专利名称：一种嗜热菌蛋白酶的固定化方法酶作为一种生物催化剂，因其具有高选择性、催化反应条件温和、无污染等特点， 广泛应用于食品加工、医药和精细化工等行业。但天然酶稳定性差、易失活、不能重复使用， 并且反应后混入产品，纯化困难，使其难以在工业中更为广泛的应用。此外，分离和提纯酶以及它们的一次性使用也大大增加了其作为催化剂的成本。在此条件下，固定化酶的概念和技术得以提出和发展，并成为近几年酶工程研究的重点。酶的固定化，即用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。依据酶的性质及用途，可分为吸附法、共价结合法、交联法、包埋法这几种。嗜热菌蛋白酶(EC3. 4. 24. 27)是一种存在于嗜热溶蛋白芽孢杆菌(Bacillus thermoproteolyticus)中的耐热性中性金属蛋白酶，含有4个钙离子和1个锌离子。其曾被用来研究卵传铁蛋白的结构，因为嗜热菌蛋白酶可以完全消化N端叶却留下大多数的C 端叶免受破坏。嗜热菌蛋白酶不但广泛应用于肽键的水解中，特别是水解亮氨酸，苯丙氨酸，异亮氨酸，缬氨酸等氨基酸的疏水性的或大的氨基侧链的N端，而且其还催化肽键的形成，特别是催化人造甜味剂阿斯巴甜的合成。阿斯巴甜是一种二肽甜味剂，甜度大约是蔗糖的200倍，其味如白糖，不腻不苦；低热量可减肥；不会使血糖升高，适合于肥胖症、糖尿病和心血管病人食用；不被微生物发酵、不怕发霉，无虞龋齿，现在在100多个国家中被广泛用于食品与饮料中。采用酶催化此甜味剂的合成，与化学工艺相比，具有明显优势，如避免了有毒有害催化剂的使用，减少了有机溶剂的使用量，使反应条件变的温和，从替代传统化学合成工艺催化剂的角度，该酶催化的反应具有很强的绿色属性，对传统化学工艺的绿色化学改造有着重要意义，因而该酶具有广阔的应用前景。固定化能够改善酶的性质，使固定化酶比游离酶具有更好的稳定性和更高的使用效率，并且使酶能够回收利用，极大节约生产成本。但是由于嗜热菌蛋白酶溶解性低 (1. 0 1. ang/ml)又只有9个氨基(嗜热菌蛋白酶通过氨基与载体共价连接)其共价固定化存在很大的困难。
本发明目的在于提供一种简单，快速，高效的嗜热菌蛋白酶共价固定化方法，该共价固定化是通过对苯醌交联剂与酶及载体的共价连接实现的，最终获得固定化酶产品，获得了性能比嗜热菌蛋白酶自由酶大为改善的嗜热菌蛋白酶固定化酶。本发明采用的技术方案是一种嗜热菌蛋白酶的固定化方法，所述方法包括(1)载体活化将氨基化的介孔泡沫硅载体MCFS-NH2浸渍在0. 5 2. 5mM的对苯醌溶液中，在20 30°C、100 200rpm的条件下振荡活化1 3小时，离心，取沉淀依次用 20 30 %乙醇和纯水洗涤，洗涤后的沉淀重新分散于MES-NaOH溶液中，得到活化的载体液；(2)酶的固定化将活化的载体液，按40 IOOmg嗜热菌蛋白酶(自由酶)/g MCFs-NH2的加酶量，加入嗜热菌蛋白酶得到混合液，将混合液在冰浴中电磁搅拌反应18 20h或者在0 7°C、20 50W微波条件下照射2 ％iin，离心，取沉淀用MES-NaOH溶液洗涤，得到固定化嗜热菌蛋白酶；步骤(1)中所制得的氨基化的MCFs载体是本领域常规的氨基化的介孔泡沫硅载体，其孔径约为26nm。步骤(1)禾Π (2)中所述MES-NaOH溶液组成如下NaCl 2 5M，ZnCl2 10 30mM， MES-NaOH 0. 01 0. 05M, pH 7. 0 7. 5，溶剂为水。本发明在固定化时加入2 5MNaCl可以使嗜热菌蛋白酶的溶解性提高约10倍， 使得嗜热菌蛋白酶可以充分分散在溶液中不至于聚集在一起从而能很好地与载体共价连接。