专利名称：苦丁茶冬青叶的提取方法、总皂苷及其用途的制作方法闻血脂包括闻胆固醇和闻甘油二酷，如者的危害性远远闻于后者。对于闻血脂而言，药物性降脂疗法是治疗高脂血症的最有效措施。目前，降低甘油三酯的有效药物已经很多，但降低胆固醇的有效药物还主要为他汀类。该类药物主要是对抗高胆固醇血症所致的动脉硬化，其作用机理为抑制肝脏胆固醇合成。但是长期服用他汀类药物对肝脏和肌肉有明显的毒性作用，同时导致转氨酶增高，少数服用者出现横纹肌溶解症和急性肾衰竭，尽管经过了几代药物结构的修饰，仍未解决其毒副作用问题。苦丁茶为传统的民间饮品，作为减肥、降血脂、降血压、清热解毒等功用的保健茶已有近千年的饮用历史。市场上的苦丁茶品种繁多，据调查已有22种植物的叶可作为苦丁茶使用，但具体那一种苦丁茶具有较好的降血脂、降血压等功效则不得而知，导致消费者花费了大量的金钱，但降血脂效果甚微，甚至没有效果。
近年来，本发明的发明人经过系统的比较研究，发现只有来源于冬青属植物的苦丁茶冬青(Ilex kudingcha C. J. Tseng)的叶具有非常明显的降血脂、抗动脉粥样硬化作用，其有效成分为皂苷类成分，同时，该植物所含的皂苷类成分的苷元也与其它来源的苦丁茶明显不同。通过对活性成分和药理作用进行系统的研究，发明人发现苦丁茶冬青叶的皂苷类成分具有明显的降低胆固醇、抗动脉粥样硬化作用，其作用强度与他汀类药物相当，但其机理与他汀类药物完全不同。此外，该类皂苷还有降低甘油三酯、抗氧化、肾保护、改善血液流变学等作用。作用机理研究表明，苦丁茶冬青皂苷降血脂机理为抑制肠道及肝脏酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶(ACAT)的活性，从而抑制胆固醇肠道吸收。但是，按照常规中药材提取方法提取得到的苦丁茶冬青叶提取物中异绿原酸的含量大大高于苦丁茶皂苷的含量。 而经发明人研究发现，异绿原酸具有升高血脂的作用。因此，本发明的一个目的在于，提供一种苦丁茶冬青叶的提取方法，该提取方法能够将苦丁茶冬青叶总皂苷部位与总异绿原酸部位分离，并分别得到苦丁茶冬青叶皂苷部位含量较高的提取物和总异绿原酸部位含量较高的提取物；本发明的另一个目的在于，提供由本发明的方法提取的苦丁茶冬青叶总皂苷，其总皂苷部位含量可以达到80%以上，能够降低血脂和抗粥样动脉硬化，同时对肝脏和肾脏具有保护作用；本发明的再一个目的在于， 提供上述苦丁茶冬青叶总皂苷部位在制备用于降低胆固醇、降低血脂、抗粥样动脉硬化的药物中的应用。针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案—种苦丁茶冬青叶的提取方法，该方法可以包括如下步骤(I)用50 70%的乙醇水溶液回流提取苦丁茶冬青叶；(2)将提取液滤过并除去其中的乙醇；(3)将步骤(2)得到的溶液上大孔树脂柱进行吸附，然后依次用水、pH值9 11的10 30%碱性乙醇水溶液、10 30%乙醇水溶液和50 70%乙醇水溶液洗脱该树脂柱；(4)收集用50 70%乙醇水溶液洗脱得到的溶液，浓缩、干燥即得。根据本发明提供的提取方法，其中，所述步骤(I)中乙醇的浓度可以优选为55 65%，最优选为60% ;步骤(3)中乙醇的浓度可以优选为55 65%，最优选为60%。在本文中，所述乙醇水溶液的浓度是指乙醇在乙醇水溶液中的体积百分比浓度。根据本发明提供的提取方法，其中，所述步骤(I)的回流提取的操作方法为本领域技术人员所公知，该操作中乙醇水溶液的用量可以根据原料的量来确定，例如乙醇水溶液与原料的重量比可以为2 20 1，优选为5 15 I ;提取的次数可以为I 8次，优选为2 4次；每次回流提取的时间可以为O. 5 5小时，优选为O. 5 2小时，各次回流提取的时间可以相同也可以不同，各次回流所使用的乙醇的浓度可以相同也可以不同，并且各次回流所使用的乙醇的量可以相同也可以不同。例如，在本发明的一种优选的实施方式中，可以先使用原料重量10倍的60%乙醇回流I小时，将提取液滤过后再使用原料重量 8倍的60%乙醇回流I小时，将提取液滤过后再使用原料重量8倍的60%乙醇回流I小时， 然后将三次回流提取分离出的滤液合并。