是急剧增值，最后是平坦期(Esterbauer H，Gebicki J，Puhl H，Jurgens G，“脂质过氧化和抗氧化剂在LDL的氧化修饰中的作用”，《自由基与生物医学》1992；13341-390)。4小时的温育期后，可以在3.0μM浓度下清楚地观测到这些化合物的不同作用。与对照脂质过氧化(100％TBARS形成)相比，AML和ATM的TBARS形成分别为93.3±6％和65.6±7％。但是，当它们联合时，TBARS形成仅为29.3±6％，该浓度比用任何一种药物单独观测到的都显著(p＜0.01)更低。联合形式的协同抗氧化剂作用在6小时时间点时仍持续。这些发现提供了进一步的与在膜囊中观测到的一致的协同活性的证据，因为药物联合形式产生的抑制水平实质上超过了它们预期的加和作用。维生素E的抗氧化剂活性与在这些实验中观测到的单独的ATM的活性类似。
氨氯地平和阿托伐他汀代谢物的协同活性的化学机理这种药物联合形式在LDL和重新构成的脂质膜中观测到的协同抗氧化剂活性提示这些化合物彼此直接相互作用来清除脂质基团。基于热力学的考虑(图8)，已提出ATM(方程1)比AML(如方程2所述)更快地与脂质基团反应。如果这些药物一起加入到系统中时只可获得两个途径，那么它们的联合作用将只是加和的。但是，这两种化合物的联合形式提供了第三种途径(方程3)的可能性，这是由在LDL和脂质膜中的过氧化实验结果支持的一种选择。途径1和3的结合将产生协同作用，因为它比途径2发生得更迅速。的确，半经验计算提示反应3是有利的放热过程(ΔHf＝-40.7kJ/mol)。因此，快抑制剂(ATM)的存在使得较慢的抑制剂(AML)能够比独自与脂质基团反应更迅速地除去自由基。说明这些相互作用的三个途径如下所示，其中LOO·表示脂质基(1)LOO·+ATM→LOOH+ATM·快(2)LOO·+AML→LOOH+AML·慢(3)ATM·+AML→ATM+AML· 快作为AML和ATM间的这种协同作用的结果，再循环的代谢物现在可用于另外的脂质基的清除。总之，AML和ATM之间抑制率的不同部分是基于这些化合物和它们各自的基团的计算焓(图8)。Hf值越小(即负值越高)，与基团形成相联系的氢夺取反应更有利。一旦形成后，与基团物质相联的未配对基团就可在共振结构中稳定。
氨氯地平和阿托伐他汀/阿托伐他汀代谢物的分子膜相互作用用小角度X射线衍射法来检验AML和ATM联合形式的分子膜相互作用。这种高度定量技术直接提供了关于膜脂质双层在有和没有药物的情况下的结构信息。据以前的报道，与其他CCB相比，AML在动脉粥样硬化条件下对膜脂质具有高亲和力(Kp＞103)(Mason RP，MoiseyDM，Shajenko L，“胆固醇改变了Ca2+通道阻滞剂与膜脂质双层的结合”，《分子药理学》1992；41315-321)。AML的显著亲油性归因于其将分子引向膜中有利位置的两亲化学结构，然后在该位置的分子可通过生物物理和生物化学机理干扰自由基的增殖，如先前由我们实验室详细描述的(Mason RP，Leeds PR，Jacob RF等，“钙拮抗剂氨氯地平和抗氧化剂在小脑粒细胞中对过度神经元编程性细胞死亡的抑制”，《神经化学杂志》1999；721448-1456；Mason RP，Moisey DM，Shajenko L，“胆固醇改变了Ca2+通道阻滞剂与膜脂质双层的结合”，《分子药理学》1992；41315-321；Mason RP，CampbellSF，Wang SD，Herbette LG，“带阳电荷的1，4-二氢吡啶钙通道拮抗剂氨氯地平与不带电的这类药物在心肌膜中的位置和结合的对比”，《分子药理学》1989；36634-640；Mason RP，Walter MF，Trumbore MW，Olmstead Jr.EG，Mason PE，“带电的二氢吡啶钙拮抗剂氨氯地平的膜抗氧化作用”，《分子与细胞心脏病学杂志》1999；31275-281)。在胆固醇含量不高的膜中，氨氯地平以不能被其他CCB或血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂卡托普利再现的方式抑制了脂质的过氧化(Mason RP，Walter MF，Trumbore MW，OlmsteadJr.EG，Mason PE，“带电的二氢吡啶钙拮抗剂氨氯地平的膜抗氧化作用”，《分子与细胞心脏病学杂志》1999；31275-281)。以相同的方式，阿托伐他汀代谢物的化学结构具有两亲特性，这将使得药物能够与膜脂质双层强烈地相互作用，如最近由我们实验室报道的(Mason RP.，“阿托伐他汀及其活性代谢物对低密度脂蛋白和分离膜的氧化损害的抑制”，《美国心脏病学会志》2000；35317A)。