目前微波辐射在有机合成化学中的应用广泛受到关注，其可以大大地加快反应的进行并有效地提高产率。微波对物质分子的作用是直接作用于分子内部的。物质分子偶极振动同微波振动具有相似的频率，在快速振动的微波磁场中，分子的偶极振动尽力同磁场振动相匹配，而分子的振动又往往滞后于磁场，物质分子吸收电磁能以每秒数十亿次高速振动从而加速分子间的作用。其中极性物质受到微波的作用更加明显，而蛋白质和多肽都是典型的极性分子，所以微波能够加速嗜热菌蛋白酶与载体的共价连接。因此研究中性盐增溶和微波辐射强化嗜热菌蛋白酶固定化具有重要意义，可以将酶的固定化技术提高到一个新的水平。所述嗜热菌蛋白酶以MES-NaOH溶液分散后添加到载体液中，所述嗜热菌蛋白酶在MES-NaOH溶液中浓度为0. 5 2mg/mL，所述MES-NaOH溶液组成如下NaCl 2 5M，ZnCl2 10 30mM, MES-NaOH 0. 01 0. 05M, pH 7. 0 7. 5，溶剂为水。步骤(1)中对苯醌溶液与MCFs-NH2的体积质量用量之比为2 5ml IOmgo步骤(1)中重新分散时所用的MES-NaOH溶液与MCFs-NH2的体积质量用量之比为 2 5ml IOmg0所述方法如下(A)酶的分散取嗜热菌蛋白酶，用MES-NaOH溶液分散，在_4°C下放置半小时，即得嗜热菌蛋白酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液；(B)载体活化将氨基化的介孔泡沫硅载体MCFs-NH2浸渍在1. 5mM的对苯醌溶液中，在25°C、160rpm的条件下振荡活化2小时，离心，取沉淀依次用20%乙醇和纯水洗涤，洗涤后的沉淀重新分散于MES-NaOH溶液中，得到活化的载体液；活化时所用的对苯醌溶液与 MCFs-NH2的体积质量用量之比为:3ml IOmg ；重新分散时所用的MES-NaOH溶液与MCFs-NH2 的体积质量用量之比为2 2.6ml IOmg ；(C)酶的固定化将活化的载体液，按40 IOOmg嗜热菌蛋白酶(以自由酶计)/ g MCFs-NH2的加酶量，加入嗜热菌蛋白酶的脂肪酸甲酯磺酸盐溶液得到混合液，将混合液在冰浴中电磁搅拌反应20h或者在O 7°C、40W微波条件下照射3min，离心，取沉淀用4MES-NaOH溶液洗涤，得到固定化嗜热菌蛋白酶；步骤(A) (C)中所述MES-NaOH 溶液组成如下NaCl 3M, ZnCl220mM, MES-NaOH 0. 02M, pH 7. 0，溶剂为水。本发明中，所述氨基化的介孔泡沫硅载体MCFs-NH2可按如下方法制备得到①水热过程先称取P123(三嵌段共聚物聚(乙二醇)-block-聚(丙二醇)-block-聚(乙二醇))5 IOg用水分批次溶解，再加入50 IOOmg氟化铵后开始搅拌，再加入5 IOml TMB (1. 3. 5-三甲苯)和25 50ml盐酸(36% 38%，w/w), 200 300rpm、10 50°C下搅拌20 60min，然后加入10 30ml TEOS (正硅酸四乙酯)，继续搅拌12 24h后，将溶液转入高压反应釜中，置于烘箱中100 200°C，老化6 30h，最后用水过滤，所得载体烘干待用；②去模板反应称取步骤①所制的载体0. 5 3. 5g于高压反应釜中，加入5 25ml浓硝酸(65% 68%，w/w)和1 IOml双氧水( 浓度20 40%，ν/ν)，置于烘箱中50 150°C反应6 30h，用水洗涤过滤，得到去模板载体烘干待用；③硅烷化称取2 IOg步骤②制得的去模板载体于三口烧瓶中，加入甲苯200 300ml和氨基化试剂(例如硅烷偶联剂)20 60ml，再通冷凝水，油浴100 150°C加热回流6 30h，待反应结束后冷却分别用甲苯和无水乙醇洗涤，待载体中的有机溶剂基本挥发之后，放入烘箱中烘干，即得所述氨基化的介孔泡沫硅载体MCFs-NH2。