根据本发明提供的提取方法，其中，所述步骤(2)中除去乙醇的方法和步骤(4)中浓缩的方法为本领域技术人员所公知，例如，均可以为减压蒸馏。步骤(4)中干燥的方法优选为真空干燥。为了节约乙醇的用量，本发明的方法还可以包括将步骤(2)分离出的乙醇和/或步骤⑷分离出的乙醇回收，并再次用于步骤⑴的回流提取。根据本发明提供的提取方法，其中，所述步骤(3)中使用的大孔树脂柱是本领域常用的树脂柱，就本发明而言，优选为苯乙烯型的大孔吸附树脂，如D101、HPD100、HPD400A、 AB-8和NKA等型号的大孔树脂柱。所述大孔树脂柱的径高比可以为I : 3 10，优选为I 4 7，最优选为I : 6 ;树脂与苦丁茶冬青叶的重量比可以为5 15 1，优选为6 10 1，最优选为7 I。优选情况下，为了得到效价更高的苦丁茶冬青叶总皂苷部位，所述步骤(3)的洗脱过程可以为先用4 10柱体积水淋洗至无糖反应；再用5 10柱体积pH值9 11 的10 30%碱性乙醇水溶液淋洗；然后用2 5体积10 30%乙醇水溶液淋洗；最后用 3 6柱体积50 70%乙醇水溶液洗脱该树脂柱。例如，在本发明的一种优选的实施方式中，步骤(3)为将步骤(2)得到的溶液上HPD400A大孔树脂柱进行吸附(树脂柱径高比为I 4，树脂与药材的重量比为7 I)，反复上样3次，静止吸附30分钟，吸附后先用水淋洗树脂柱至无糖，再用8倍柱体积25%的碱性乙醇(pH= 10)淋洗树脂柱，然后用3倍柱体积 25%的中性乙醇淋洗树脂柱至中性，最后用4倍柱体积60%的乙醇洗脱该树脂柱，将60% 乙醇洗脱液收集蒸干即得到苦丁茶冬青叶总皂苷部位。根据本发明提供的提取方法，其中，所述步骤(3)中的碱性乙醇水溶液的pH值可以最优选为10。根据本发明提供的提取方法，其中，该方法还可以包括步骤(5)将用pH值9 11 的10 30%碱性乙醇水溶液和用10 30%乙醇水溶液洗脱得到的溶液合并、调节pH值2 3、浓缩、干燥，得到总异绿原酸。本发明还提供了使用上述方法提取的苦丁茶冬青叶总皂苷，其总皂苷部位含量可以达到80%以上，能够降低血脂和抗粥样动脉硬化，同时对肝脏和肾脏具有保护作用。本发明还提供了使用上述方法提取的苦丁茶冬青叶总皂苷在制备用于降低胆固醇、降低血脂和抗粥样动脉硬化的药物中的应用。该苦丁茶冬青叶总皂苷既可以单独使用， 也可以与他汀类药物联合使用，以提高药效并改善他汀类药物的毒副作用。本发明提供的苦丁茶冬青叶总皂苷具有明显的降低胆固醇、抗动脉粥样硬化作用，其作用强度与他汀类药物相当，但其机理与他汀类药物完全不同。此外，该提取物还有降低甘油三酯、抗氧化、肾保护、改善血液流变学等作用。作用机理研究表明，苦丁茶冬青皂苷降血脂机理为抑制肠道及肝脏酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶(ACAT)的活性，从而抑制胆固醇肠道吸收。

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中
图I为实施例I制得的样品Al的高效液相色谱图2为对比例I制得的样品Cl的高效液相色谱图3为对比例2制得的样品C2的高效液相色谱图4为对比例3制得的样品C3的高效液相色谱图5显示苦丁茶冬青总皂苷对ApoE-/-小鼠血浆总胆固醇水平的影响；
图6显示苦丁茶冬青总皂苷对ApoE-/-小鼠血浆MDA水平的影响；
图7显示苦丁茶冬青总皂苷对动脉粥样硬化的影响；
图8显示苦丁茶冬青总皂苷对粪便中总胆固醇含量的影响；
图9显示苦丁茶冬青总皂苷对Caco-2细胞表达ACAT2mRNA的影响。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不
