专利名称：蛋白酶tablysin在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法肿瘤血管生成与生理条件下的血管生成有很多相似之处，但也有很大的差异，主要表现为其无控性和未成熟性。肿瘤血管新生的过程在很大程度上受血管生成因子和血管生成抑制因子的调节。肿瘤细胞、内皮细胞和巨噬细胞受缺氧、系统刺激等使局部微环境发生变化的因素作用而合成和释放上述因子，当二者之间的平衡被打破，即发生血管生成过程(Hanahan D,Folkman J. Patterns and emergingmechanisms of the angiogenic switchduring tumorigenesis. Cell, 1996,86 :353-364.)，通常包括以下几个步骤(I)内皮细胞激活、血管生成表型的形成，即内皮细胞血管生成的遗传信息进行表达的过程；(2)血管局 部细胞外基质、基底膜降解后，内皮细胞芽生、增殖和迁移直至管腔形成；(3)新生血管腔的形成及连通，即肿瘤微血管的分化和成型。目前已知管腔的形成和适时的基底膜沉积机制主要有(1)非极性的内皮细胞内小泡融合或细胞体弯曲而形成腔，继而基底膜沉积；移出的有极性的内皮细胞立即形成的裂隙状腔，以及伴随细胞移行的基底膜沉积；(3)在大血管形成跨腔的桥又称为套叠式生长(intussusceptive growth)过程分隔血管。肿瘤的生长可分为无血管期(avascular stage)和血管期(vascular stage),在无血管期由于肿瘤主要依靠周围组织的弥散来获取营养物质和排泄代谢产物，所以明显限制了其持续性的生长，肿瘤直径不超过I 2mm ;而至血管期，肿瘤内出现新生毛细血管并获得进一步生长的能力，肿瘤从而迅速生长并可发生转移。Folkman进而假设通过抑制血管生成便可抑制肿瘤的生长,这种设想得到了极好的验证(Folkman J. Fightingcancer by attacking its blood supply. Sci Am, 1996,275 :150-154.)。抗血管生成(antiangiogenesis)治疗肿瘤的理论与实践从此得以确立、发展。基于此，国内外大型制药企业均把抗肿瘤血管生成作为药物开发的重要靶点之一，近年来，陆续上市了多个药物，其中包含小分子化合物和生物制品。研究发现(DongyingMa, Ren Lai. Anti-thrombosis Repertoire ofBlood-feeding HorseflySalivary Glands. Molecular & Cellular Proteomics,2009 :2071-2079.)，该蛋白酶具有良好的溶栓和抗栓活性，可应用于血液栓塞性疾病的治疗，目前尚未见其他疾病领域的应用报道。
本发明提供一种式I蛋白酶tablysin，具有抗肿瘤血管生成作用以及其在抗肿瘤药物中的新应用。MTSIPVSSFSLATLVLQYATIDAVDYCRLPCRGNNYHVGCREPAYAQECGQSPRTRELLKEHRNEILSKIIDVRDHVAKGSWALPVAAGMKVVVWDAELAGLAKRHTKACVGETLECRNTERLFAPGYLNFKYSGDKLPRIMELIDAAVKKGHLQRHNITREIIESYRDNGPDGTVKELALAISERVTAVGCGLTTWQDGAKARALLTCNFSSQNTRGRPVYKVGNSP⑶FCIEKDETYTNLCSATEPIDPNKSN式I本发明所述的蛋白酶tablysin可明显抑制人真皮微血管内皮细胞的黏附和增殖，抑制鸡胚尿囊膜的血管生成，对多种实体瘤有很好的抑瘤效果，包括肝癌、肺癌、胃癌等实体瘤。本发明通过tablysin对人真皮微血管内皮细胞(MVEC)与基质蛋白的黏附作用和MVEC的增殖作用的影响，结果显示tablysin对MVEC黏附作用抑制的IC50为I y M，tablysin对MVEC的增殖作用抑制的IC50为0. 45 y M，因此，tablysin具有良好的抑制内皮细胞黏附和增值的作用。另外，本发明通过tablysin鸡胚尿囊膜血管生成试验，研究其对血管生成的影响，结果显不0. 