专利名称：：一种藏药洪连提取物及其应用的制作方法：藏药洪连，又名藏黄连，属兔耳草属植物，主要分布在甘肃西南部、青海东部及西藏等地。生长于海拔30006000米的高山草甸的乱石堆碎石地带。《藏药志》记载洪连全草具有清热解毒，治血旺、急慢性肝炎、肺病、高热的功效；《中华药海》记载洪连全草可以治疗肺炎、肝炎；《全国中草药汇编》记载洪连全草具有治疗肺炎、高血压、乳腺癌的功效；《新华本草纲要》及《抗癌中草药大词典》中均记载洪连全草具有抗乳腺癌及纵隔癌的作用。虽然民间早就证明洪连全草具有抗癌的功效，有人在近期发现红连的总提取物也具有一定的抗癌功效，但具体是洪连的那一类成分在行使抗癌的功效却鲜有研究，目前仅有张雪等研究发现洪连的苷类可以抑制肺癌细胞增殖，并诱导其凋亡。现有文献中尚未发现洪连苷类作用于其它肿瘤细胞的报告，同时对洪连苷类提取物、提取方法也未见报道。本发明提供了一种藏药洪连总苷提取物的提取制备方法及其在治疗胃癌药物中的应用。参考文献1《抗癌中药大词典》，刘村安，彭明。湖北科学技术出版社，1994，32《中华药海》，冉先德。哈尔滨出版社，1993，83《藏药志》，中国科学院西北高原生物所，青海人民出版社，1991，114《全国中草药汇编》，谢宗万，《全国中草药汇编》编写组，人民卫生出版社，19965张雪。兔耳草的小鼠体内抑瘤作用及其抑瘤机理研究，吉林大学硕士论文，20016金兰，陈志。短管兔耳草抗癌作用的研究，青海师范大学学报(自然科学版)，2006(2):85-8
本发明涉及的洪连提取物是洪连总苷，包括脱去提取物中部分脂类杂质成分后的产物以及它们的应用。本发明的洪连提取物的提取方法，是将洪连的全草粉碎，将其置入乙醇中，或者置入乙醇水溶液中，用回流或室温渗漉，提取液蒸去乙醇后将所得的浸膏溶解，液体用石油醚或乙醚洗涤。再对水相用水饱和的正丁醇或戊醇反复抽提，合并抽提液，减压蒸馏浓縮，得到固体状总苷。或者，将洪连全草粉碎，用甲醇或乙醇提取，提取物蒸馏后再溶于少量甲醇或乙醇中，逐滴加入数倍于醇体积的丙酮、乙醚或丙酮乙醚的混合溶剂中，边加边摇，总苷可成粉质析出，抽滤，干燥，得到固体状总苷。或者，将洪连全草粉碎，用甲醇或乙醇提取，浓縮提取物，在浓醇溶液中加入新煅烧过的氧化镁拌匀，烘干，磨碎，用甲醇或乙醇抽提，浓縮抽提液，得到固体状总苷。采用本发明所提供的洪连总苷提取物处理人胃癌MGC-803，结果抑制了人胃癌MGC-803的增殖，并诱导其凋亡。这些结果提示本发明所提供的洪连总苷提取物可以在制备胃癌治疗药物中应用。具体实施例方式实施例一洪连总苷提取物的提取方法l将洪连的全草粉碎，过40目筛，备用。将经上处理的洪连草粉200g置入四倍量体积的70。/。乙醇溶液中，反复加热回流三次，合并提取液后将提取液用旋转蒸发仪蒸去乙醇，所得的浸膏用温水溶解，所得液体用石油醚洗涤，直至石油醚相或乙醚相透亮颜色不再变化为止。再对水相用水饱和的正丁醇或戊醇反复抽提至抽出液蒸干后残渣很少为止，合并抽提液，用水洗去还原糖，减压蒸馏浓縮，得固体状总苷。实施例二洪连总苷提取物的提取方法2将洪连全草粉碎，过40目筛，备用。将经上处理的洪连草粉200g用四倍体积的甲醇溶液加热回流提取，提取物蒸馏后再溶于少量甲醇中，逐滴加入数倍于醇体积的丙酮中，边加边摇，总苷成粉质析出，抽滤，干燥，得到固体状总苷。实施例三洪连总苷提取物的提取方法3将洪连全草粉碎，过40目筛，备用。将经上处理的洪连草粉200g用四倍体积的70。/。乙醇溶液提取，浓縮提取物，在浓醇溶液中加入新煅烧过的氧化镁拌匀，烘干，磨碎，用甲醇或乙醇抽提，浓縮抽提液，得到固体状总苷。实施例四洪连总苷提取物抑制肿瘤细胞增殖细胞系人胃癌MGC-803。试验药物将洪连总苷提取物用O.P/。DMS0配成12mg/ml。细胞培养人胃癌MGC-803细胞株培养于RPMI-1640完全细胞培养液中，培养液中含10%灭活小牛血清、L-谷氨酰胺2mmol/ml、青霉素和链霉素各100U/L。实验将培养于RPMI-1640完全细胞培养液中的指数生长期细胞，以1.0Xl(^个/ml的浓度接种于96孔塑料板，每孔100yl，以不加药物仅加O.P/。