为了进行这些研究，将AML和ATM的联合形式加入到用0.5∶1摩尔比的胆固醇和磷脂重新构成的膜囊中(图9)。对于典型的对照和含有药物的样品，对膜样品的X射线衍射分析产生了强烈而可再现的衍射图样。不存在药物时，总的膜双层宽度，包括表面水合作用，为55.5埃，双层内首基分离为44埃。与药物分开加入相比，以药物对磷脂为1∶15的比例一起加入这两种药物使磷脂双层的结构和组织产生了显著变化(图9)。在药物联合形式的存在下，总的膜双层宽度，包括表面水合作用，减低至53.5埃，双层内首基分离为41埃。分离地，含有单独的AML和ATM的膜的膜双层宽度分别为54.8埃和58.0埃(图10)。这些结构上的发现提供了直接的证据，证明这些药剂的联合形式与它们单独的作用相比不同地调整了脂质分子的结构。
膜电子密度曲线的直接减法(埃比电子/埃3)证明了可归因于存在药物的脂质结构的较大差异(图9)。具体地说，药物联合形式的加入使得与膜双层的上部烃内核/水合首基区相联系的电子密度产生了较大的增加，距离双层的中心有±11-21埃。分布超过10埃的电子密度的这种较大增加归因于膜中药物的平衡位置。与这种变化相伴的是观测到与膜的中心烃内核区相联系的扰乱作用，±0-11埃。电子密度的这种减小是由于药物分子插入到膜的烃内核/水界面附近的高分子密度区中引起分子体积增加导致的。于是，从这些数据可以得出结论药物联合形式插入到膜双层中以和用降低胆固醇含量或增加样品温度观测到的类似的方式改变了磷脂分子的分子间填充约束(Tulenko TN，Chen M，Mason PE，Mason RP，“胆固醇对动脉平滑肌膜的物理作用动脉粥样化形成过程中不混溶胆固醇区域和双分子层宽度变化的证据”，《脂质研究杂志》1998；39947-956；Chang HM，Reitstetter R，Mason RP，Gruener R，“胆固醇对通道动力学和电导率的弱化作用使用结构应力作为一致概念进行的解释”，《膜生物学杂志》1995；14351-63)。生物物理性能的这种变化已显示干扰了通过脂质双层基质的自由基的增殖(McLean LR，Hagaman KA，“脂质物理状态对脂质体过氧化率的作用”，《自由基与生物医学》1992；12113-119)。
分离的AML和ATM与药物联合形式相比引起了膜结构的显著变化，这是由于与组成型磷脂分子的特异性相互作用导致的(图9和10)。尽管药物联合形式使总的膜宽度减小了2埃或4％(p＜0.01)，但单独的ATM使宽度(2.5埃)增加了5％(p＜0.01)，而单独的AML没有明显改变膜的尺寸，包括双层间首基分离。与单独的AML相比，ATM使烃内核电子密度产生了更大的减小。对膜结构的这种作用可有助于其与AML相比的更大的抗氧化剂效能。AML和ATM的联合形式除影响了它们在膜中的分离位置以外，还影响了与膜脂质双层的新的相互作用位点(图9)。
因此，本发明涉及包含氨氯地平和阿托伐他汀化合物的药物组合物。这些单个药剂可以结合或分开配制成能产生最大治疗应答的盐、形式和剂量。这种联合疗法是设计用于治疗动脉和相关心脏病的各种病理生理学表现，包括但不限于高血压、高脂血症、动脉粥样硬化、动脉硬化、冠状动脉疾病、心肌梗死、充血性心力衰竭、中风和心绞痛。具体地说，这种联合疗法将设计成用于降低血压和全身性脂质浓度以及因缺乏它们的调节导致的相关的病理生理学结果，包括但不限于动脉虚弱和嗜斑沉积。这些单个药剂当联用时对与动脉和相关心脏病的这些不同过程和事件的作用可以是加和的和/或协同的。
现在对于本领域技术人员来说显而易见的是，在与前述公开的字面意义和精神实质相一致和在本专利和所附权利要求书的范围内，可以进行其他的实施方案、改进、细化和应用。
