专利名称：治疗乙肝病毒感染的靶向核糖核酸酶的制备工艺的制作方法实施例11)hEDN编码基因的扩增及测序1.1根据hEDN基因序列进行引物设计正向引物5′-GCG CGG ATC CAC CAT GAA ACC TCC ACA GTT TAC-3′；反向引物5′-GCG CGA GCT CGA TGA TTC TAT CCA GGT G-3′；正向引物及反向引物的5′端分别带有BamH I和Sac I酶切位点；1.2扩增目的基因在5×106的HL-60细胞中加入1ml的Trizol?，反复吹打，在15℃下放置5分钟，然后加入0.2ml的氯仿，剧烈震动15秒，在15℃下放置2分钟后在2℃、12000g的相对离心力下离心15分钟，吸取上层水相；在上层水相中加入0.5ml的异丙醇，在15℃下放置10分钟后在2℃、12000g的相对离心力下离心10分钟，去上清，得到HL-60细胞的总RNA；将HL-60的总RNA在-5℃下保存于75％的乙醇中，临用前在2℃、7500g的相对离心力下离心5分钟，干燥后溶于无RNA酶的纯水中。应用One Step RNA PCR kit试剂盒，在每个PCR聚合酶链式反应管中加入5μl的10×One Step RNA PCR Buffer、10μl浓度为25mmol/L的MgCl2、5μl浓度为10mmol/L的dNTP、1μl的RNase Inhibitor、1μl的AMVReverseTranscriptase XL、1μl的AMV-optimized Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、1μl的模板RNA和24μl的无RNA酶的纯水混合后，分别置于50℃下30min反应一次、94℃下2min反应一次，然后再置于94℃下30s、55℃下30s、72℃延伸1min分别循环25次； 2)HBVc编码基因的扩增及测序2.1根据HBVc编码基因的基因序列进行引物设计正向引物5′-GCG CGA GCT CAT GGA CAT CGA CCC TTA T-3′；反向引物5′-GCG CAA GCT TTT AAC ATT GAG GTT CCC GAG A-3′；正向引物及反向引物的5′端分别带有Sac I和Hind III酶切位点；2.2扩增目的基因向2.2.15细胞加入1ml/10cm2的Trizol?，在15℃下放置5分钟后，加入0.2ml/1ml Trizol?的氯仿，剧烈震动15秒，再在15℃下放置2分钟后，在2℃、12000g的相对离心力下离心15分钟，吸取上层水相；在上层水相中加入0.5ml/1ml Trizol?的异丙醇，15℃下放置10分钟，2℃、12000g的相对离心力下离心10分钟，去上清，得到2.2.15细胞的总RNA；将2.2.15细胞的总RNA在-5℃保存于75％的乙醇中，临用前在2℃、7500g的相对离心力下离心5分钟，干燥后溶于无RNA酶的纯水中。应用One Step RNA PCR kit试剂盒，在每个PCR聚合酶链式反应管中加入5μl的10×One Step RNA PCR Buffer、10μl浓度为25mmol/L的MgCl2、5μl浓度为10mmol/L的dNTP、1μl的RNase Inhibitor、1μl的AMV ReverseTranscriptase XL、1μl的AMV-optimized Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、1μl的模板RNA和24μl的无RNA酶的纯水混合后，置于50℃下30min、94℃下2min反应一次，然后再置于94℃下30s、55℃下30s、72℃延伸1min分别循环25次，得到PCR产物；2.3克隆与测序将hEDN和HBVc的产物PCR经1.0％琼脂糖凝胶电泳后用NucleoTrap?Nucleic Acid Purification Kit试剂盒，进行纯化回收；将回收产物分别用BamH I和Sac I、Sac I和Hind III酶切后纯化回收，分别与用BamH I和Sac I及Sac I和Hind III酶切后纯化回收的pUC18连接；连接产物转化大肠杆菌JM109株，以High Pure Plasmid Isolation Kit试剂盒，提取质粒，再用BamH I和SacI及Sac I和Hind III酶切鉴定；序列测定采用双脱氧链末端终止法，以ABI377DNA自动序列测定仪进行；2.4靶向核糖核酸酶真核表达载体构建将扩增的hEDN及HBVc编码基因分别用BamH I和Sac I、Sac I和Hind III双酶切，将真核表达载体经BamH I和Hind