专利名称：针对猪胸膜肺炎的疫苗和得到这样的疫苗的方法针对猪胸膜肺炎的疫苗和得到这样的疫苗的方法本发明涉及针对猪胸膜肺炎的疫苗，猪胸膜肺炎是对猪产业造成巨大经济损失的世界范围的疾病。猪胸膜肺炎的病原体是胸膜肺炎放线杆菌UciiZ7OhciBM ρleuropneumoniae, APP), 一种属于巴斯德氏菌科(/^sieareBaceae)的革兰氏阴性菌。所述疾病通过气溶胶路径或与感染的猪直接接触传播，并表征为出血的、纤维性的和坏死的肺损伤。临床症状的范围可从极急性的到慢性的，且当无症状的携带猪被引入未感染的畜群中时可传播疾病。基于荚膜多糖和脂多糖(LPS)的0链成分，已描述了 15种血清变型 (Serovar)0用于胸膜肺炎放线杆菌的血清分型和其他基因分型方法已经对监控和流行病学研究做出了很大贡献。这些工具对在致力于消灭细菌的强毒(virulent)类型的控制程序中的决策提供了重要信息。在北美洲，据报导血清变型1、5和7是最流行的，而血清变型 2和9最常在欧洲被分离，且血清变型15是来自澳洲猪的主要分离种。描述的胸膜肺炎放线杆菌的毒力因子包括LPS、荚膜多糖、Apx毒素I-IV (又称重复毒素(r印eats in toxins)或RTX毒素)、外膜蛋白(OMP)和多种铁捕获系统。然而，每种成分对感染过程的总体贡献仍不清楚，此细菌的发病机制也不清楚。几乎所有的目前可用的针对胸膜肺炎的疫苗是失活的全细胞菌苗(bacterin)或Apx毒素和蛋白质的亚单位组合，任选地组合外膜部分。在任何情况下，普遍认为为了得到充分的保护，优选地针对不同的血清变型，脂多糖(LPS)必须存在于疫苗中(Julien Goure等人在2009年2月24 日出版的 BMC Genomics 2009，10:88 中；Dubreuil 等人在Animal Health Research Reviews 1 (2) : 73-93，2000 December中)。更进一步地，从20世纪80年代以来已知单独的基于脂多糖的疫苗已经对降低感染水平或疾病的临床症状和诱发交叉保护具有阳性效果(Fenwick 等人在the American Journal of Veterinary Research, Volume 47, No 9, 1986 $ 9 月中；Rapp ^A^ Canadian Veterinary Journal, 1988, Volume 29, No 7, pp 585-587 中；Rioux 等人在:Comparative Immunology, Microbiology & Infectious Diseases 20 (1) : 63-74，1997 年 1 月中)。脂多糖的一个严重缺点是其内毒素性质，因此与多种不理想的副作用例如嗜睡症、腹泻、呕吐、缺乏食欲或甚至死亡相关。乍看起来，因此降低LPS在疫苗中的量或使LPS 脱毒是有吸引力的。然而，充分的APP疫苗依赖于LPS的存在，和因此如通常所知的，降低 LPS的量固有地降低疫苗的效力。也进行了多种尝试以降低LPS的内毒素性质并仍然得到有效的APP疫苗。Rioux等人(上文提及)研究了使LPS脱毒对疫苗针对APP的效力的影响，并得到结论，用(未脱毒的)LPS免疫的小鼠得到保护，而基于脱毒的LPS的疫苗不能保护小鼠(见Rioux的出版物的第71页，第三段)。此研究在猪中进行了重复(Research in Veterinary Science 1998，65，165-167)。据显示，商业的菌苗疫苗(包含未脱毒的LPS) 提供了对用野生型APP攻击的良好保护。