专利名称：含有增多的维生素K的细菌thyA(-)突变株的制作方法众所周知，在乳业上广泛使用乳酸菌(LAB)来制造不同的动物奶发酵产品，例如酸奶、奶酪等。维生素K对于例如骨骼健康等众多人类/动物健康问题很重要。 乳酸菌乳酸乳球菌(LactococcusIactis)和乳明串珠菌(Leuconostoc Iactis)是维生素K2[甲基萘醌类]的天然生产者(Morishita T等人，1999. Production ofMenaquinones by Lactic Acid Bacteria. J. Dairy. Sci. 82 :1897-1903)。维生素K2是细菌质膜的组成部分，也就是说，维生素K2存在于LAB的质膜中。一般来说，野生型乳酸菌所产生的维生素K2的量不足以制造包含维生素K2的商业相关产品，例如具有足够高含量的维生素K2的乳制品。因此，已经进行研究以鉴别能制造增加量的维生素K2的乳酸乳球菌突变株，参看例如 W02008/040793A1 (Danone)。此外，W02008/040784A1 (Danone)描述了，可通过在其中LAB不是处于生长期而是处于W02008/040784A1 (参看例如权利要求I)中所谓的“休止细胞”期的条件下，用LAB使奶发酵来提高维生素K2的产量。基本上，这可以通过向奶中加入相对大量的LAB来获得。所属领域中众所周知，当向奶中加入相对大量的LAB时，LAB几乎不生长(细胞分裂)，这是因为开始加入的大量LAB会迅速产生非常多的乳酸，以致于奶的pH会降到例如低于pH = 4的pH，而在所述低pH下，LAB不会显著生长。换句话说，当向奶中加入大量LAB时，pH会迅速下降，以致于LAB没有“时间”进行生长(细胞分裂)。所属领域技术人员已知thyA基因编码胸苷酸合成酶。如图I所示，当所述thyA基因在例如LAB中失活时，便得到所谓的胸苷营养缺陷型突变株，即不能在胸苷“有限”的培养基中进行细胞分裂的突变株，这是因为其在不加入胸苷的情况下无法合成dTTP，从而不能复制其基因组。众所周知，奶不包含大量的胸苷，且所述thyA(-)突变株因此不能在奶中显著生长。W000/01799A2 (Chr. Hansen A/S)描述了以保藏编号 DSM12891 保藏的 thyA(-)乳酸乳球菌突变株MBP71，并描述了所述thyA(-)菌株具有抗噬菌体性。其没有描述或暗示所述thyA(-)突变株可用于产生增加含暈的维生素K2。此外，上文和下文引用的现有技术文献也没有描述或暗示可通过使LAB细胞中的thyA基因失活来提高维生素K2产暈。举例来说，以上讨论的W02008/040793A1 (Danone)提到可用于提高LAB中的维生素K2产量的许多基因(参看例如权利要求5)，但这些所述基因都不是thyA基因，或本发明中可被认为和thyA基因相似/相关的基因。JP 2001 136959 A(2001年5月公开)涉及可用于预防和治疗骨质疏松症的枯草杆菌(Bacillus subtilis)微生物细胞培养物，其中所述微生物细胞在释放维生素K之前即被收集。骨质疏松症治疗效应可通过摄取含维生素K的微生物细胞来获得，其中所述微生物细胞可并入食物或医药产品中(参考摘要)。JP 2000 080043 A(2000年3月公开)涉及用于预防骨质疏松症的口服药品/食品，其包含纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)的水溶性维生素K部分(参考摘要)。