为了将微波辅助固定化与常规方法进行比较，本发明实施了嗜热菌蛋白酶的常规固定化和微波条件下固定化方法，微波条件下固定化方法得到的固定化嗜热菌蛋白酶在催化活力，耐热性，耐有机溶剂的性能上都得到了巨大的提高(1)固定化嗜热菌蛋白酶的催化活力得到了提高，其催化活力是自由酶催化活力的1.6倍，是常规固定化酶催化活力的 4.5倍。( 固定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性有所改善。当在70°C的条件下孵育3. ，固定化嗜热菌蛋白酶的活力没有降低，而自由酶在孵育池后就已经没有活性。当在80°C的条件下孵育60min，自由酶已经完全没有活性，而固定化酶却保留着74. 的催化活性。(3)固定化嗜热菌蛋白酶抵御有机溶剂的性能也得到了很大的提高。在5%叔戊醇中70°C下孵育 2h，固定化酶的活性没有改变，而自由酶的催化活力降低了 32.5%。甚至在80%叔戊醇中 70°C下孵育池，固定化酶还保留着46. 3%的催化活力，自由酶已经完全没有活力了。对于乙酸乙酯来说，固定化嗜热菌蛋白酶也展示了强大的抵御能力。在5%乙酸乙酯中70°C下孵育2h，当自由酶的活力降低了 32. 5%时，固定化酶却保留着92%的活力。而在80%乙酸乙酯中70°C下孵育2h时，自由酶已经毫无活力了，固定化酶却保留着53. 的催化活力。本发明的有益效果体现在，通过本发明方法制得的固定化嗜热菌蛋白酶在性能上比自由酶有了很大的提高。而且，通过本发明方法对嗜热菌蛋白酶进行固定化还大大地缩短了固定化时间，从20h缩短到了 3min，整整缩短了 399倍，这使得酶固定化的成本得到了降低。图1为嗜热菌蛋白酶催化合成阿斯巴甜前体的机制；其中，ZD :N-苄氧羰基-L-天冬氨酸FM =L-苯丙氨酸甲酯ZDFM =N-苄氧羰基-L-天门冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯；图2为对苯醌浓度对固定化嗜热菌蛋白酶负载率与催化活力的影响；图3为氯化钠增溶和微波辅助共价固定化嗜热菌蛋白酶的反应机制；图4为微波辐射功率对固定化嗜热菌蛋白酶负载率与催化活力的影响；图5为自由酶和固定化酶的温度稳定性；其中，·微波固定化嗜热菌蛋白酶孵育于70°C水浴中，·微波固定化嗜热菌蛋白酶孵育于80°C水浴中，▲嗜热菌蛋白酶自由酶孵育于70°C水浴中，★嗜热菌蛋白酶自由酶孵育于80°C水浴中；图6为自由酶和固定化酶在70°C水浴中的耐叔戊醇性；FE 嗜热菌蛋白酶自由酶 MW-IME 微波固定化嗜热菌蛋白酶；图7为自由酶和固定化酶在70°C水浴中的耐乙酸乙酯性；FE 嗜热菌蛋白酶自由酶MW-IME 微波固定化嗜热菌蛋白酶；



本发明提供了一种嗜热菌蛋白酶的固定化方法，(1)载体活化将氨基化的介孔泡沫硅载体MCFs-NH2浸渍在0.5～2.5mM的对苯醌溶液中，振荡活化1～3小时，离心，取沉淀洗涤，洗涤后的沉淀重新分散于MES-NaOH溶液中，得到活化的载体液；(2)酶的固定化将活化的载体液，按40～100mg嗜热菌蛋白酶/g MCFs-NH2的加酶量，加入嗜热菌蛋白酶得到混合液，将混合液在冰浴中电磁搅拌反应18～20h或者在0～7℃、20～50W微波条件下照射2～4min，离心，取沉淀用MES-NaOH溶液洗涤，得到固定化嗜热菌蛋白酶；通过本发明方法制得的固定化嗜热菌蛋白酶在性能上比自由酶有了很大的提高，还大大地缩短了固定化时间，从20h缩短到了3min，整整缩短了399倍，这使得酶固定化的成本得到了降低。