实验方法二亚油酰磷脂酰胆碱(DLPC)、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱(POPC)和未酯化的胆固醇从Avanti Polar Lipids公司(Alabaster，
二亚油酰磷脂酰胆碱(DLPC)、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱(POPC)和未酯化的胆固醇从Avanti Polar Lipids公司(Alabaster，AL)获得并储存在-80℃下。人血浆LDL等分试样(L-2139)从SigmaChemical公司(St.Louis，MO)获得。Sephadex(葡聚糖凝胶)G-25M(PD-10)柱购自Pharmacia Biotech公司(Piscataway，NJ)。氨氯地平磺酸盐(besylate)从Pfizer Central Research(Groton，CT)得到，而阿托伐他汀钙及其羟基代谢物由Parke Davis(AnnArbor，MI)提供。维生素E、Trolox(一种维生素E类似物)、洛伐他汀和美伐他汀购自Sigma化学公司(St.Louis，MO)。
膜脂质过氧化分析。在富含以0.5胆固醇对磷脂摩尔比下制备的PUFA的膜中检验这些药剂的分离的和联合的剂量依赖性抗氧化剂活性(Mason RP，Walter MF，Trumbore MW，Olmstead Jr.EG，Mason PE，“带电的二氢吡啶钙拮抗剂氨氯地平的膜抗氧化作用”，《分子与细胞心脏病学杂志》1999；31275-281)。将用于这些样品的脂质(二亚油酰磷脂酰胆碱和胆固醇)溶于HPLC级氯仿(25.0mg/ml)。将脂质试样(1.0mg)加入到单独的13×100-mm玻璃试管中，通过在稳定的N2气流下的壳体干燥除去氯仿。脂质在有或没有溶于乙醇的药物的条件下干燥下来。残余溶剂在真空下除去，样品避光存放。通过在室温下向干燥脂质中加入1.0ml HEPES缓冲盐水(0.5mM HEPES和154.0mM NaCl，pH7.2)后快速混合来制备膜囊。磷脂的终浓度为1.0mg/ml缓冲液，药物的终浓度范围是从10.0nM到10.0μM。
膜脂质过氧化在摇动水浴中在37℃下不加入外源刺激物进行，如先前详细描述的那样(Mason RP，Walter MF，Trumbore MW，Olmstead Jr.EG，Mason PE，“带电的二氢吡啶钙拮抗剂氨氯地平的膜抗氧化作用”，《分子与细胞心脏病学杂志》1999；31275-281)。在不同的时间间隔(24、48、65、72小时)，取出脂质样品试样(10至100μl)，并向样品中立即加入25μl 5.0mM乙二胺四乙酸(EDTA)和20μl 35.0mM丁基化羟基甲苯(BHT)以终止过氧化反应。
膜脂质过氧化的程度利用先前详细描述过的CHOD-碘测定法来测量(El-Saadani M，Esterbauer H，el-Sayed M，Goher M，NassarAY，Jurgens G，“使用商业上获得的试剂对血清脂蛋白中的脂质过氧化物的分光光度测定”，《脂质研究杂志》1989；30627-630)。从下列反应测定I3-的量，其中L代表磷脂分子
在不同时间点取出膜样品的等分试样，然后加入到包含20.0μMBHT、24.0μM EDTA和0.2％Triton-X的1.0ml CHOD显色试剂(E.M.Science，Gibbstown，NJ)中。然后样品用箔覆盖并使其在没有光的条件下温育2小时，之后测量样品在365nm的吸光度(ε＝2.4×104M-1cm-1)。背景样品与一式三份测试样品平行运行并含有76.7μ10.652mM HEPES、20μ1 5.0mM EDTA和3.3μl DDI水。测定一式三份样品每一个的药物浓度并与不含药物的对照样品进行比较，从而确定脂质过氧化的程度。这些实验的统计学意义利用非成对t检验来评定。被接受的显著性p＜0.05。