文章(Tsukamoto 等人；“Construction of a Bacillus subtilis (natto) withHigh Productivity of Vitamin K2 (Menaquinone-7)by Analog Resistance，，;BioscienceBiotechnology Biochemistry ;第 65(9)卷，第 2007-2015 页，2001)报道了具有高维生素K2(甲基萘醌-7/ΜΚ7)产量的枯草杆菌菌株的构建。因此，构建作为对I-羟基-2-萘甲 酸(HNA)、对氟-D, L-苯丙氨酸(pFP)、间氟-D, L-苯丙氨酸(mFP)及β-2-噻吩丙氨酸(betaTA)具有类似抗性的突变株菌株0UV23481，其MK7产量是商业菌株的两倍。所述突变株被分类为纳豆芽孢杆菌(参考摘要、第2007页右侧栏的第2段和第2014页左侧栏的第2段)。
本发明想解决的问题是提供一种维生素K2的产量提高的乳酸菌。所述技术方案是基于发明人已经确认，通过使LAB细胞中的thyA基因失活，可获得维生素K2的产量提高的thyA(-)突变株。在本文的工作实施例中，对于以保藏编号DSM12891保藏的thyA(-)乳酸乳球菌突变株MBP71 (参看W000/01799A2 (Chr. Hansen A/S)-上文所讨论)清楚地证实了这种效果。在本文的实施例I中，证实了 thyA(-)突变株MBP71的维牛素K2产量是对应thyA(+)野牛型菌株MBP68的约3倍。此外，在实施例I中，两种菌株都以接种量OD = I. O加入奶中。所述接种量可被视为向奶中加入了相对大量的LAB，即如上文在两个实验中所讨论，LAB发生了有限的细胞分裂或无细胞分裂，即这种情况意谓W02008/040784A1中称为“休止细胞”的条件(参看以上讨论)。因此，thyA(-)突变株MBP71不能在奶中复制其基因组这一事实，不能作为thyA(-)突变株产生显著更多的维生素K2这一惊人结果的唯一解释。换句话说，thyA(-)突变株可被视为“休止细胞”(如W02008/040784A1 (参看上文)中所讨论)这一事实无法独自解释维生素K2的产量显著提高这一惊人结果。在本文的实施例2中，证实了不是dTTP饥饿直接导致了维生素K2的增多，而是由thyA基因失活引起的代谢变化导致了维生素K2的增多。在本文的实施例3中，测试了 purD的缺失突变株，所述突变株可被视为另一种与核苷酸代谢有关的突变株(参看例如本文图I)。purD突变株没有实现目的，即其无法提高维生素K2产量。总之，实施例I到3的结果显示thyA基因的失活对于维生素K2的产暈具有惊人且唯一的积极作用。因此，所述thyA(-)突变株是在例如乳制品中供应更多维生素K2的有效手段，从而例如促进一般人群的骨骼健康。此外，因为本文的工作实施例清 楚地证实了所述提高(维生素K2产量增加)和thyA基因直接相关，所以所属领域技术人员在客观上没有理由不相信本文所述的概念(即形成thyA(-)突变株)可普遍适用于制造本文中的相关改良型细菌菌株，即不仅仅是改良型乳酸乳球菌菌株。以上讨论的文章Morishita T等人.1999描述了，不同的野生型乳球菌和明串珠菌菌株可产生可测量的量的维生素K2(参看所述文章的表2)。此外,如所属领域技术人员所知和文章Morishita T等人第1899页所述,芽孢杆菌也是维生素K的有效生产者。总之，鉴于上文，显然来自乳球菌、明串珠菌或杆菌中任一属的细菌都是用于形成thyA(-)突变株的合适候选物，从而得到本文所述的可产生更高含量的维生素K2的菌株。因此，本发明的第一方面涉及一种组合物，其包含含有维生素K2的细菌，其中细菌在组合物中的含量导致(a):组合物中存在至少O. 10 μ g/ (ml或g)维生素K2 ；和其中⑴细菌是thyA(-)突变株；和(ii):细菌是选自由以下菌属组成的组的细菌乳球菌、明串珠菌和杆菌；且其中组合物是用于治疗和/或预防哺乳动物的维生素K缺乏症。