专利名称：核基因置换培育三棱柱蜜果新品种的方法 原产于墨西哥的一种仙人掌科三棱柱属蜜果(Hylocereus undatus Britt Rose)又称芝麻果，三棱柱蜜果，是仙人掌科三棱柱属植物的一种果实，在植物学分类上属于仙人掌科柱状仙人掌亚科三棱柱属，为半攀缘性多年生肉质植物，人工栽培历史已有几百年。三棱柱蜜果的果皮呈红色，果皮长有红色长形鳞片，果肉均匀分布有芝麻状的种籽，果肉的颜色有白色、黄色、红色，果实和茎都可食用。由于三棱柱蜜果营养丰富，容易栽培，汁多味浓、清甜爽口，富含维生素A1、B1、B2、B3及C，含有钙、锌、铁、镁和磷等元素，食用能起到清肝、滋肺、润肠等作用，还有药用价值，近年来开始引进我国南方种植，但目前由于优良品种较少，只有白色果肉的三棱柱蜜果在市场上销售，价格也较高，红色、黄色果肉的三棱柱蜜果产量较高，味道也比白色果肉的三棱柱蜜果好，但种植要求条件较高，引种后不适应当地气候和土壤条仵，品种易发生变异。由于三棱柱蜜果原产于热带沙漠地区，是较耐旱的植物，喜湿怕涝，喜温怕寒，喜光怕阴，较适应炎热干旱的气候，适宜生长温度为15--40℃，因而只能在热带地区栽培，我国属温带、亚热带地区，只有南方的广西、广东、台湾、福建、海南、云南等地区可以种植，但开花结果的时间相对缩短，一般每年只有3-4个月，冬天气温下降至5℃以下时易受冻坏死，而且受土壤，气候的影响，其生长速度也比原产地慢，含糖量也不高，大多数白色果肉的三棱柱蜜果含糖量都在8-12％之间，虽然药用营养价值相当，但有的品种口感也不太好。技术内容为了使原产于中美洲地区的三棱柱蜜果能适应我国地处热带、亚热带地区的华南各省种植，并且克服原有果实的产量低，品质差，含糖量低，开花挂果期短，以及不大适应红色和黄色粘土的山坡土地生长的状况，本发明人于2001年09月10日向中国知识产权局申请了“三棱柱蜜果新品种的培育及其天然色素的提取方法”的发明专利，<专利申请号>01128447，<公告号>1341345，<公告日>2002年03月27日，<发明人>黄吉森、宋开泉、蒙奇同、来光业。该发明涉及一种培育植物新品种的方法以及从该植物的果实提取色素的方法，是将原产于南美洲的三棱柱蜜果作为接穗，采用生长在中国华南地区的生命力极强的同属野生种属植物番鬼莲作为砧木，经嫁接后，培育出一种三棱柱蜜果新品种—红龙果、黄龙果、火龙果，这种三棱柱蜜果新品种保持了耐旱、耐热的品质，也表现了耐寒，耐贫脊、也耐涝的新的种质，其生长速度快，营养丰富，果肉多汁，低聚糖的含量高，可抑制胆固醇过高和脂肪吸收，还能减缓人体血液对葡萄糖的摄取，具有降血糖、血脂的作用，该发明还公开了从该植物的果实提取色素的方法，是将红色或黄色三棱柱蜜果洗净去除鳞片和果柄，将其放到切碎机中切碎粉碎，用水提法或醇提法提取红色或黄色色素，或者水提法加醇提法提取红色或黄色色素。该发明专利采用生长在中国华南地区的生命力极强的同属野生种属植物，经嫁接后，培育出一种三棱柱蜜果新品种——红龙果、黄龙果、火龙果，并成功使其种植开始进入实施阶段，走进了贫困山区和石山地区，成为农民脱贫致富的一个新项目，同时，通过将鲜艳颜色的红果肉的红龙果和黄果肉的黄龙果进行提取天然色素的试验，已取得了相应的粗产品，为三棱柱蜜果的综合开发找到了一种更好的出路。但本发明人发现采用原来的嫁接法还存在许多不足之处，1、嫁接法需要较高水平的农业技术人员，因为掌握不好，接穗很难或不能成活；2、嫁接后要注意将接穗以下的番鬼莲幼芽去除，否则会长出不结果的番鬼莲；3、技术掌握不好时红龙果可能导致退化，在实践中我们也发现，采用同样的三棱柱蜜果接穗和番鬼莲茎条、嫁接方法和相同的管理，有的结果较大，而有的结果小，果实甜味也不统一，有时采用红色接穗嫁接后会出现结果是白色果肉的现象，这就是红龙果和番鬼莲好的基因没有在同一块大田上充分显示出来的缘故。