LDL氧化测定除了脂质膜以外，在人LDL中评估AML和ATM的抗氧化剂活性。从人血浆得到的LDL样品的EDTA通过用PD-10Sephadex G25-M过滤柱进行的凝胶过滤除去；PBS(氮清洗的)用作洗脱剂。然后LDL样品(50μg蛋白质/mL)在37℃下用药物(3.0μM)或不用药物预温育30分钟。LDL的氧化通过加入10.0μM CuSO4诱导。用TBARS的形成测量的LDL氧化的时间过程在37℃下进行6小时(Mak IT，Kramer JH，Weglicki WB，“脂质两亲物对自由基诱导的对肉膜的脂质过氧化损伤的加强”，《生物化学杂志》1986；2611153-1157)。如利用TBARS方法确定的，LDL的氧化遵循乙状曲线动力学，具有开始的迟滞期，接着是急剧增值，最后是平坦期(Esterbauer H，Gebicki J，Puhl H，Jurgens G，“脂质过氧化和抗氧化剂在LDL的氧化修饰中的作用”，《自由基与生物医学》1992；13341-390)。LDL的蛋白质含量使用从Pierce Chemical
小角度X射线衍射分析。小角度X射线衍射分析用于直接检验AML、AT和ATM的分子膜相互作用。将用于这些样品的脂质(1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱和胆固醇)溶于HPLC级氯仿(10.0mg/ml)。用上文中对过氧化实验所述的相同方法从这些脂质生产膜囊。磷脂终浓度为5.0mg/ml缓冲液，药物与磷脂的摩尔比为1∶15。膜样品通过按以前的描述进行离心而定向用于衍射分析(Chester DW，Herbette LG，Mason RP，Joslyn AF，Triggle DJ，Koppel DE，“二氢吡啶钙通道拮抗剂在心肉膜脂质多双层中的扩散”，《生物物理学杂志》1987；521021-1030)。简言之，将膜囊置于含有铝箔衬底的沉降池中。这些膜囊在SW-28旋筒(Beckman Instruments，Fullerton，CA)中在5℃下以35,000xg旋转1.5小时而沉降。离心后，取出颗粒物上面的上清液，将样品装到弧形玻璃支持器上。将样品置于密封罐中以控制衍射实验期间的相对湿度和温度，如先前已详细描述的那样(Chester DW，Herbette LG，Mason RP，JoslynAF，Triggle DJ，Koppel DE， “二氢吡啶钙通道拮抗剂在心肉膜脂质多双层中的扩散”，《生物物理学杂志》1987；521021-1030)。
X射线衍射实验通过将样品以关于通过高辉度旋转阳极微焦发生器(Rigaku Rotaflex RU-200，Danvers，MA)产生的准直镍过滤单色X射线源(CuKα＝1.54埃)的掠射角对准来进行。固定的几何束线由单个镍包被的Franks反射镜组成以确定射线源，其中Kα1和Kα2未分解的。衍射数据收集在距离样品150mm放置的一维位置敏感性电子检测器(Innovative Technologies，Newburyport，MA)上。每个径向衍射峰是洛伦兹-和背景-修正的，如以前所述(Mason RP，Gonye GE，Chester DW，Herbette LG，“Bay K 8644，1，4-二氢吡啶钙通道激动剂，在模型和生物膜中的分隔和位置”，《生物物理学杂志》1989；55769-778)。用于四阶(four-order)数据的相位通过膨胀分析确定(Moody MF，“神经髓磷脂的X射线衍射图样确定相位的方法”，《科学》1963；1421173-117)。数据的傅里叶变换用Origin软件(Microcal Software，Northampton，MA)从衍射数据产生。


氨氯地平与阿托伐他汀或阿托伐他汀代谢物的联合形式显示出对人低密度脂蛋白和富含多不饱和脂肪酸的膜囊中的脂质过氧化的协同抗氧化作用。以治疗水平观察到这种药物联合形式对含氧基团损害的抑制以不能被氨氯地平与其他他汀类或天然抗氧剂维生素E的联合形式再现的方式。这种强活性的基础应归于这些化合物的化学结构以及它们与磷脂分子的分子相互作用,如通过X射线衍射分析确定的。这种联合疗法可以通过增加低密度脂蛋白和血管细胞膜对抗氧化修饰的抗性而用于治疗心血管疾病,尤其是冠状动脉疾病。


发明者<