本文的商业相关组合物是例如发酵奶食品(例如乳制品)，例如酸奶或奶酪。由于本文所述的所述乳制品的维生素K含量较高且其可用于治疗和/或预防维生素K缺乏症，因此所述乳制品可称为功能食品。显而易见，在了解本文所述的知识(即thyA(-)突变株中的高含量维生素K2)之前，所属领域技术人员不会想到将例如通过使用本文所述的thyA(-)突变株而制造的功能性乳制品食品进行商业化，以用于治疗和/或预防哺乳动物的维生素K缺乏症。在商业市场上，举例来说，本文所述的功能食品将具有某种“标签/告示”，告知消费者本产品(例如酸奶或奶酪)具有高含量的维生素K。在本文中显而易见，组合物中维生素K2的相关量涉及组合物(例如酸奶)中存在的thyA(-)突变细菌所产生的维生素K2的量。如本文的工作实施例I所示，通过用相关量的MBP71thyA(_)突变株接种奶来对奶进行发酵，可获得含有26 μ g/100ml的维生素K2，即O. 26 μ g/ml的维生素K2的发酵奶。如果组合物是固体(即不是液体，例如酸奶)，那么本文中维生素K2的相关量可以μ g/g为单位来测量。所述组合物的一个实例可以例如是分离的thyA(-)突变细菌的干燥组合物，所述干燥组合物可以例如放入胶囊，然后例如作为药品售卖。确定目的组合物(例如酸奶或奶酪)中维生素K2的量是所属领域技术人员的常规工作，鉴别有多少维生素K2来源于组合物中存在的thyA(-)突变细菌也是常规工作。所属领域技术人员可使用众所周知的分析法(参看例如Morishita T等人.1999)来常规地确定所述组合物(例如酸奶)中维生素K2的量。此外，所属领域技术人员可容易地确定组合物中本文所述thyA(_)突变细菌的量(例如 109cfu/ml) ο最后，所属领域技术人员可常规地确定在组合物的个别细菌中平均存在的维生素K2的平均量，从而常规地鉴别有多少维生素K2来源于组合物中存在的thyA (-)突变细菌。本发明的第一方面的范围/精神可替代性地表达为涉及一种治疗和/或预防哺乳动物维生素K缺乏症的方法，其包含对哺乳动物施用相关量的组合物，其中所述组合物是包含含有维生素K2的细菌的组合物，其中细菌在组合物中的含量导致(a):组合物中存在至少O. 10 μ g/ (ml或g)维生素K2 ；和其中 ⑴细菌是thyA(-)突变株；和(ii):细菌是选自由以下菌属组成的组的细菌乳球菌、明串珠菌和杆菌。下文仅举例说明本发明的实施方案。

图I :乳酸乳球菌(L. Iactis)的核苷酸代谢的概述。图的左边和右边分别显示嘌呤和嘧啶代谢。仅详细显示了脱氧核糖核苷酸嘧啶和前体的相互转换。其它反应箭头可包含超过一个酶反应。标明的所有基因都已经定位于乳酸乳球菌的基因组IL1403中，但 ndk 和 dcd 除外(Bolotin 等人 2001, Genome Res. 11 :731-753)。在 IL1403 基因组序列中，tdk被称为yfiG且tmk被称为yeaB。基因deoB,磷酸戍糖变位酶；deoC,脱氧核糖醒缩酶；pdp,胸苷磷酸化酶；cdd,胞苷脱氨酶；tdk,胸苷激酶；dcdA, dCMP脱氨酶；thyA, TS ；cmk,CMP 激酶；dut，dUTPase ；tmk,胸苷酸激酶；ndk，NDP 激酶；dcd，dCMP 脱氨酶。PRPP，5-磷酸核糖-I-焦磷酸盐。

品O优选地，食品是经本文所述的thyA(-)细菌发酵的动物奶，例如优选是乳制品。动物奶优选是牛奶或山羊奶。乳制品优选是至少一种选自由奶、酸奶和奶酪组成的列表的乳制品。如上文所讨论，向奶中加入相对大量的LAB可能是有利的，以便获得较高的维生
素K产量。因此，动物发酵奶优选如下获得⑷向动物奶接种IO8到1012cfu/ml本文所述的thyA(-)细菌；和