本发明人正是在原有01128447专利的基础上，又经过了研究和探索，采用基因工程法产生核基因置换培育三棱柱蜜果，特别是红龙果、黄龙果新品种的新方法，使培育出来的三棱柱蜜果品质和生长性能更稳定、对寒冷气候的适应性更好，栽培也更容易。本发明的技术方案是本发明所采用的方法是核基因置换培育法，它是选择自然野生种质的剑花(番鬼莲)作为野败型雄性不育系，南美洲的优质三棱柱蜜果植株作为保持系和恢复系，将三棱柱蜜果的雄花粉授到剑花的雌蕊上，使剑花长出果实，严格进行遴选育出恢复育性的杂交种子，再将育出的种子播种，选育出的不育植株作为新母本，再将三棱柱蜜果的雄花粉授到新母本的雌蕊上，经过三到若干代的杂交，培育出稳定而纯净的不育系，然后再用纯合后的不育系作为接穗，三棱柱蜜果同源种质植株作砧木，进行嫁接或无性繁殖，使本身父本的优良性状重现而表达。通过这样的杂交使其基因交互、累加于后一代而获得某些数量性状突破双亲原有性状，使其出现比双亲更有利的新性状。以上所述的核基因置换培育三棱柱蜜果新品种的方法，采用雄花粉的三棱柱蜜果品种为红色或黄色、白色果肉。如果每次选择不同颜色的父本，最后培育得到的三棱柱蜜果品种有多种颜色，可能介于黄色和红色、白色之间，如橙红、粉红、淡紫等，可给市场带来丰富多彩的三棱柱蜜果新品种。以上所述的核基因置换培育三棱柱蜜果新品种的方法还包括花期相遇控制技术，具体方法是①掌握好父母本的开花习性、最佳杨花期。以母本对温度、湿度、阳光等因素的要求和当地气象资料，选择最佳的授粉季节调节种植时间，且把父本的种植用相间时差分批下种，让其开花时间产生错开，使父母本花期相遇。
②以施放不同肥料成分控制花芽分化时间，以钾素促杨花提前，施氮素延缓开花延后，充分促控三棱柱蜜果开花时间，尤其充分利用该果20天左右开花一次的特性，使父母本花期相遇有更多机会。
③控温促控花期相遇三棱柱蜜果开花习性有一与众不同的特殊性，即当三棱柱蜜果花芽已恰好化，花器已形成时，如遇气温骤冷，连续阴雨，长期低温等条件时，花芽可转化成叶芽，如花芽化变刚开始气温恢复后该芽又可逆变为花芽，这一特性为控温调节花期相遇很有帮助。
④极限温度调控可调节花期相遇三棱柱蜜果有不定期的休眠特点，其休眠的临界温度为10℃和38℃，处于此两个临界温度时，三棱柱蜜果将进入休眠状态而停滞不生长。而解眠的温度为12℃和35℃，能正确控温、可以有计划地调节父母本的花期相遇达到异花授粉的目的。
从公开文献和上述的背景技术，我们了解到我国华南地区天然生长的仙人掌科三棱柱属的剑花藤蔓性植物(俗称番鬼莲、过江龙、霸王花等)，是一种既耐热、耐寒、耐涝、耐肥、不怕贫脊、能适应各种土壤生长的天然野生种质植物。常见在荒山野岭、石山泥缝、断墙及水泥壁上攀扶生长，甚至于几十米高的其他树顶冠上也能悬空生长，长势旺盛并能开出艳丽的花朵。剑花的枝条、花朵当地居民均有食用习惯，并具有清热解毒等一定的药用功能，广西、广东不少地方也有人工种植采收花朵作汤饮食佳品。然而剑花只开花不长果，有生物学基础的人们很容易从它的花朵中观察到，虽然剑花是雌雄同花，应具有自花授粉条件。然而剑花的雄蕊发育不正常、不能产生有功能的花粉，无散粉授精能力。但雌蕊发育正常，能接受正常外来花粉而受精正常挂果，属自然突变雄性不育株，这种天然细胞质遗传的典型野败型雄性不育株确难找到，这对于利用三系杂交育种具有重要的现实意义，为本发明打下了不育系的物质基础，能作为项目的母亲本。
三棱柱蜜果雌雄同花，花蕊发育正常，能自交结实，并能把其花粉授给不育系能恢复育性，是比较理想的剑花同源配的父本株，可作杂交育种的目标性状亲本应用。