III双酶切后，以T4连接酶连接hEDN、HBVc、pcDNA3.1(-)酶切片段，转化E.coli JM109感受态细胞；用含Amp的固体培养基(LB)筛选阳性克隆，经小量提取质粒，并酶切鉴定后，构建融合真核表达载体pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc；2.5带有柔性的(Gly4Ser)3连接区的靶向核糖核酸酶真核表达载体构建2.5.1柔性连接区编码基因的合成首先合成两条互补的寡核苷酸链，序列如下P1 5’gcgcggatcc ggt ggc ggt ggc tcg ggc ggt ggt ggg tcg ggt ggcggc gga tct gagctc gcgc3’P2 5’gcgcgagctc aga tcc gcc gcc acc cga ccc acc acc gcc cga gccacc gcc acc ggatcc gcgc3’将上述两条寡核苷酸链以无菌双蒸水稀释至浓度为40μmmol/L，各取15μL混匀后，分别置于94℃下5分钟使两条寡核苷酸链变性，再分别置于80℃下5分钟、75℃下5分钟、70℃下5分钟、65℃下5分钟、60℃下5分钟、55℃下10分钟使两条寡核苷酸链复性；将复性后的产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后纯化回收，即为柔性连接区编码基因；2.5.2带有柔性的(Gly4Ser)3连接区的靶向核糖核酸酶真核表达载体构建将融合真核表达载体pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc经BamH I和Sac I双酶切后形成的大片断命名为p/HBV；将纯化回收的p/HBV与经BamH I和Sac I双酶切的经变性、复性后的两条寡核苷酸链柔性连接区编码基因以T4连接酶连接，形成重组质粒p/LHBV；将p/LHBV以BamH I酶切，Klenow补平，Hind III酶切后，纯化回收小片断LHBV；融合真核表达载体pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc经Sac I酶切，T4 DNA多聚酶削平，Hind III酶切后，纯化回收大片断p/hEDN；将LHBV和p/hEDN以T4连接酶连接，转化E.coli JM109感受态细胞；用含Amp的固体培养基(LB)筛选阳性克隆，经小量提取质粒，并酶切鉴定后，构建带有柔性的(Gly4Ser)3连接区的靶向核糖核酸酶真核表达载体p/LTR。实施例21)hEDN编码基因的扩增及测序1.1根据hEDN基因序列进行引物设计正向引物5′-GCG CGG ATC CAC CAT GAA ACC TCC ACA GTT TAC-3′；反向引物5′-GCG CGA GCT CGA TGA TTC TAT CCA GGT G-3′；正向引物及反向引物的5′端分别带有BamH I和Sac I酶切位点；1.2扩增目的基因在10×106的HL-60细胞中加入1ml的Trizol?，反复吹打，在30℃下放置5分钟，然后加入0.2ml的氯仿，剧烈震动15秒，在30℃下放置3分钟后在8℃、12000g的相对离心力下离心15分钟，吸取上层水相；在上层水相中加入0.5ml的异丙醇，在30℃下放置10分钟后在8℃、12000g的相对离心力下离心10分钟，去上清，得到HL-60细胞的总RNA；将HL-60的总RNA在-20℃下保存于75％的乙醇中，临用前在8℃、7500g的相对离心力下离心5分钟，干燥后溶于无RNA酶的纯水中。应用One Step RNA PCR kit试剂盒，在每个PCR聚合酶链式反应管中加入5μl的10×One Step RNA PCR Buffer、10μl浓度为25mmol/L的MgCl2、5μl浓度为10mmol/L的dNTP、1μl的RNase Inhibitor、1μl的AMV ReverseTranscriptase XL、1μl的AMV-optimized Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、1μl的模板RNA和24μl的无RNA酶的纯水混合后，分别置于50℃下30min反应一次、94℃下2min反应一次，然后再置于94℃下30s、65℃下30s、72℃延伸10min分别循环40次；2)HBVc编码基因的扩增及测序2.1根据HBVc编码基因的基因序列进行引物设计正向引物5′-GCG CGA GCT CAT GGA CAT CGA CCC TTA T-3′；反向引物5′-GCG CAA GCT TTT AAC ATT GAG GTT CCC GAG A-3′；正向引物及反向引物的5′端分别带有Sac I和Hind III酶切位点；2.2扩增目的基因向2.2.15细胞加入1ml/10cm2的Trizol?