5 ii M和I. 0 ii M的tablysin均可明显抑制鸡胚尿囊膜的血管生成。本发明在此基础上，通过多个体内肿瘤模型研究了 tablysin对肿瘤生长的抑制作用。结果表明tablysin 40 ii g/kg和20 ii g/kg组均有良好的抑制肝癌、肺癌和胃癌的作用，其中，40 ii g/kg剂量组抑瘤率超过50%，各剂量之间量效关系明显，成正相关。 图I为本发明的Tablysin对人真皮微血管内皮细胞(MVEC)与基质蛋白黏附作用的影响图。图2为本发明的tablysin对MVEC增殖作用的影响图。图3为本发明的tablysin对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型血管生成的作用的结果图，箭头所指方向为给药载体。具体实施例实施例UTablysin对人真皮微血管内皮细胞(MVEC)与基质蛋白的黏附作用的影响I. I材料及仪器人真皮微血管内皮细胞(MVEC)购自Clonetics (San Diego, CA),小牛血清 FBS(invigrogen, US),膜酶(Cambrex, MD),多聚 VTNC(Molecular Innovations,Southfield, MI),纤连蛋白(Sigma Co, Saint Louis),可溶性胶原蛋白III (BDBiosciences, Bedford, MA), 96 孔突光酶标板(Thermo Electron Co. , Milford, MA,USA)，Spectramax Gemini XPS 突光酶标仪(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)I. 2试验方法MVEC细胞用EBM-2培养液，置于37°C，5% CO2的细胞培养箱内培养。EBM-2中添加有2%的小牛血清FBS以及single quotes (成纤维细胞生长因子B，血管内皮细胞生长因子，R3胰岛素生长因子，抗坏血酸，表皮生长因子，氢化可的松以及庆大霉素和两性霉素B)。将多聚VTNC，纤连蛋白，可溶性胶原蛋白III分别用PBS稀释至20iig/ml(50ia/孔，I y g/孔，一式五份)于96孔突光酶标板上4°C固定孵育过夜。板孔用PBS洗3遍,之后2% BSA封闭2小时，然后用含0. 3% BSA的PBS洗涤。MVEC用胰酶消化后，悬浮于含0. 3%BSA的EBS-2培养液中(无FBS及singlequotes添加)。细胞中加入calcein_AM(2 U M)，室温下旋转震荡45min后洗涤一次。然后细胞重悬于含0. 3% BSA的EBM-2培养液(无FBS及single quotes添加)中至终浓度为500000/ml左右。接着，50 ylMVEC分别与不同浓度的Tablysin (0-3 y M)在37°C，5% CO2的条件下孵育20min后，加入由基质蛋白铺被的酶标板中(25，000细胞/孔)，接着孵育90min。孵育结束后,板子倒置扣掉上层液体,然后用含0. 3% BSA的EBM-2培养液(无FBS及single quotes添加)洗涤3-4遍。荧光强度的测定使用Spectramax Gemini XPS突光酶标仪在激发波长490nm,发射波长520nm的条件下测定。在无Tablysin存在的条件下由固定于基质蛋白上的细胞产生的荧光读数设为100%黏附；而在20mM EDTA存在下的荧光读数设为0%黏附。所有实验均重复5遍。I. 3试验结果Tablysin对MVEC与基质蛋白的黏附作用具有良好的抑制作用，结果如表I和图I 所示，I y M、2 ii M和3 ii M剂量组能明显抑制MVEC的黏附，其量效成正相关。根据结果计算 得出tablysin对MVEC黏附作用抑制的IC50为I y M。表I Tablysin对MVEC与基质蛋白黏附作用的影响(X±S办I


本发明涉及一种蛋白酶tablysin在医药中的新用途，可明显抑制人真皮微血管内皮细胞(MVEC)的黏附和增殖作用，能明显抑制鸡胚尿囊膜的血管生成。本发明通过3种常见的肿瘤模型进行研究，蛋白酶tablysin具有良好的抗肿瘤作用，尤其是对肝癌、肺癌和胃癌等实体瘤，可用于制备抗肿瘤药物。