本发明的核基因置换培育三棱柱蜜果的方法的理论依据是袁隆平杂交水稻理论即三系法制种法，即用人工选育出不育系、保持系和恢复系是获得大量杂交第一代种子的有效途径，这种育种是当前最常用、最省事、见效快的一种育种途径，它为杂种组配提供了丰富的物质基础。
这种技术方案的机理在于根据作物在长期的自花授粉后有的稳性状已被自然选择或人工选择而淘汰，因此后代很少出现有害性状，也不会出现生活力显著降低现象。但由异花受粉的杂交的杂合体，其有害的隐性基因常被显性等位基因所掩盖，因此不表现出来。为此要获得纯净而稳定的新品种必须应用多次回交的方法，使细胞质基因和核基因共同作用，通过基因重组使有害的隐性性状充分暴露出来，并经选择淘汰，最终选留出优良性状的新品种。这种多次回交的方法就是核基因置换的过程。我们应用这一机理采用野败型雄性不育株——剑花作母本而采用墨西哥优质三棱柱蜜果作父本，通过异花授粉有性杂交，并多次回交，把父本的细胞核基因转移到母本细胞质去，让母本的细胞质和父本的细胞核基因互相作用，导致纯合培育出稳定而纯净的不育系。然后再用纯合后的不育系作为接穗，三棱柱蜜果同源种质植株作砧木，进行嫁接或无性繁殖，使本身父本的优良性状重现而表达，再严格进行遴选育出恢复育性的杂交种子。
以下详细说明本发明的具体细节和三棱柱蜜果新品种的制作方法
1、“目的基因”的获得经遴选品尝出南美洲三棱柱蜜果口感好、产量高、性状好的品种，引入于相应生态环境的大田作立柱高架栽培，作为父本基因植株，待其完成生长期转入生殖期开花时，提取花粉作异花授粉经母本雌蕊上，而获得“目的基因”。
2、选取适宜的运载体，引入“目的基因”定居把品质优良，枝条粗壮的天然野生“剑花”茎条插枝于含沙量50％以上的土壤上，以水泥柱立柱作高架栽培，供足水、肥、精心护理，形成树冠，待花芽分化，花器形成，花期相遇时取父本花粉进行异花授粉散布于雌性花蕊上，让母本恢复结实获得杂交第一代种子。
3、“目的基因”的扩增植物的性状主要是由细胞核所决定，而母本是细胞质遗传，因此不育系的细胞核来自保持系父本，故不育系和相应的保持系就形成了性状基本相似的“双胞胎”，但父母本一次杂交细胞内基因的重组一部分来自父本，一部分来自母本。因此杂种第一代父本细胞核只占50％，为此要获得纯净、稳定的杂种后代，必须进行多次回交，进行核基因置换，把父本的细胞核不断转移到母本细胞质中去，达到“目的基因”的扩增。
4、建立重组DNA分子无性繁殖表达“目的基因”所控制的性状用引进的三棱柱蜜果良种作砧木，纯合后的不育系母本作接穗通过嫁接作无性繁殖，让重组基因得到表达，严格选出可育的优良植株作为新品种。
5、培育新品种的推广应用采用扦插或组织培育方法可大量繁育出新品种而应用推广。


图1是恢复基因选育示意图。
图2是核基因置换示意图。
如图1所示，母本(剑花)不育系F1×父本(三棱柱蜜果)有恢复能力可以得到不育、可育有分离、可育无分离三种，只有可育无分离用于扦插繁殖和组培繁殖。
如图2所示，母本(剑花)不育系与父本(三棱柱蜜果)进行第一次杂交得到的父本基因为50％，第二次杂交得到的父本基因为75％，经过五次杂交得到的父本基因为98.4375％，基本达到了要求。
用本发明核基因置换培育三棱柱蜜果的方法培育出的三棱柱蜜果新品种与已有的品种相比，其突出的实质性特点和显著的进步是1、新品种三棱柱蜜果有优越的遗传基础表现在杂种优势得到充分展示，提高了生活力、优质、持续、高产、多抗①提前开花挂果，杂种植株移载后8-10个月即能开花挂果。挂果期由5月-11月没有明显分季。
②种植地域广阔南方露地种植，北方可以采用大棚种植，最低极限温度为2℃，一般在12-35℃温度下都能正常生长。