，在30℃下放置5分钟后，加入0.2ml/1ml Trizol?的氯仿，剧烈震动15秒，再在30℃下放置3分钟后，在8℃、12000g的相对离心力下离心15分钟，吸取上层水相；在上层水相中加入0.5ml/1ml Trizol?的异丙醇，30℃下放置10分钟，8℃、12000g的相对离心力下离心10分钟，去上清，得到2.2.15细胞的总RNA；将2.2.15细胞的总RNA在-20℃保存于75％的乙醇中，临用前在8℃、7500g的相对离心力下离心5分钟，干燥后溶于无RNA酶的纯水中。应用One Step RNA PCR kit试剂盒，在每个PCR聚合酶链式反应管中加入5μl的10×One Step RNA PCR Buffer、10μl浓度为25mmol/L的MgCl2、5μl浓度为10mmol/L的dNTP、1μl的RNase Inhibitor、1μl的AMV ReverseTranscriptase XL、1μl的AMV-optimized Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、1μl的模板RNA和24μl的无RNA酶的纯水混合后，置于50℃下30min、94℃下2min反应一次，然后再置于94℃下30s、65℃下30s、72℃延伸10min分别循环40次，得到PCR产物；2.3克隆与测序将hEDN和HBVc的产物PCR经1.5％琼脂糖凝胶电泳后用NucleoTrap?Nucleic Acid Purification Kit试剂盒，进行纯化回收；将回收产物分别用BamH I和Sac I、Sac I和Hind III酶切后纯化回收，分别与用BamH I和Sac I及Sac I和Hind III酶切后纯化回收的pUC18连接；连接产物转化大肠杆菌JM109株，以High Pure Plasmid Isolation Kit试剂盒，提取质粒，再用BamH I和SacI及Sac I和Hind III酶切鉴定；序列测定采用双脱氧链末端终止法，以ABI377DNA自动序列测定仪进行；2.4靶向核糖核酸酶真核表达载体构建将扩增的hEDN及HBVc编码基因分别用BamH I和Sac I、Sac I和Hind III双酶切，将真核表达载体经BamH I和Hind III双酶切后，以T4连接酶连接hEDN、HBVc、pcDNA3.1(-)酶切片段，转化E.coli JM109感受态细胞；用含Amp的固体培养基(LB)筛选阳性克隆，经小量提取质粒，并酶切鉴定后，构建融合真核表达载体pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc；2.5带有柔性的(Gly4Ser)3连接区的靶向核糖核酸酶真核表达载体构建2.5.1柔性连接区编码基因的合成首先合成两条互补的寡核苷酸链，序列如下P1 5’gcgcggatcc ggt ggc ggt ggc tcg ggc ggt ggt ggg tcg ggt ggcggc gga tct gagctc gcgc3’P2 5’gcgcgagctc aga tcc gcc gcc acc cga ccc acc acc gcc cga gccacc gcc acc ggatcc gcgc3’将上述两条寡核苷酸链以无菌双蒸水稀释至浓度为40μmmol/L，各取15μL混匀后，分别置于94℃下5分钟使两条寡核苷酸链变性，再分别置于80℃下5分钟、75℃下5分钟、70℃下5分钟、65℃下5分钟、60℃下5分钟、55℃下10分钟使两条寡核苷酸链复性；将复性后的产物经2％琼脂糖凝胶电泳后纯化回收，即为柔性连接区编码基因；2.5.2带有柔性的(Gly4Ser)3连接区的靶向核糖核酸酶真核表达载体构建将融合真核表达载体pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc经BamH I和Sac I双酶切后形成的大片断命名为p/HBV；将纯化回收的p/HBV与经BamH I和Sac I双酶切的经变性、复性后的两条寡核苷酸链柔性连接区编码基因以T4连接酶连接，形成重组质粒p/LHBV；将p/LHBV以BamH I酶切，Klenow补平，Hind III酶切后，纯化回收小片断LHBV；融合真核表达载体pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc经Sac I酶切，T4 DNA多聚酶削平，Hind III酶切后，纯化回收大片断p/hEDN；将LHBV和p/hEDN以T4连接酶连接，转化E.coli JM109感受态细胞；用含Amp的固体培养基(LB)筛选阳性克隆，经小量提取质粒，并酶切鉴定后，构建带有柔性的(Gly4Ser)3连接区的靶向核糖核酸酶真核表达载体p/LTR。实施例31)hEDN编码基因的扩增及测序1.1根据hEDN基因序列进行引物设计正向引物5′-GCG CGG ATC CAC CAT GAA ACC TCC ACA GTT TAC-3′；反向引物5′-GCG CGA GCT CGA TGA TTC TAT CCA GGT G-3′；