用于限制本发明的范围。需要说明的是，实施例中出现的各种百分比浓度的乙醇，均是指相应体积百分比浓度的乙醇水溶液。实施例I本实施例用于说明本发明提供的苦丁茶冬青叶的提取方法。提取称取苦丁茶冬青叶药材O. 5Kg，分别用5L和4L 60%的乙醇回流提取并过滤两次，回流时间分别为O. 5小时和I小时，将滤液合并；除乙醇将提取得到的滤液减压蒸馏至无醇味，并将乙醇回收，浓缩液的相对密度为I. 06 1.08(室温)；吸附将得到的溶液上HPD400A大孔树脂柱吸附，树脂柱的填充量为5Kg，径高比为I : 4，反复上样3次，静止吸附30分钟；洗杂先用4柱体积的去离子水淋洗树脂柱至无糖；再用8柱体积的20%碱性乙醇(NaOH，pH = 10)淋洗；然后用3柱体积的20%乙醇淋洗至中性；洗脱用6柱体积60%乙醇将树脂上吸附的提取物洗脱；
浓缩、干燥将洗脱液减压蒸馏回收乙醇，然后进行真空干燥，并将干燥后得到的固体粉碎过100目筛，得到65. 35克苦丁茶冬青叶提取物，记作Al，出膏率为13.07%。实施例2本实施例用于说明本发明提供的苦丁茶冬青叶的提取方法。提取称取苦丁茶冬青叶药材O. 5Kg，先后用4L体积百分比为65%的乙醇、3L 60%的乙醇及3L 50%的乙醇回流提取并过滤三次，回流时间分别为2小时、I小时和O. 5 小时，将滤液合并；除乙醇将提取得到的滤液减压蒸馏至无醇味，并将乙醇回收，浓缩液的相对密度为I. 06 1.08(室温)；吸附将得到的溶液上AB-8大孔树脂柱吸附，树脂柱的填充量为3. 5Kg，径高比为 1:8;洗杂先用8柱体积的去离子水淋洗树脂柱至无糖；再用10柱体积的30%碱性乙醇(NaOH，pH = 10. 5)淋洗；然后用4柱体积的30%乙醇淋洗至中性；洗脱用3柱体积65体积％乙醇将树脂上吸附的提取物洗脱；浓缩、干燥将洗脱液减压蒸馏，然后进行真空干燥，并将干燥后得到的固体粉碎 100目筛，得到50. 31克苦丁茶冬青叶提取物，记作A2，出膏率为10.06%。对比例I本对比例用于说明洗杂过程仅用水淋洗的苦丁茶冬青叶的提取方法。按照与实施例I相同的方法进行提取、除乙醇和吸附过程；洗杂用4柱体积的去离子水淋洗树脂柱至无糖；洗脱用4柱体积60%乙醇将树脂上吸附的提取物洗脱；浓缩、干燥将洗脱液减压蒸馏，然后进行真空干燥，并将干燥后得到的固体粉碎过100目筛，得到150克苦丁茶冬青叶提取物，记作Cl，出膏率为30.00%。对比例2本对比例用于说明洗杂过程仅用水和乙醇淋洗的苦丁茶冬青叶的提取方法。按照与实施例I相同的方法进行提取、除乙醇和吸附过程；洗杂用4柱体积的去离子水淋洗树脂柱至无糖；再用5柱体积的10%乙醇淋洗；洗脱用4柱体积60%乙醇将树脂上吸附的提取物洗脱；浓缩、干燥将洗脱液减压蒸馏，然后进行真空干燥，并将干燥后得到的固体粉碎过100目筛，得到110. 23克苦丁茶冬青叶提取物，记作C2，出膏率为22. 05%。对比例3本对比例用于说明洗杂过程仅用水和乙醇淋洗的苦丁茶冬青叶的提取方法。按照与实施例I相同的方法进行提取、除乙醇和吸附过程；洗杂用4柱体积的去离子水淋洗树脂柱至无糖；再用11柱体积的20%乙醇淋洗；洗脱用4柱体积60%乙醇将树脂上吸附的提取物洗脱；浓缩、干燥将洗脱液减压蒸馏，然后进行真空干燥，并将干燥后得到的固体粉碎过100目筛，得到102. 8克苦丁茶冬青叶提取物，记作C3，出膏率为20. 56%。成分测定
一、高效液相色谱检测(HPLC)色谱柱Kromasil100-5-C 18 (4. 6 X 250mm),流速0. 8ml/min ;检测波长 226nm ;柱温30°C ;流动相乙腈-O. I %磷酸溶液，梯度洗脱，洗脱条件如表I所示表I


本发明提供一种苦丁茶冬青叶的提取方法和用该方法提取的苦丁茶冬青叶总皂苷及其用途。所述提取方法包括如下步骤(1)用50～70％的乙醇水溶液回流提取苦丁茶冬青叶；(2)将提取液滤过并除去其中的乙醇；(3)将步骤(2)得到的溶液上大孔树脂柱进行吸附，然后依次用水、pH值9～11的10～30％碱性乙醇水溶液、10～30％乙醇水溶液和50～70％乙醇水溶液洗脱该树脂柱；(4)将用50～70％乙醇水溶液洗脱得到的溶液浓缩、干燥即得。制得的总皂苷可以用制备用于降低胆固醇、降低血脂和抗粥样动脉硬化的药物。