DMSO的试验组为阴性对照组；药物实验组分为五组，各组所加的洪连总苷浓度分别为12mg/ml、10mg/ml、8mg/ml、6mg/ml、4mg/ml。另设空白组、即不加药物，而仅以RPMI-1640完全培养液代替细胞。再将以上阴性对照组、药物组和空白组置于37。C、5。/。C02饱和湿度的培养箱中培养24h、48h、和72h，实验终止前4小时在每个实验孔中加入MTT液10yl，孵育结束时弃去上层清液，所余物加入DMSO150yl，再用振荡器摇匀，用酶标仪于570nm波长处测定各孔0D值。按下式求出抑制率抑制率(％)=(对照组OD均值-实验组OD均值)/对照组OD均值X100%洪连提取物对胃癌细胞MGC-803增殖实验结果见表1表l洪连总苷抑制胃癌细胞MGC-803增殖的结果(n=6x±s与对照组比较p〈0.05)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>结果表明，洪连总苷提取物可以抑制MGC—803细胞增殖实施例五洪连总苷提取物诱导肿瘤细胞的凋亡细胞系人胃癌MGC-803。试验药物将洪连总苷提取物用O.P/。DMS0配成12mg/ml。细胞培养人胃癌MGC-803细胞株培养于RPMI-1640完全细胞培养液中，培养液中含10%灭活小牛血清、L-谷氨酰胺2mmol/ml、青霉素和链霉素各100U/L。实验将生长于RPMI-1640完全细胞培养液中的指数生长细胞，以1.0Xl(^个/ml的浓度接种于75ml的细胞瓶中，每瓶8ml。以不加药物仅加O.P/。DMSO的试验组为阴性对照组；药物组所加洪连总苷提取物浓度分别为6mg/ml，4mg/ml。经洪连总苷提取物处理48h后，对受试细胞进行的流式细胞仪测定中还发现，在GoAh峰前出现了凋亡峰，凋亡率分别为14.9%和7.6%，而对照组细胞的GoAh峰前却无此现象，结果见表2。表2洪连总苷提取物对MGC-803细胞凋亡及细胞周期分布的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>结果表明洪连总苷提取物能诱导细胞凋亡，产生抗胃癌的作用。因此洪连总苷可以作为一种抗胃癌的药物，或者作为抗胃癌药物的原料应用，也可应用在其它肿瘤治疗药物中。权利要求1.一种藏药洪连提取物，其特征是该提取物为洪连总苷。2.根据权利要求l所述的洪连总苷提取物，其特征在于将所得的总苷脱去了脂类、糖类等成分。3.根据权利要求1至2所述的洪连总苷提取物的提取方法，其特征是将洪连的全草粉碎，将其置入乙醇中，或者置入70%95%乙醇水溶液中，用回流或室温渗漉，提取液蒸去乙醇后将所得的浸膏溶解，再用石油醚或乙醚洗涤，直至石油醚相或乙醚相透亮颜色不再变化为止。再对水相用水饱和的正丁醇或戊醇反复抽提至抽出液蒸干后残渣很少为止，合并抽提液，用水洗去还原糖，减压蒸馏浓縮。4.根据权利要求1至2所述的洪连总苷提取物的提取方法，其特征是将洪连草全草粉碎，用甲醇或乙醇提取，提取物蒸馏后再溶于少量甲醇或乙醇中，逐滴加入数倍于醇体积的丙酮、乙醚或丙酮乙醚的混合溶剂中，边加边摇，总苷可成粉质析出，抽滤，干燥。5.根据权利要求1至2所述的洪连总苷提取物的提取方法，其特征是将洪连全草粉碎，用甲醇或乙醇提取，浓縮提取物，在浓醇溶液中加入新煅烧过得氧化镁拌匀，烘干，磨碎，再用甲醇或乙醇抽提，浓縮抽提液。6.根据权利要求1至5所述的洪连总苷提取物，其特征在于该提取物可以在制备胃癌及其它肿瘤治疗药物中应用。全文摘要洪连是生长于西藏、青海、甘肃、新疆、内蒙古等地的玄参科兔耳草属的药用植物。本发明涉及了洪连总苷提取物的提取方法及其在癌症治疗上的应用。本发明所提供的洪连总苷提取物的提取方法是将洪连全草粉碎，用乙醇、甲醇等提取，再用石油醚等脱脂，正丁醇萃取，得到洪连总苷。本发明所提供的洪连总苷提取物能够抑制胃癌细胞的增殖，并诱导胃癌细胞的凋亡，可在制备胃癌治疗药物中应用。文档编号A61P35/00GK101310742SQ20061020102公开日2008年11月26日申请日期2006年10月26日优先权日2006年10月26日发明者张春江,李红玉,王晓琴申请人:兰州大学