专利名称：芦笋茎枯病苗期抗性鉴定方法P笋{Asparagus officinalis Lirme)又称石刁柏，百合科天门冬属，是世界十大名菜之一，在国际市场上被称为“蔬菜之王”。由于其营养价值高，并能润肺、镇咳、祛痰， 具有抑制肿瘤生长的药理功能，深受人们的喜爱。近年来，随着芦笋市场与栽培面积的扩大，在生产上病害的发生也逐年增加，尤其茎枯病的严重发生已严重影响了芦笋的产量与质量。其病原菌为天门冬拟茎点霉D^offlOASi1S asparagi (Sacc. ) Bubak]，是一种世界性分布的毁灭性病害，在中国、日本、泰国、印尼等亚洲芦笋种植国家发生比较严重，欧美发生则比较少，只有零星报道。芦笋茎枯病已发展成为我国芦笋产业的限制性因子之一。初步鉴定，它是由真菌天冬拟茎点菌引发的茎部病害。在亚洲尤以中国发病最为严重，我国台湾、广东、广西、福建、浙江、江西、江苏、上海、安徽、湖北、四川、陕西、河南、山东、河北、辽宁、黑龙江等芦笋生产省份均发生普遍，轻者生长发育不良，降低产量与品质，重者病株提前枯死，全田毁灭，严重影响芦笋生产与创汇。本专利旨在系统建立芦笋茎枯病抗性鉴定方法，并用该方法筛选芦笋抗病种质资源。目前，国内学者在芦笋茎枯病的症状、病原、侵染循环、田间发生规律及防治方法等方面开展了不少的研究工作。芦笋茎枯病症状研究已比较清楚，研究发现茎枯病主要发生在芦笋茎枝上，有时也发生在拟叶上，但果实上未见病斑，重症株地上枯死甚至根盘腐烂；在不同环境条件下，茎秆上可形成两种不同类型的病斑一是急性型病斑，二是慢性型病斑，二者形态上有一定区别(苗华民，1991 ；康业斌等，1999)。病原菌的形态特征与生物学特性，研究报道不少，形态特征基本清楚，菌丝生长条件明确，但茎枯病原菌鉴定结果尚存争议，国内大多认为芦笋茎枯病菌为天门冬拟茎点霉菌[/^ffiOASi1S asparagi (Sacc.) Bubak](刘克均等，1991 ；章月梅等，1996)。芦笋茎枯病菌侵染循环研究表明，病菌主要主要以分生孢子器和分生孢子、菌丝体在田间病残体重越冬，成活，适宜条件下进行初次侵染，再次侵染(陈光宇，2005)。田间发生规律与流行因素基本阐明，不同生态区的芦笋主产区有所不同，气候条件、栽培条件、品种特性等是主要影响因素(叶晓辉等，2009)。病害防治技术研究(孙淑建等，2002 ；王政逸等，1995 ；盛全学等，2007 ；李术臣等，2009报道非常多，但比较零散，缺乏系统和全面的论述，主要以化学防治为主，开展了药剂筛选与药效试验(林佩力等，1995 ；胡翠凤等，1996 ；施德等，1997 ；罗时华等，2003 ；徐玉恒等，2005 ；张金良等，2007)、拮抗菌筛选(陈福如等，1995 ；马利平等，2008)、与对杀菌剂敏感性(郑元梅等，1995;陈新建，1999)等试验，农业措施防治已为人们所接受，最近几年兴起设施栽培避雨防病和生物防治。而关于芦笋茎枯病菌的侵染过程和致病生理生化机制、寄主的抗病机制尚未见有报道，在侵入和致病过程中，病菌分泌的角质酶、纤维素酶和果胶酶及毒素等可能起重要作用，加强这些方面的研究将有助于进一步认识病害的本质和抗病品种的选育，并在病害防治上取得更大成功。国外研究报道极少，1991年UECKER对芦笋茎枯病菌的形态学及分类地位进行了报道，2001年澳大利亚报道发生芦笋茎枯病(DaViS，2001)。培育和利用抗性品种是植物病虫害综合防治中的最安全环保最为经济有效的措施和关键技术，这也是今后芦笋茎枯病综合防治研究的发展方向和迫切需求。进行芦笋抗茎枯病育种，首先需要抗性种质资源，探明寄主的抗性遗传规律才有助于抗性性状的遗传改良。而芦笋茎枯病的抗性鉴定方法国内外尚无公开报道。本专利将系统建立芦笋茎枯病苗期鉴定方法，并用该方法筛选芦笋种质资源。