③品质优良三棱柱蜜果的食用、药用功能及性状能完整地保留下来。经分析检验，父本的所有技术数据均能保持不发生变异。
④产量高当年载种满10个月后即能挂果，头年产量亩产500公斤，次年达1500-2000公斤，第三年进入高产期产量5000-6000公斤以上，持续高产达20年以上。
⑤果实大、结实率高，单果重400-500克以上，最重达1000克，果品汁多味浓，清甜爽口，糖度16％-20％。
2、三棱柱蜜果有协调的形态结构新品种红龙果根系发达，分蘖力强、茎杆粗壮，果大粒多，结实率高有较好的协调形态结构。
①根系发达，根质和根量优势明显表现在根多、根长、根粗、发根力强、根系广布。
②分蘖能力强分蘖早、长蘖快，主茎和分蘖大小差异不明显，形成整齐一致的高产群体结构。
③茎粗、壁厚、耐肥、茎长势旺盛，最高峰期在适当温度、水分、肥料、阳光充足的条件下枝条每天伸长2-2.5公分以上。
④果大粒多一般每杆水泥柱长果30-40个以上，单果重0.5-1公斤。
3、新品种三棱柱蜜果有旺盛的生理机能①能快速形成大面积覆盖的树冠因此光合效率较高，干物质积累多，年产果约8次，从开花到成熟收获，南方地区约40天，北方地区约45天一批次。
②根系活力强，根的通气低，利于氧气的输送，而氧气供给充足，增强了根呼吸机能和养分吸收能力，由营养器官向顶端生长点转动营养物质多，因此挂果集中于枝条的末梢为多，顶端接收营养成分能力强盛，是果多、果大、果重的生理因素之一。
此外，野败雄性不育株的发现，利用于杂交育种可免除了大面积繁殖制作的大量去雄工作，节约人力，降低种子成本，保证杂交种子纯度、对杂种优势的利用十分有利。
4、培育得到的三棱柱蜜果品种有多种颜色新品种三棱柱蜜果的果肉颜色可能介于黄色和红色、白色之间，如橙红、粉红、淡紫等，可给市场带来万紫千红的三棱柱蜜果新品种。
5、新品种三棱柱蜜果是一种营养优良的水果采用基因工程法产生核基因置换培育三棱柱蜜果，是一种优良的水果新品种，有治疗高血脂、糖尿病等药用价值，具体表现在①含有植物性白蛋白——人体内重金属解毒剂仙人掌蜜果中含有丰富的植物白蛋白，当该植物白蛋白被人们摄入体内后，白蛋白就会自动将重金属离子吞噬，并且迅速地形成一个覆盖于重金属表面的坚硬化合物外壳，避免食物中重金属在肠胃内被消化系统的消化吸收，阻断了重金属对其他健康细胞的侵害，最终经由排泄器官快速、顺利地排出体外，因此白蛋白起到了清除人体内重金属的解毒作用。
②含有较多的花青素——抗氧化、抗自由基、防衰老剂三棱柱蜜果含有丰富的花青素。这是一种抗氧化剂，其抗氧化以力优于胡萝卜素强10倍以上，并能受热量及时间的考验不易变质。当人们摄入花青素后，花青素能在人体内血管停留70-75小时以上，充分发挥其抗氧化能力，抗自由基，防衰老作用并与本身的维生素C相辅效果更显著，常使食用者皮肤表层脆化延缓，增加柔润，光亮、滑嫩，对皮肤美容效果突出。
花青素还具有一个最特殊的功能是穿透人脑血管障碍而提高脑细胞防止变性能力，从而抑制痴呆症的发生。
③富含水溶性膳食纤维——辅助糖尿病治疗保健剂三棱柱蜜果含有丰富的水溶性食用纤维成分，该物质在体内能大量吸收水份而使本身体积增大10-15倍，膨胀的纤维素会形成凝胶状物质而结合体内的食物，延长了食物在人消化系统的滞留时间，减缓饥饿感，这点有利于减肥。由于水溶性膳食纤维凝胶结合了食物，致使食物中由淀粉转化成糖分的时间延缓，因此释放糖的速度减缓，跟着人体对糖的吸收速度减慢，存入小肠的糖分甚少，血液中不会出现突发性高血糖现象，人体的耐糖程度也相应提高，使人体糖分转化吸收机理性功能获得自动调节和平衡。减少了过剩糖渗入排泄系统排出体外现象，因此三棱柱蜜果对糖尿病者的保健作用显著，另外水溶性膳食纤维的大幅度体积膨胀，人体的粪便的比重增加，加快了排泄速度，粪使中有毒物质在大肠停留时间缩短，减轻和避免大肠发生肠炎以及致癌可能性，对于通便润肠具独特功能。
