专利名称：沙棘总黄酮提取纯化的方法黄酮其全称应是“生物类黄酮物质”，广泛存在于自然界，其种类已发现有3000 种左右，其分子结构均具有C6*C3*C6的多元酚化合物，在两个芳香环(A、B环)之间以 三碳链相连，以上的共同结构加上不同的侧链基团组成不同种类的甙种类的甙元，如槲皮 素，异鼠李素、山奈酚，杨梅酮，芹菜素等等，这些不同的甙元又与不同的糖类分子连接，如 葡萄糖、鼠李糖、槐二糖、巢菜糖等等，于是形成了数千种黄酮类化合物。过去把它们统称为 维生素P，现在科学界将这些化合物归入植物多酚类，故黄酮类化合物是植物多酚类中一个 大家属。黄酮类物质对人体健康关系密切，是一类优良的抗氧化物质，现已发现在沙棘植物 中含有32种黄酮类化合物(黄酮苷)，很多中草药的有效成分也是黄酮物质。现有技术中对于沙棘黄酮的生产工艺主要为醇提水沉淀法(以下简称醇提)，其 工艺步骤包括脱脂，乙醇回流提取，过滤，浓缩，再用乙酸乙脂对浸提浓缩液溶解过滤、纯 化，浓缩、干燥成品。而该方法的缺点在于，由于现今食用乙醇的价格每吨已大于7000元， 致使用醇提方法生产的沙棘黄酮，其成本已超过1200元/KG，成本高居不下，使沙棘黄酮生 产困难极大。现有技术中也有以沙棘叶作原料，进行了水浸提(以下简称水提)沙棘叶总黄酮 的工艺研究。其工艺包括将沙棘叶清洗去杂，然后干燥粉碎，接着用石油醚脱脂，热水浸 提，过滤，对滤液调PH，沉淀，水洗至中性，然后乙醇淋洗，将滤液浓缩，沉淀，过滤，干燥，最 后获得产品。这种方法在现有技术中的一个具体例子如下A.沙棘叶的脱脂取190克去杂干燥粉碎的沙棘叶，用400毫升石油醚(沸程 60-900C )浸泡1小时后，75°C回流1小时，过滤后叶渣再用200毫升石油醚回流1小时，再过滤οB.水浸取脱脂后叶渣挥发尽石油醚后加1500毫升水浸泡30分钟，回流30分钟， 过滤，滤渣再分别用900毫升，600毫升水各回流30分钟，滤液合并后，冷却至室温，得水提 取液。C.调PH值分离出粗黄酮苷，用1 1盐酸调节水提取液的PH值，因黄酮苷类在酸 性条件下溶解度小，可用酸沉淀使其析出，但酸性不宜过强，以免生成烊盐和发生水解，使 析出的黄酮苷类(TFH)又重新溶解。实验得知，当提取液PH值为3时， Η得率值最高，黄 酮得率达1.05%。D.30%乙醇淋洗得产品粗黄酮苷中含蛋白质，多糖及花色素等多酚类杂质，用 30%乙醇淋洗，这样可以减少溶于高浓度醇的干扰杂质，而对黄酮苷的溶解影响不大。然而用“水提”法所得产品含量黄酮仅为8. 4%，离合格产品(18% )太远，且得率 也偏低(1.05% )，无生产意义。
本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种价廉高效的沙棘总黄酮提 取纯化方法。由于沙棘叶黄酮中所含的4种黄酮苷元槲皮素，山奈酚，异鼠李素和杨梅酮(也 称杨梅素)，其分子结构中均含丰富的酚羟基，可与碱成盐后溶于水，是这些苷元在天然沙 棘叶中均成苷类存在，它们均连有数个不同的糖分子，如此更增加了其水溶性，发明人在大 量的实验以及反复验证后发现，用稀碱水进行提取，可大大提高得率。极稀的碱液代替乙 醇，其成本比水稍高一点点，而乙醇(95%浓度)现价要7000元/吨以上，若用70%乙醇提 取，每吨也要5000元以上，而水的价每吨是几元，成本之差有1000倍以上，因而大大降低了 提取成本。