正向引物及反向引物的5′端分别带有BamH I和Sac I酶切位点；1.2扩增目的基因在8×106的HL-60细胞中加入1ml的Trizol?，反复吹打，在20℃下放置5分钟，然后加入0.2ml的氯仿，剧烈震动15秒，在25℃下放置2.5分钟后在6℃、12000g的相对离心力下离心15分钟，吸取上层水相；在上层水相中加入0.5ml的异丙醇，在18℃下放置10分钟后在5℃、12000g的相对离心力下离心10分钟，去上清，得到HL-60细胞的总RNA；将HL-60的总RNA在-15℃下保存于75％的乙醇中，临用前在4℃、7500g的相对离心力下离心5分钟，干燥后溶于无RNA酶的纯水中。
应用One Step RNA PCR kit试剂盒，在每个PCR聚合酶链式反应管中加入5μl的10×One Step RNA PCR Buffer、10μl浓度为25mmol/L的MgCl2、5μl浓度为10mmol/L的dNTP、1μl的RNase Inhibitor、1μl的AMV ReverseTranscriptase XL、1μl的AMV-optimized Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、1μl的模板RNA和24μl的无RNA酶的纯水混合后，分别置于50℃下30min反应一次、94℃下2min反应一次，然后再置于94℃下30s、60℃下30s、72℃延伸5min分别循环30次；2)HBVc编码基因的扩增及测序2.1根据HBVc编码基因的基因序列进行引物设计正向引物5′-GCG CGA GCT CAT GGA CAT CGA CCC TTA T-3′；反向引物5′-GCG CAA GCT TTT AAC ATT GAG GTT CCC GAG A-3′；正向引物及反向引物的5′端分别带有Sac I和Hind III酶切位点；2.2扩增目的基因向2.2.15细胞加入1ml/10cm2的Trizol?，在25℃下放置5分钟后，加入0.2ml/1ml Trizol?的氯仿，剧烈震动15秒，再在24℃下放置2.3分钟后，在7℃、12000g的相对离心力下离心15分钟，吸取上层水相；在上层水相中加入0.5ml/1ml Trizol?的异丙醇，28℃下放置10分钟，7℃、12000g的相对离心力下离心10分钟，去上清，得到2.2.15细胞的总RNA；将2.2.15细胞的总RNA在-12℃保存于75％的乙醇中，临用前在3℃、7500g的相对离心力下离心5分钟，干燥后溶于无RNA酶的纯水中。
应用One Step RNA PCR kit试剂盒，在每个PCR聚合酶链式反应管中加入5μl的10×One Step RNA PCR Buffer、10μl浓度为25mmol/L的MgCl2、5μl浓度为10mmol/L的dNTP、1μl的RNase Inhibitor、1μl的AMV ReverseTranscriptase XL、1μl的AMV-optimized Taq、1μl正向引物、1μl的反向引物、1μl的模板RNA和24μl的无RNA酶的纯水混合后，置于50℃下30min、94℃下2min反应一次，然后再置于94℃下30s、60℃下30s、72℃延伸6min分别循环38次，得到PCR产物；2.3克隆与测序将hEDN和HBVc的产物PCR经1.3％琼脂糖凝胶电泳后用NucleoTrap?Nucleic Acid Purification Kit试剂盒，进行纯化回收；将回收产物分别用BamH I和Sac I、Sac I和Hind III酶切后纯化回收，分别与用BamH I和Sac I及Sac I和Hind III酶切后纯化回收的pUC18连接；连接产物转化大肠杆菌JM109株，以High Pure Plasmid Isolation Kit试剂盒，提取质粒，再用BamH I和SacI及Sac I和Hind III酶切鉴定；序列测定采用双脱氧链末端终止法，以ABI377DNA自动序列测定仪进行；2.4靶向核糖核酸酶真核表达载体构建将扩增的hEDN及HBVc编码基因分别用BamH I和Sac I、Sac I和Hind III双酶切，将真核表达载体经BamH I和Hind III双酶切后，以T4连接酶连接hEDN、HBVc、pcDNA3.1(-)酶切片段，转化E.coli JM109感受态细胞；