④三棱柱蜜果是不用农药化肥的环保型产品仙人掌蜜果的细胞渗透压低于一般农作物。一般植物的细胞渗透压约18个大气压左右，而仙人掌蜜果的细胞渗透压仅12个大气压，因此当施肥过程中，无机肥盐分超过3‰，则可能出现反渗透的负面反应，因此在栽培三棱柱蜜果整个过程中几乎不能施用化肥，其肥料来源只依靠农家肥的施用供给。
三棱柱蜜果由于没有叶子，三棱柱的枝条有薄层细胞及厚腊层的包裹，因此，植株能防止蝇叮虫咬，在整个种植的果园也没有发现特定的昆虫为害及病害发生，不用喷施农药，因此，该果确是当前无公害、环保型的绿色食品典型品种。
⑤新品种红龙果是纯天然红色、黄色色素资源宝库新品种的红龙果红皮红肉，含有丰富的玫瑰红色，黄龙果色素的颜色鲜亮，该天然色素无毒无害很有开发价值，若能加工，将能大幅度增加三棱柱蜜果的附加产值，扩大经济效益和社会效益。

实施例1选择自然野生种质的剑花作为野败型雄性不育系，南美洲的优质红色果肉三棱柱蜜果植株作为保持系和恢复系，将三棱柱蜜果的雄花粉授到剑花的雌蕊上，使剑花长出果实，严格进行遴选育出恢复育性的杂交种子，再将育出的种子播种，选育出的不育植株作为新母本，再将三棱柱蜜果的雄花粉授到新母本的雌蕊上，经过6代的杂交，培育出稳定而纯净的不育系，然后再用纯合后的不育系作为接穗，三棱柱蜜果同源种质植株作砧木，进行嫁接及无性繁殖，使本身父本的优良性状重现而表达，得到红色果肉的三棱柱蜜果新品种。本发明人将该品种命名为“中华红龙果”，“广西红龙果”。
实施例2选择自然野生种质的剑花作为野败型雄性不育系，南美洲的优质黄色果肉三棱柱蜜果植株作为保持系和恢复系，将三棱柱蜜果的雄花粉授到剑花的雌蕊上，使剑花长出果实，严格进行遴选育出恢复育性的杂交种子，再将育出的种子播种，选育出的不育植株作为新母本，再将三棱柱蜜果的雄花粉授到新母本的雌蕊上，经过7代的杂交，培育出稳定而纯净的不育系，然后再用纯合后的不育系作为接穗，三棱柱蜜果同源种质植株作砧木，进行嫁接及无性繁殖，使本身父本的优良性状重现而表达，得到黄色果肉的三棱柱蜜果新品种。本发明人将该品种命名为“中华黄龙果”或“广西黄龙果”。
实施例3选择自然野生种质的剑花作为野败型雄性不育系，南美洲的优质红色和黄色、白色三种果肉的三棱柱蜜果植株作为保持系和恢复系，将三棱柱蜜果的雄花粉授到剑花的雌蕊上，使剑花长出果实，严格进行遴选育出恢复育性的杂交种子，将育出的种子播种，选育出的不育植株作为新母本，再将三棱柱蜜果的雄花粉授到新母本的雌蕊上，每次采用的父本的雄花粉颜色分别为不同颜色果肉(红色或黄色、白色)的植物，经过7代的杂交，培育出稳定而纯净的不育系，然后再用纯合后的不育系作为接穗，三棱柱蜜果同源种质植株作砧木，进行嫁接及无性繁殖，使本身父本的优良性状重现而表达，得到有多种颜色，如粉红或橙红色果肉的三棱柱蜜果新品种。本发明人将该品种命名为“中华彩龙果”或“广西彩龙果”。


一种培育三棱柱蜜果新品种的方法，采用核基因置换培育的方法得到，具体过程是选择野生剑花作为雄性不育系，优质三棱柱蜜果作为保持系和恢复系，将三棱柱蜜果的雄花粉授到剑花的雌蕊上，使剑花长出果实，将育出的种子播种，选育出的不育植株作为新母本，再将三棱柱蜜果的雄花粉授到新母本的雌蕊上，经过三到若干代的杂交，培育不育系，再用纯合后的不育系作为接穗，优质三棱柱蜜果植株作砧木，进行嫁接及无性繁殖，培育出的新品种根系发达，分蘖力强、茎杆粗壮，果大粒多，果实品质优良，味道鲜美，有治疗高血脂、糖尿病、防衰老的药用价值，还可以得到介于黄色和红色、白色之间的橙红、粉红、淡紫果肉等丰富多彩的三棱柱蜜果新品种。