基于脱毒的LPS的疫苗似乎效果差得多(60%的猪仍然具有肺损伤)。事实上，这与通常理解的一致，LPS当被脱毒时免疫原性低得多。本发明的目的是提供针对猪胸膜肺炎的疫苗，其具有与商业可获得的疫苗可比较的效力，但在施用有效剂量的疫苗后在猪中具有显著减少的内毒素休克症状，特别是不显示或几乎不显示任何腹泻、呕吐和增加呼吸的症状。为此，设计了基于包含脂多糖的疫苗，其中所述疫苗另外包含多粘菌素以减少由脂多糖引起的内毒素休克症状。令人惊讶地，已经发现通过多粘菌素对LPS的脱毒作用对 LPS的免疫原性没有显著的负面影响，且因此对疫苗的效力没有显著的负面影响。通过使用多粘菌素，内毒素休克症状，例如腹泻、呕吐和增加呼吸看起来可被显著减少，同时将疫苗效力保持在充足水平上。特别地，所述疫苗甚至看起来具有与不加多粘菌素的疫苗相同的效力。在本发明的意义上，疫苗是通过在宿主中诱发干扰微生物或其代谢途径(在微生物中的或由其诱导的代谢途径)的抗体，目的在于预防或降低微生物的感染或由该感染引起的疾病或病症的临床症状的构建体。疫苗可包含微生物的亚单位(例如LPS)作为基本抗原，但也可包含弱化的或被杀死的整个微生物，或例如生物的代谢物(例如排泄的毒素)。疫苗包含免疫有效量的抗原(即，能够充分刺激靶动物的免疫系统以至少降低用野生型微生物攻击的负面效果的量)，所述抗原一般与药学上可接受的载体例如包含水(通常为磷酸盐缓冲液)的液体组合，疫苗任选地包含免疫刺激剂(佐剂)、稳定剂、粘度改进剂或其他成分， 取决于计划用途或疫苗的需要性能。另外，可存在另外的其他微生物的抗原，从而使疫苗保护免受多种野生型生物的损害。多粘菌素(polymyxins)是可从多粘芽孢杆觀Bacillus polymyxa ) {B. aerospora)中分离，或人工产生的具有抗细菌性能的化合物，和可从其直接衍生的具有抗细菌性能的化合物。多粘芽孢杆菌产生的多粘菌素具有带有长疏水尾部的环肽的一般结构。典型的多粘菌素是多粘菌素A (又称气孢菌素)，多粘菌素B (通常又称作多粘菌素)，多粘菌素E (又称粘菌素)，多粘菌素M (又称作mattacin)和多粘菌素九肽。注意到的是，以前描述过多粘菌素可用于在包含革兰氏阴性菌的免疫原性组合物中成功地使脂多糖脱毒。例如，Cooperstock等人在杂志“hfection and Immunity", 1981年7月，pp 315-318中公开了通过使用多粘菌素B，在若干革兰氏阴性菌(即百日咳博德特氏菌(Mordetella pertussis )、大肠埃希氏菌〈Escherichia coli )、流感嗜血杆菌 {Haemophilus和铜绿假单胞菌O^ewi/offloftas aeruginosa))的悬浮液中的内毒素活性显著降低了。然而，Cooperstock也清楚地指出，“仍然不确定多粘菌素处理的细菌的免疫原性特性是否保持完整”并且还指出“在用高浓度的多粘菌素B处理全细菌或分离的膜后，若干...外膜成分在免疫电泳系统中结合预制抗体的能力部分丧失”。换句话说脱毒的LPS的免疫原性特性是严重怀疑的，且预见这些性能至少部分丧失。事实上，Bannatyne等人也在杂志Hygiene (Cambridge), 1981，87, pp 377—381 中公开5000 μδ (硫酸多粘菌素B)/ml浓度的多粘菌素(这相等于约42. 000国际单位/疫苗剂量)成功抑制了 LPS的毒性作用。然而，他也声明“然而这样的包含多粘菌素的疫苗仍有待商榷。最重要的是，内毒素含量的降低是否伴随保护性抗原的量的减少和与保护效力的下降相关”。