用含Amp的固体培养基(LB)筛选阳性克隆，经小量提取质粒，并酶切鉴定后，构建融合真核表达载体pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc；2.5带有柔性的(Gly4Ser)3连接区的靶向核糖核酸酶真核表达载体构建2.5.1柔性连接区编码基因的合成首先合成两条互补的寡核苷酸链，序列如下P1 5’gcgcggatcc ggt ggc ggt ggc tcg ggc ggt ggt ggg tcg ggt ggcggc gga tct gagctc gcgc3’P2 5’gcgcgagctc aga tcc gcc gcc acc cga ccc acc acc gcc cga gccacc gcc acc ggatcc gcgc3’将上述两条寡核苷酸链以无菌双蒸水稀释至浓度为40μmmol/L，各取15μL混匀后，分别置于94℃下5分钟使两条寡核苷酸链变性，再分别置于80℃下5分钟、75℃下5分钟、70℃下5分钟、65℃下5分钟、60℃下5分钟、55℃下10分钟使两条寡核苷酸链复性；将复性后的产物经1.7％琼脂糖凝胶电泳后纯化回收，即为柔性连接区编码基因；2.5.2带有柔性的(Gly4Ser)3连接区的靶向核糖核酸酶真核表达载体构建将融合真核表达载体pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc经BamH I和Sac I双酶切后形成的大片断命名为p/HBV；将纯化回收的p/HBV与经BamH I和Sac I双酶切的经变性、复性后的两条寡核苷酸链柔性连接区编码基因以T4连接酶连接，形成重组质粒p/LHBV；将p/LHBV以BamH I酶切，Klenow补平，Hind III酶切后，纯化回收小片断LHBV；融合真核表达载体pcDNA3.1(-)/hEDN-HBVc经Sac I酶切，T4 DNA多聚酶削平，Hind III酶切后，纯化回收大片断p/hEDN；
将LHBV和p/hEDN以T4连接酶连接，转化E.coli JM109感受态细胞；用含Amp的固体培养基(LB)筛选阳性克隆，经小量提取质粒，并酶切鉴定后，构建带有柔性的(Gly4Ser)3连接区的靶向核糖核酸酶真核表达载体p/LTR。
本发明以乙肝病毒的DNA多聚酶末端蛋白结构域与核心蛋白为靶向分子，利用它们对乙肝病毒前基因组RNA(pgRNA)的特异识别与包裹，使与靶向分子融合表达的效应分子——核糖核酸酶特异地与乙肝病毒pgRNA结合并切割，抑制乙肝病毒的复制。实验结果表明，其所表达的融合蛋白在体外可抑制乙肝病毒的复制，但对正常细胞无毒性。本发明所针对的靶点为乙肝病毒的pgRNA，通过在受乙肝病毒感染的细胞内对pgRNA的降解抑制乙肝病毒的复制；选用人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素，作为靶向核糖核酸酶中的效应分子，已经实验证实对正常细胞无毒性(6)。而且由于其是人源性的蛋白，在人体不会诱发免疫应答，)选用的靶向分子为乙肝病毒的DNA多聚酶末端蛋白结构域与核心蛋白，通过比较，可以筛选出靶向性更强的分子；除使效应分子与靶向分子直接连接外，我们还设计了通过一段柔性的(Gly4Ser)3连接区连接效应分子与靶向分子，使效应分子与靶向分子可各自折叠成其天然的构象，确保了所形成的融合蛋白抑制乙肝病毒复制的高特异性和高效性。
实验表明，本发明构建的靶向核糖核酸酶在体外可使乙肝表面抗原(HBSAg)下降46％-59％，可以明显抑制乙肝病毒的复制。具体的给药途径和给药方式可参照目前已有的基因治疗或蛋白质药物的方案。


本发明公开了一种治疗乙肝病毒感染的靶向核糖核酸酶的制备工艺,它通过分子生物学的手段,构建人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素hEDN与HBV多聚酶末端蛋白结构域DNAPTP或核心蛋白的融合蛋白,该融合蛋白即为构建的靶向核糖核酸酶,本融合蛋白可以采取基因治疗或蛋白质药物的方式,治疗人的乙肝病毒的感染。实验表明,本发明构建的靶向核糖核酸酶在体外可使乙肝表面抗原(HBSAg)下降46%－59%,可以明显抑制乙肝病毒的复制。具体的给药途径和给药方式可参照目前已有的基因治疗或蛋白质药物的方案。