一种沙棘总黄酮提取纯化的方法包括以下依次的步骤提供原料，脱脂，提取， 过滤，滤液调节PH，离心分离，沉淀物进行醇溶超声波提取，离心分离，回收乙醇，加纯水 和澄清剂处理，离心分离，清液树脂吸附，水洗，乙醇洗脱，洗脱液浓缩，干燥，获得产品，其 中所述提取为稀碱提取，所述稀碱提取步骤为加入1 15-30 (W/V)质量百分比浓度为 0. 3% -0. 5%的稀碱溶液进行提取，其中所述稀碱是基于沙棘干燥叶片的重量计算，提取温 度为70-95°C，提取时间15-25分钟。该提取的工艺条件避免黄酮苷类的水解开环。极稀的碱溶液可以促进黄酮提取，并且确定了相应的提取条件，由于除碱提酸沉 醇溶外有些工艺在现有技术中也有记载，有些工艺没有记载，发明人对其他各工艺步骤进 行了研究，并且完善优化了各步骤或其工艺条件，从而进一步提高了产品的产量和质量。(1)在脱脂步骤中，加入1 12_30(W/V) 丁烷，其中所述丁烷是基于沙棘干燥叶片 的重量计算，45-701加热回流0.5-1.5小时。放出萃取液，回收丁烷，得叶油。该脱脂步骤 共进行3次。(2)由于硼砂能与含邻二酚羟基结合(如槲皮素分子中就含邻二酚羟基)，起到保 护邻二酚羟基，不被氧化破坏的作用，因此在脱脂之后在提取过程中加入1 10-20(W/V) 质量百分比浓度为0. 3%-0. 5%的硼砂溶液(即四硼酸钠)，其中所述硼砂溶液是基于沙棘 干燥叶片的重量计算，搅拌加热至微沸后，再加入稀碱溶液，可以进一步提高产品质量。(3) 一份沙棘叶共提取3次，第2、第3次提取时仅加入1 15_30(W/V)质量百分 比浓度为0. 35-0. 45%的稀碱液，其中所述稀碱是基于沙棘干燥叶片的重量计算。(4)其中所述滤液在60_80°C下，在滤液调节pH步骤中，将PH调节到4. 0-5. 0，此 时黄酮苷沉淀，在此极其温和条件下，可完全避免黄酮苷形成烊盐重新溶解，降低收率。( 其中在所述沉淀物进行醇溶超声波提取步骤为加1 5-10 (W/V)质量百分比 浓度60% -80%的乙醇，其中所述乙醇是基于沙棘干燥叶片的重量计算，50°C -80°C超声提 取20-30分钟。该提取步骤共进行2-4次。在该步骤中，用乙醇溶解沉淀(醇溶)时，黄酮 苷溶入乙醇中，而大量的杂质如蛋白质，果胶类粘液物质在60%以上乙醇中不溶解离心时 沉淀而被分离除去。虽然也要用少量乙醇去溶解提取物沉淀，但此时用量已很少，不会出现 前端提取干树叶时大量吸收溶剂的现象。在工艺后端使用的少量乙醇也便于回收。(6)其中在所述回收乙醇步骤中，在50-80°C真空减压回收乙醇，在蒸至1/2-1/3 体积时，加入纯水约原体积的1/4-1/2，待馏出液乙醇的质量百分比浓度≤10%时止，再加纯水至沙棘叶用量的34倍(W/V)，例Ikg沙棘叶加入3-4L纯水，再加澄清剂并加热至 50-700C，充分搅拌至自然沉降。通过冷水套冷却至常温后，高速离心，弃去沉淀物。(7)在树脂吸附步骤中，使用大孔树脂。(8)在乙醇洗脱步骤中使用50%乙醇和70%乙醇分别进行洗脱，然后合并洗脱 液。这相比现有技术中使用25%乙醇和75%醇洗脱具有更好的洗脱效果。(9)在干燥步骤中，使用喷雾干燥。上述各个具体的步骤可以单独或者多个一起结合入所述的提取方法中，其形成的 技术方案均属于本发明的保护内容。本发明是用稀碱水浸提，酸沉淀，醇溶大孔树脂吸附方法。可使产品的黄酮含量在 20 %以上，黄酮提取物得率在3-4 %。随沙棘叶的质量不同有所波动，由于不采用乙醇提取， 改用稀碱水，成本自然大降。后面的醇提仅用很少乙醇去溶解沉淀物，且其后将此少量乙醇 大部分都回收使用，生产安全方面也好于醇提工艺。