专利名称:口蹄疫病毒抗原稀释技术的制作方法口蹄疫是世界上最重要的动物疫病之一,被国际兽疫局(OIE)列为A类疫病之首,素有“政治经济病”之称,世界各国极为重视,是广泛研究和防制的重点。为了有效控制和预防口蹄疫,国际上一些消灭或正在控制口蹄疫的国家已建立了区域联防或自己国家的口蹄疫疫苗/抗原库。我国虽然于二十世纪80年代末研制成功了猪、牛口蹄疫O型灭活疫苗并用于实际防疫,但其质量和数量远远不能满足实际防疫的需要,也尚未建立自己国家的疫苗/抗原库。口蹄疫病毒属小RNA病毒科,不仅极易变异,而且免疫原性弱。而疫苗的免疫效力与其所含的有效抗原-140s颗粒(完整口蹄疫病毒颗粒)直接相关。因此,为避免疫苗中抗原不足引致的免疫失败,提高疫苗效力,减少接种剂量及建立疫苗/抗原库,研究建立一种适合于疫苗工业化生产的口蹄疫病毒抗原浓缩、保存、稀释技术是当前生产急需解决的问题。口蹄疫病毒抗原稀释技术是口蹄疫疫苗工业化大生产和建立疫苗/抗原库的关键技术之一。迄今,国内尚无这方面的专门技术,在相关研究中一般用0.5%水解乳蛋白液对口蹄疫病毒抗原进行稀释,这种方法虽然简单,也不影响口蹄疫病毒的感染性和140s抗原含量,但相对而言成本昂贵,无法满足口蹄疫疫苗工业化大生产的要求,也不符合我国国情。国际上已建立口蹄疫区域联防或自己国家的疫苗/抗原库的国家如加拿大、墨西哥、美国、澳大利亚、新西兰、爱尔兰、英国、挪威、瑞典、荷兰、芬兰、德国、法国、意大利、泰国、粮农组织亚泰区域动物生产与保健委员会等在口蹄疫疫苗/抗原库的建立和应用中,对保存的病毒抗原主要用磷酸盐缓冲液(PBS)进行稀释,但经实验证实,PBS会降低口蹄疫病毒的感染性滴度,从而影响疫苗免疫效力,同时对实验动物—乳鼠有一定毒性作用。
一种上述口蹄疫病毒抗原稀释剂的配制方法,配制时,先将氯化钙倒入50ml双蒸水中,置4℃冰箱单独溶解,用双蒸水在容量瓶中依顺序逐一溶解其它试剂,再将已溶解好的氯化钙溶液缓慢倾入容量瓶内,最后用双蒸水定容至1000毫升,4℃冰箱保存;以上为10倍浓缩液,用时应用双蒸水进行10倍稀释,充分混匀后10~12磅高压灭菌15min,无菌检验阴性后方可使用。一种使用上述稀释剂对浓缩口蹄疫病毒抗原进行稀释的方法,该稀释剂可对浓缩病毒抗原进行任意倍数的稀释,稀释前须用7.5%NaHCO3将稀释剂的pH值调至7.6。本发明提供的上述口蹄疫病毒抗原稀释技术,是在国家攀登计划和中国农业科学院兰州兽医研究所所长基金的资助下,对口蹄疫病毒抗原进行深入研究而确立的,是一种符合我国国情的简便、廉价、可靠的有效方法,可降低口蹄疫疫苗生产成本和劳动强度,提高疫苗效力,不影响口蹄疫病毒毒力、毒价和有效抗原含量,能满足口蹄疫疫苗工业化大生产的要求,为口蹄疫疫苗/抗原库的建立和应用提供不可或缺的重要技术支撑。
②浓缩口蹄疫病毒抗原的稀释方法该稀释剂可对浓缩病毒抗原进行任意倍数的稀释。稀释前须用7.5%NaHCO3将稀释剂的pH值调至7.6。
③效果分析通过15L转瓶BHK-21细胞按500ml/瓶的接毒量制备的牛源、猪源浓缩口蹄疫病毒抗原用稀释剂进行1∶1稀释,使其与普通毒(即按1000ml/瓶接毒量制备的病毒)浓度相当,然后将其与普通毒在不同温度下放置不同时间后,测定TCID50,结果见下表。表明研究确定的稀释剂对口蹄疫病毒的感染性和活力均无明显影响。用该稀释剂稀释的病毒液制造了4批共计1000万毫升牛O型口蹄疫灭活疫苗,经检验和使用证明不仅无任何不良反应,而且免疫效果良好;本稀释剂配制方法简单,所用药品价格低廉,稀释方法也简单可靠,若将15L转瓶细胞的接毒量由现在的2500ml/瓶改为800ml/瓶,在疫苗乳化时用该稀释剂予以稀释,可节省大量的人力、物力和财力。
表 不同稀释剂稀释病毒的log10TCID50病毒来源 不同处理病毒的log10TCID50及制备 30℃24hr30℃7d4℃21d-18℃420d牛源稀释毒7.33 3.50 7.33 6.83牛源普通毒7.50 3.33 7.50 6.83猪源稀释毒7.50 3.50 7.50 6.83猪源普通毒7.50 3.50 7.50 7.50
氯化钾(KCl)4.00克硫酸镁(MgSO4·7H2O) 2.00克磷酸二氢(NaH2PO4·H2O) 1.40克葡萄糖 10.00克氯化钙(CaCl2) 2.00克b.配制方法(同实施例1)②浓缩口蹄疫病毒抗原的稀释方法(同实施例1)③效果分析用15L转瓶BHK-21细胞按500ml/瓶的接毒量制备的病毒用稀释剂等量稀释后与1000ml/瓶接毒量制备的病毒比较,其对敏感细胞的半数感染量均为10-7.8。表明研究确定的稀释剂对口蹄疫病毒的感染性和活力均无明显影响。
一种口蹄疫病毒抗原稀释技术,其稀释剂是由氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、葡萄糖、氯化钙等按一定比例配制而成的10倍浓缩液,使用时应用双蒸水进行10倍稀释,无菌检验阴性后方可使用。该稀释剂可对浓缩病毒抗原进行任意倍数的稀释,稀释前须用7.5%NaHCO
口蹄疫病毒抗原稀释技术制作方法
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