(B):在10°C到50°C的温度下将奶发酵4到72小时。或者，组合物包含本文所述的分离thyA(-)突变细菌，优选本文所述的经干燥且分离的thyA (_)突变细菌。术语“分离”应理解为在合适培养基(例如奶或众所周知的细菌生长培养基，例如M17培养基)中合适发酵之后分离细菌。所属领域技术人员已知可例如通过离心常规地分离/收获细菌。如上文所讨论，维生素K2是细菌质膜的组成部分，也就是说，维生素K2存在于LAB的质膜中。因此，包含本文所述的经干燥且分离的thyA(_)突变细菌的组合物可例如是药物，例如其可放入医药学上相关的胶囊中。
含维牛素K2的细菌在本文所述的第一方面中，术语“细菌”是复数形式，因为在此处谈论仅包含一个细菌的组合物没有意义。然而，组合物显然可例如包含109cfu/ml相同菌株的细菌，例如本文工作实施例中所用的 MBP71 (DSM12891)。此外，组合物也可包含除本文所述的thyA(-)突变株之外的其它细菌(例如野生型thyA(+)细菌)。所属领域技术人员在本发明中将了解，术语“thyA(-)突变株”应理解为其中thyA基因无活性的突变株。所属领域技术人员已知基因可以许多众所周知的方法失活，例如通过缺失、突变
坐寸οthyA基因是众所周知的基因，其已经在许多不同的生物体中被测序和表征，因此，所属领域技术人员可常规地鉴别目的细菌是否是thyA(-)突变株。如上文所讨论，本文所述的第一方面的细菌是选自由乳球菌、明串珠菌和杆菌组成的组的细菌。优选地，细菌是选自由乳酸乳球菌、乳明串珠菌、肠膜状明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)和枯草杆菌组成的组的细菌。更优选地，细菌是乳酸乳球菌。优选地，乳酸乳球菌是乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.Iactis)或乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp. cremoris)。更优选地，细菌是乳酸乳球菌乳酸亚种。在一优选实施方案中，细菌是以保藏编号DSM12891保藏的thyA(-)乳酸乳球菌突变株MBP71。如上文所讨论，DSM12891在 W000/01799A2 (Chr. Hansen A/S)中描述且在W000/01799A2的PCT申请日之前即已保藏。维牛素K2在组合物中的量如上文所讨论，本文所述的组合物是如下组合物，其中细菌在组合物中的含量导致(a):组合物中存在至少0. 10 μ g/ (ml或g)维生素K2。
如上文所讨论，确定目的组合物(例如酸奶或奶酪)中维生素K2的量是所属领域技术人员的日常工作，鉴别有多少维生素K2来源于组合物中存在的thyA (-)突变细菌也是
曰常工作。所属领域技术人员可使用众所周知的分析法(参看例如Morishita T等人1999)来确定此含量。组合物中优选存在至少O. 15 μ g/ (ml或g)维生素K2，组合物中更优选存在至少O. 20 μ g/ (ml 或 g)维生素 K2。有时最好使用非常浓缩的固体组合物，例如所述分离的thyA(_)突变细菌的冷冻干燥组合物，因此，组合物优选是在项目(a)中在组合物中存在至少O. 10 μ g/mg维生素K2的组合物。为了在组合物中实现所述量的维生素K2，本文所述的组合物通常包含IO8到 IO12Cfu/ (ml或mg)第一方面的细菌。术语cfu/ (ml或mg)在此处应理解为基本上涉及组合物(例如奶酪)中每毫升或毫克中存在的细胞总数目。在死细胞的情况下，细胞数目是使用所属领域技术人员众所周知的计数池来确定。治疗和/或预防哺乳动物的维生素K缺乏症的用途如上文所讨论，在了解本发明(即thyA(-)突变株中的高含量维生素K2)之前，所属领域技术人员不会想到将例如通过使用本文所述的thyA(-)突变株而制造的功能性乳制品食品进行商业化，以用于治疗和/或预防哺乳动物的维生素K缺乏症。