几年以后，Larter 等人(在 American Journal of Diseases of Children, Vol 138，1984年3月中)的确发现在百日咳疫苗中，在同时接受百日咳疫苗和多粘菌素 (超过150. 000 IU/剂量)的动物中抗体滴度较低和上升较慢或甚至完全不存在。这些在20世纪80年代早期的发现可能解释了为什么对于其中疫苗LPS起主要作用的有效的APP疫苗，从来不认为用多粘菌素脱毒有合理的机会成功得到安全但仍然有效的疫苗。从上文提及的观察结果，到多粘菌素在包含LPS的APP疫苗中作为关键组分的本申请之间已过去了 25年的事实强烈支持了这一点。在一个实施方案中，疫苗包含从细菌培养物中纯化的脂多糖(即，相对其他细胞成分例如细胞器、核、细胞壁成分等被浓缩)，所述脂多糖与一种或多种重复毒素复合 (complexed)。已知基于菌苗(bacterins)的APP疫苗比基于在复合物形式中的LPS-和Apx 亚单位组合的疫苗提供较少的保护性。因此，这样的包含与一种或多种Apx毒素复合的从细菌培养物纯化的LPS的组合亚单位疫苗是优选的。已知LPS和这些毒素之间的特异性结合在毒素的改进的免疫原性中其主要作用(见i. a. Ramjeet等成Molecular Biology, 2008, 70(1)，pp 221-235中)，这可能解释了这样的组合亚单位疫苗的改进的保护性。现在令人惊讶地发现，尽管多粘菌素与LPS的强结合能力，其看起来不负面地干扰此LPS-毒素复合物，因为包含多粘菌素的组合亚单位疫苗提供了与不包含多粘菌素的相同的组合亚单位疫苗相同的保护性。重复毒素可为例如从EP 453 OM所知的重复毒素。另外，也可存在任意其他重复毒素ApxII或ApxIV。这可取决于i. a.想要保护免受其损害的APP血清变型。已知在胸膜肺炎放线杆菌之后，猪放线杆菌Uciiz70^ciBM也产生Apx毒素(I和II)。在根据此实施方案的疫苗中也可使用后面的毒素。优选地在疫苗中包含毒素 Apx I, Apx II和Apx III中的一种或多种，更优选地包含每一种。在一个实施方案中，疫苗包含低于2000 IU的多粘菌素/剂量。已令人惊讶地发现，通过使用低至2000 IU/剂量的疫苗(这可通过例如对于4 ml剂量，加入约60 Pg硫酸多粘菌素B/ml疫苗)，可获得内毒素症状的有效减少。在上文引用的参考文献中，当接种时有效量处于42. 000 - 160. 0000 IU多粘菌素/剂量的范围中，这大约是多粘菌素作为防腐剂的使用范围(又见第9版Merck Veterinary Manual，2005年编，其推荐对10 kg动物至少50. 000 IU/剂量的剂量)。申请者惊讶地发现，仅一部分(低于5%)看起来足以减少内毒素休克的症状。因为多粘菌素一般不十分稳定，在疫苗中存在的量将低于加入的量，当在配制后长达一年测量时，通常在50-80%之间。注意到的是，可使用尽可能少的多粘菌素以减少临床症状。例如，在受疫苗中的LPS损害较少的猪品种中，约15-30 IU/剂量的量对于充分减少内毒素休克的症状是有效的。这样的低量的正面效果已在实验上得到验证。注意到的是，最低有效量可不仅取决于猪的品种，而且取决于需要减少的临床症状、疫苗中的LPS 量、多粘菌素的类型等。在一个实施方案中，疫苗包含低于1000，或甚至低于500 IU/剂量。在一个实施方案中，脂多糖来源于胸膜肺炎放线杆菌。事实上，如通常已知的，在疫苗中的LPS不需要从APP细菌中提取以在针对猪胸膜肺炎的疫苗中起作用。其可来源于例如大肠埃希氏菌，在宿主细菌、动物细胞或其他宿主类型中重组表达。