下面本发明将通过特定的具体实施方案作出更详细的列举。具体实施方案取沙棘干燥叶片，加入1 12(W/V) 丁烷进行丁烷脱脂，即Ikg干叶加12L 丁烷若 取250克沙棘叶则加入3000ml 丁烷，在专用压力容器中60°C加热回流1小时，放出萃取液， 回收丁烷，得叶油，重复操作共3次脱油，减压真空抽尽叶中丁烷，系统加热至60°C ；在脱脂后的叶渣中加1 10(W/V)质量百分比0.4%硼砂溶液，即Ikg干叶加 IOL硼砂溶液若取250克沙棘叶则加入2500ml硼砂溶液，充分搅动，加热至微沸后，在搅拌 条件下，加入1 10(W/V)0.8%稀碱溶液，即Ikg干叶加IOL稀碱溶液，不停搅拌加热至 80-90°C，维持15分钟，抽出萃取液，加入1 15(ff/V)质量百分比0. 4%稀碱液，即Ikg干 叶加15L稀碱溶液重复以上操作，共提取3次；抽出萃取液合并3次滤液在60-70°C下，调PH_4. 2-4. 3，静止过夜高速离心分离， 弃去上清液。沉淀物加入1 5(W/V)质量百分比80%乙醇，即即Ikg干叶加时5L乙醇；在 50-60°C用超声波提取器搅拌提取，20分钟，离心分离；重复以上操作共提取3次，弃去沉淀 物；清液(醇溶液)50_60°C真空减压回收乙醇，在蒸至1/2-1/3体积时加入纯水约原 体积的1/4，待馏出液乙醇< 10%时止，加纯水至沙棘叶用量的3-4倍(W/V)，再加澄清剂并 加热至60-70°C，搅拌30分钟后，快速冷却，离心分离(管式离心机，15000r/min)，弃去沉淀 物。上清液用AB-8大孔树脂吸附；然后用大量纯水淋洗树脂柱，直至流出水液无色透明；接着用50%乙醇和70%乙醇洗脱，合并洗脱液，并且在50°C真空减压回收乙醇；浓缩液喷雾干燥；获得成品。取250克脱脂沙棘叶完成整套操作，最后得到沙棘叶黄酮提取物10. 0876克，该提 取物用南京泽朗医药科技公司所提供的黄酮测定方法，测得其黄酮含量=21. 6%。根据以上结果，可以计算得100克沙棘叶的提取物(X)250 克10. 0876 克=100 克X X = 4. 0350 克(含黄酮 21. 6% )说明100克沙棘叶可提取到4. 035克含黄酮21. 6%的提取物，即得率为4. 03%。 如前所述，本发明的沙棘叶黄酮提取物的得率是3-4% ；产品的叶黄酮纯度在20%以上，其 中含纯黄酮物质=4. 0350X21.6%= 0. 8715克，S卩100克沙棘叶提取出0.8715克黄酮= 871. 5毫克，可用871. 5毫克/100克叶表示。其与现有文献中记载的沙棘叶中类黄酮含量 832mg/100克是基本一致的，其大范围即800_900mg都一致。以上结果至少可以说明，本发 明可将沙棘叶中的黄酮物质绝大部分都提取出来了。
本发明公开了一种沙棘黄酮提取纯化方法，包括以下的步骤提供原料，脱脂，稀碱提取，过滤，滤液调节pH，离心分离，沉淀物进行醇溶超声波提取，离心分离，回收乙醇，加纯水稀释并加澄清剂处理，离心分离，清液树脂吸附，水洗，乙醇脱洗，洗脱液浓缩，干燥，获得产品，本发明是碱提酸沉醇溶工艺组合联用，并优化了各自的最佳工艺条件，再运用其他工艺如澄清剂处理，大孔树脂吸附富集等重要步骤。将每一步的条件优化，最后组成一套完整的沙棘叶黄酮提取纯化工程；该工程不是醇提也不是水提，并且也不是简单的碱提，因为其后还有超声波醇溶等步骤，这一套完整的工程在现有技术中是没有记载的。