在商业市场上，举例来说，本文所述的功能食品将具有某种“标签/告示”，告知消费者本产品(例如酸奶或奶酪)具有高含量的维生素K。从商业角度来说，本文中最相关的哺乳动物是人。所属领域技术人员已知，术语“维生素K缺乏症”是对于所属领域技术人员众所周知且明确定义的病理状况。下文描述与维生素K缺乏症相关的一些普通常识。维生素K缺乏症是由维生素K不足引起的维生素缺乏症的一种形式。维生素K缺乏症可由于肠吸收受干扰(例如在胆管阻塞中发生)、由于治疗性或意外摄入维生素K拮抗剂或在极少情况下由于营养性维生素K缺乏症而出现。因此，形成的Gla残基不足，且Gla-蛋白的活性不足。对上述三种过程缺乏控制可导致以下四种情况胃疼；不受控制的大出血风险；软骨钙化；和发育期骨骼的严重畸形或不溶性钙盐在动脉壁中沉积。钙在包括动脉壁在内的软组织中的沉积非常普遍，特别是在动脉粥样硬化患者中，这表明维生素K缺乏症比先前预想的还要普遍。如上文所讨论，众所周知维生素K缺乏症和骨骼健康受损有关，例如发育期骨骼畸形或骨骼强度下降。因此，在一优选实施方案中，治疗和/或预防维生素K缺乏症的目的是改善哺乳动物的骨骼健康。骨骼健康的改善可与发育期骨骼的畸形减少有关。
或者，治疗和/或预防维生素K缺乏症的目的是治疗和/或预防胃疼、不受控制的出血风险或软骨钙化。对维生素K缺乏症进行治疗还是预防一般取决于所用组合物的类型(例如乳制品或药物)。在组合物是乳制品(例如酸奶)的情况下，酸奶可售卖给“健康”人，且其可因此看成预防维生素K缺乏症(例如“正常”人获得其一般骨骼健康的改善，因此骨骼问题可以得到预防)。在组合物是药物的情况下，其更可能是用于治疗明显有病的人，例如发育期骨骼有严重畸形的人或有胃疼的人。简言之，在本发明中，所属领域技术人员能够容易地鉴别维生素K缺乏症的治疗和预防之间的区别。
从商业角度来说，本文中最相关的哺乳动物是人。或者，哺乳动物可以例如是牛、猪、山羊、狗、猫或兔子。所属领域技术人员基于常识可鉴别优选应对哺乳动物施用多少组合物。如果组合物是例如酸奶，那么剂量当然基本上由消费者确定想食用的量。如果组合物是药物，那么医生将了解患者应使用多少剂量以实现治疗/预防。实施例实施例I :乳酸乳球菌thyA(-)突变株MBP71 (DSM12891)-维生素K2产量提高乳酸乳球菌thyA(-)突变株MBP71 (DSM12891)的thyA(+) “野生型”/母种菌株在本文中称为MBP68。将“野生型”/母种菌株乳酸乳球菌乳酸亚种MBP68在呼吸条件(100mL，M17+l%乳糖，5ppm氯化血红素，在30°C下剧烈搅拌)下生长。静置培养物的0D600是6. 5(三个重复的平均值)。去除一定量的细胞以实现IOOmL中的OD是1.0，并将细胞在4°C下离心。将细胞再悬浮于含有3. 5%脂肪的5mL牛奶(“全脂奶”)中。在4°C下将所述5mL悬浮液接种于95mL “全脂奶”中，从而得到OD = I. O的接种量。在30°C下接种约20小时后，将样品在_20°C下冷冻并用于分析维生素K2。维生素K2是用所属领域的方法分析，即所得结果和通过使用MorishitaT等人 1999.Production of Menaquinones by Lactic Acid Bacteria. J. Dairy. Sci.82 1897-1903中所述的分析程序所得到的结果相同的分析程序。所述菌株MBP68产生的维生素K2浓度是9 μ g/100mL。在同一个实验中，我们还测试了菌株MBP71(CHCC11590、DSM12891)。它是编码胸苷酸合成酶的thyA基因已经缺失的MBP68突变株，即thyA(-)突变株。