本发明的目的在于建立芦笋茎枯病的苗期抗性鉴定方法，提供一种简便、有效、准确的抗性鉴定方法。为了达到以上目的，本发明采用如下技术方案 1.分级标准的制定制定了苗期接种的4级分级标准0级无发病；1级发病面积占株冠面积的10%以下；2级发病面积占株冠面积的11%_30% ；3级发病面积占株冠面积的31%-50% ；4级发病面积占株冠面积的50%以上。2.接种方法的筛选以江西省农科院创制的芦笋品种作为供试材料，比较成菌丝块基部接种法、菌丝块中部接种法、菌丝块中基部接种法、孢子喷雾法等4种接种方法的优劣，选择一种最为灵敏、 有效的方法，用于芦笋抗性鉴定方法的建立。具体方法如下 (1)菌丝块基部接种法选择1月龄的芦笋幼苗10-20株作为实验对象，将芦笋幼苗钵置于50厘米长30厘米宽的塑料盘平放，将5毫米直径的菌丝块放置到芦笋茎的基部，喷无菌水保湿，并用保鲜膜覆盖，25- ！黑暗培养2天后转到玻璃恒温温室25-28 ！培养，每天喷水3次，保持湿度， 6-10天后观察实验结果。(2)菌丝块中部接种法选择1月龄的芦笋幼苗10-20株作为实验对象，将芦笋幼苗钵置于50厘米长30厘米宽的塑料盘平放，将5毫米直径菌丝块放置到芦笋茎的中部，喷无菌水保湿，并用保鲜膜覆盖，25- ！黑暗培养2天后转到玻璃恒温温室25-28 ！培养，每天喷水3次，保持湿度， 6-10天后观察实验结果。(3)菌丝块中基部接种法选择1月龄的芦笋幼苗10-20株作为实验对象，将芦笋幼苗钵置于50厘米长30厘米宽的塑料盘平放，将5毫米直径菌丝块分别放置到芦笋茎的中部和基部，喷无菌水保湿，并用保鲜膜覆盖，25-28 ！黑暗培养2天后转到玻璃恒温温室25-28 °C培养，每天喷水3次， 保持湿度，6-10天后观察实验结果。(4)孢子喷雾法
选择1月龄的芦笋幼苗10-20株作为实验对象，配制10的6次方至10的7次方个芦笋茎枯病菌强致病力菌株的孢子悬浮液，在配置好的孢子悬浮液中按每100毫升加5-10微升的比例加入吐温-20后喷雾，黑暗保湿培养2天后转到玻璃恒温温室25-28 °C培养，每天喷水3次，保持湿度，6-10天后观察实验结果。结果发现菌丝块中基部接种法相对菌丝块中部接种法和菌丝块基部接种法发病略重，但相对孢子喷雾法发病较轻，且操作操作难度较大。孢子喷雾法操作简单，发病较为迅速，易根据造成病斑的长度确定病级。因此，通过对4种接种方法的比较，本专利选择孢子喷雾法用于芦笋种质资源的抗性鉴定。3.强致病力菌株的筛选
根据平常接种的发病情况，选择来自江西的两个菌株，来自福建的两个菌株。用上述孢子喷雾法进行接种，计算病情指数，并比较其致病力，选择一个致病力最强的菌株用于芦笋茎枯病菌抗性鉴定方法的建立。每个菌株做3个重复，用新复极差法进行差异显著性分析。 用孢子喷雾法接种8-10天和16-20天后分别调查发病情况，并计算病情指数。结果表明 不同菌株存在明显的致病力分化，本专利选择致病力最强的菌株用于苗期抗性鉴定方法的建立。4.孢子悬浮液浓度的确定
分别配制10的5次方个芦笋茎枯病菌强致病力菌株的孢子每毫升、10的6次方个芦笋茎枯病菌强致病力菌株的孢子每毫升、10的7次方个芦笋茎枯病菌强致病力菌株的孢子每毫升的芦笋茎枯病菌强致病力菌株的孢子悬浮液，分别用孢子喷雾法对江西省农科院蔬菜花卉所创制的芦笋品种进行接种，在8-10天和16-20天后分别统计病级和计算病级指数。 结果表明当孢子悬浮液浓度达到10的6次方个芦笋茎枯病菌强致病力菌株的孢子每毫升后芦笋茎枯病的病情指数几乎达到稳定，而10的6次方个芦笋茎枯病菌强致病力菌株的孢子每毫升和10的7次方个芦笋茎枯病菌强致病力菌株的孢子每毫升下的病情指数明显高于10的5次方个芦笋茎枯病菌强致病力菌株的孢子每毫升的浓度，说明10的6次方个芦笋茎枯病菌强致病力菌株的孢子每毫升的浓度是芦笋茎枯病孢子喷雾法接种的最佳浓度(图 2)。5.抗性鉴定方法的验证
选择5个田间抗感差异较明显的芦笋品种，用上述建立的方法进行抗性鉴定。结果表明用本专利的鉴定结果与这5个品种的田间抗感表现相吻合，证明了本研究建立的抗性鉴定方法准确、灵敏、可靠。6.成株期与苗期鉴定的一致性分析