所述突变株如果不加入胸苷则不能合成dTTP，因此不能复制其基因组。我们将所述菌株在与MBP68—样的条件下生长，但向M17培养基中加入20mg/L胸苷。静置OD是5. 5。其后，如上所述处理菌株。请注意奶基本上不含胸苷。令人吃惊的是，MBP71产生26 μ g/1OOmL的维生素K2，即MBP68的约3倍。将类似于上文的实验反复执行几次，每次都发现MBP71的维生素K2产量是MBP68的好几倍。结论:thyA(-)突变株MBP71的维生素K2产量是对应thyA(+)野生型菌株MBP68的约3倍。两种菌株都以OD = I. O的接种量加入到奶中。所述接种量可被视为向奶中加入相对大量的LAB，即如上文所讨论，LAB在两个实验中的生长(细胞分裂)都很有限。因此，thyA(-)突变株MBP71不能在奶中复制其基因组这一事实，不能作为thyA(-)突变株产生显著更多的维生素K2这一惊人结果的唯一解释。实施例2 MBP71 thyA (-)-不同的发酵条件在这些实验中的一个实验中，将实施例I的MBP71以OD O. 5 (而不是实施例I中的OD 1.0)接种到奶中。这种情况下维生素K2的产量是17μ g/100mL。也设立相同的培养物，但向奶中加入20mg/L胸苷。所述培养物得到15 μ g/100mL的维生素K2，即和不含胸苷的培养物差不多相同。结论:此实施例显示不是dTTP饥饿直接导致了维生素K2的增多，而是由thyA基因失活引起的代谢变化导致了维生素K2的增多。
实施例3 :测试其它核苷酸代谢突变株为了测试不是核苷酸代谢的一般扰动引起了维生素K2含量增加，我们也利用和MBP71 (未公开数据)类似的方式构建了 MBP68的purD(purDEK操纵子的部分，编码磷酸核糖胺-甘氨酸连接酶)突变株的缺失突变株。所述突变株不能从头合成嘌呤核苷酸，包括核糖核苷酸和脱氧核苷酸，且需要外来嘌呤来源进行增殖。将所述purD菌株CG75(CHCC11704)在与MBP68—样的条件下生长，但向M17培养基中加入100mg/L的肌苷，并如上所述进行处理。静置OD是7. 3。请注意奶基本上不含嘌呤。CG75菌株仅产生2 μ g/1OOmL的维生素K2，即比MBP68少好几倍。结论:总之，实施例I到3的结果显示，thyA突变株对于维生素K2产量具有独特的作用。因此，所述突变株是在例如乳制品中供应更多维生素K2的有效手段，从而促进一般人群的骨骼健康。参考文献I. Morishita T 等人 1999. Production of Menaquinones by Lactic AcidBacteria. J. Dairy. Sci. 82 :1897-1903.2. W02008/040793A1 (Danone). 3. W02008/040784A1 (Danone)4. W000/01799A2 (Chr. Hansen A/S)5. Bolotin 等人 2001，Genome Res. 11 :731-7536. JP 2001 136959 A7. JP 2000 080043 A8. Tsukamoto 等人；“Construction of a Bacillus subtilis (natto) with HighProductivity of Vitamin K2(Menaquinone-7)by Analog Resistance，，；BioscienceBiotechnology Biochemistry ;第 65(9)卷，第 2007-2015 页，200

含有增多的维生素K的细菌thyA(-)突变株，和这些thyA(-)突变株用于制造供治疗和/或预防哺乳动物(例如人)维生素K缺乏症之用的组合物/产品的用途。