5个芦笋种质资源的成株期鉴定结果表明，成株期鉴定结果与苗期鉴定一致。即芦笋种质资源的成株期与苗期鉴定结果基本一致。苗期鉴定在栽培时间、鉴定时间等方面存在优势，因此本发明选择在苗期用孢子喷雾法对芦笋种质资源进行抗病筛选。7.芦笋种质资源的抗性鉴定
用本研究建立的苗期抗性鉴定方法对江西省农业科学院蔬菜花卉所芦笋创新团队提供的31个芦笋种质资源进行了抗性鉴定。在31个种质资源中，野生天门冬的病情指数均为0，为免疫种质资源；杂交一代TX-4/SD的病情指数较低为相对抗病品种，其次较抗病的是硕丰和 UC157 ；Pacific Peak, JG701,Patron,Jersey Giant 和 B3 的病情指数较高，为相对易感品种。


图1.不同芦笋茎枯病菌菌株致病力测定； 图2.孢子悬浮液浓度对病情指数的影响； 图3.田间抗感差异较显著芦笋种质资源的抗病性鉴定； 图4.芦笋种质资源的成株期鉴定。

将强致病力菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上活化，生长6天后，用5毫米直径的打孔器在菌落边缘打孔，用接种针挑取菌丝块接种到新的马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上。将接有菌丝块的马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板置于黑光灯下，25 °C全天黑光灯诱导产孢培养，共培养14天，使之产生分生孢子器。(2)孢子悬浮液的配制
将培养皿中的分生孢子器用载玻片刮下，用纱布包裹，置于8厘米直径的玻璃研钵中， 加入30毫升无菌水，用研杵轻轻捣碎，使分生孢子释放。三层纱布过滤后，用血球计数板测定孢子浓度，并加无菌水调节到需要的浓度。(3)孢子喷雾法接种
在配置好的孢子悬浮液中按每100毫升加5微升的比例加入吐温-20，混勻后，用喷雾器均勻喷到各个处理的芦笋幼苗上。25 °C黑暗保湿培养2天后，转到玻璃温室，25 °C覆膜培养，并每天喷水3次，保持湿度。(4)结果调查与分析
分别在接种8天和16天后，按照本专利建立的分级标准统计病级两次，并分别计算病情指数，采用新复极差法进行差异显著性分析。(5)抗感品种的确定
根据本专利制定的抗感指标，根据各个品种的病情指数，确定该品种是免疫、易感、抗病、中抗、感病五种类型中的哪一种。图1.为不同芦笋茎枯病菌菌株致病力测定，图1中数据为3次重复的平均值，采用新复极差法进行差异显著性分析，图上不同字母者表示在5%水平上差异极显著。图2为孢子悬浮液浓度对病情指数的影响，图2中数据为3次重复的平均值，采用新复极差法进行差异显著性分析，图上不同字母者表示在5%水平上差异极显著
图3为田间抗感差异较显著芦笋种质资源的抗病性鉴定，图3中数据为3次重复的平均值，采用新复极差法进行差异显著性分析，图上不同字母者表示在5%水平上差异极显
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者O图4为芦笋种质资源的成株期鉴定，图4中数据为3次重复的平均值，采用新复极差法进行差异显著性分析，图上不同字母者表示在5%水平上差异极显著。


一种芦笋茎枯病的苗期抗性鉴定的方法，先制定芦笋幼苗接种的四级分级标准，分级标准如下0级无发病；1级发病面积占株冠面积的10%以下；2级发病面积占株冠面积的11%-30%；3级发病面积占株冠面积的31%-50%；4级发病面积占株冠面积的50%以上；再选择1月龄的芦笋幼苗10-20株作为实验对象，配制10的6次方至10的7次方个芦笋茎枯病菌强致病力菌株的孢子悬浮液，在配置好的孢子悬浮液中按每100毫升加5-10微升的比例加入吐温-20后喷雾，黑暗保湿培养2天后转到玻璃恒温温室25-28℃培养，每天喷水3次，保持湿度，6-10天后观察实验结果；本发明选择在苗期用孢子喷雾法对芦笋种质资源进行抗病筛选，成株期鉴定结果与苗期鉴定一致，并具有在栽培时间、鉴定时间等方面存在优势。