然而，我们发现来源于APP的LPS提供了非常好的接种结果。这样的LPS可从APP细菌中直接提取，但也可通过合适的宿主表达。在一个实施方案中，疫苗包含如从EP 453 OM中已知的胸膜肺炎放线杆菌的42 kD外膜蛋白。本发明也涉及得到针对猪胸膜肺炎的疫苗的方法，其包括得到脂多糖，将脂多糖与药学上可接受的载体混合和通过加入多粘菌素使脂多糖脱毒。在此意义上脱毒指加入一定量的多粘菌素，以适于至少减少内毒素休克的症状，特别是腹泻、呕吐和增加呼吸。优选地，使用低于2000，或甚至低于1000或500 IU的多粘菌素/疫苗计划剂量。在一个实施方案中，在脂多糖与载体混合时加入多粘菌素。本发明也涉及当施用包含脂多糖的针对猪胸膜肺炎的疫苗时减少内毒素休克症状的方法，其包括施用根据本发明的疫苗。现在将使用以下实施例说明本发明。实验设计在第一项研究中使用6周龄的150只无特定病原(specific pathogen-free, SPF) 的猪，并形成每组50只动物的3组。每组在6周龄时肌肉内接种1次4 ml的剂量。组 1 SSfeii^App ^SIej (Porcilis APP, nj/Λ Intervet International BV, Boxmeer, The Netherlands得到)，不含多粘菌素。此疫苗包含(每ml) 25单位的重复毒素ΑρχΙ、II和 III以及42 kD外膜蛋白。LPS以约5-6 xlO5 IU/ml的量存在。组2接受相同的疫苗，但以30 Pg/ml的量(约250 IU/ml)加入多粘菌素B (以硫酸盐的形式)。组3接受相同的标准疫苗，但加入多粘菌素E(以硫酸盐的形式)，也以30 Pg/ml的量(约250 IU/ml)。在疫苗配制的最后阶段加入多粘菌素，即当所有其他抗原与载体Diluvac Forte (可从htervet International BV, Boxmeer, The Netherlands 得至Ij) t昆合时。在接种前20小时，即将接种前，和接种后2、4、7和M小时测量直肠温度。在接种后30分钟和1、2、4、7和M小时监控每组所有动物的特定临床症状(指示内毒素休克)。特别是检查动物的以下症状少动、颤抖、咳嗽、腹泻、呕吐、增加的呼吸速率、异常的呼吸、呼吸困难和死亡。在接种后第2-6天仅进行每日检查。将组2和3的温度值和临床症状与组 1比较。在第二项研究中，检测2种不同浓度的多粘菌素。使用42只猪进行此研究，将猪随机分为每组14只猪的3个处理组。组1接受Porcilis APP (不含多粘菌素)，组2接受相同的疫苗和30 μg多粘菌素B/ml疫苗和组3接受相同的疫苗和60 μg多粘菌素B/ml疫苗。其他实验设置与第一项研究中的相同。在第三项研究中，检测了基于LPS并包含多粘菌素B的APP疫苗的效力。多粘菌素B通常被认为是具有最佳LPS结合性能的多粘菌素，和因此理论上多粘菌素B对疫苗效力具有最强的负面影响。因此，如果用此多粘菌素配制的疫苗是有效的，这就证明用另一种多粘菌素至少可得到同样有效的疫苗。通过向标准Porcilis APP疫苗加入30 Pg多粘菌素B/ml疫苗配制用于此研究的疫苗。14只猪在6和10周龄时肌肉内接种2 ml疫苗，因此接受约500 IU多粘菌素的剂量。7只猪接受安慰剂疫苗(40 mM tris-HCl缓冲液)。在 13周测定针对RTX毒素Apxl，ApxII和Apx III以及OMP的抗体效价。在第二次接种后3 周，用胸膜肺炎放线杆菌血清变型2攻击所有猪。在第四项研究中，我们检测了疫苗的安全性，其中在胸膜肺炎放线杆菌发酵批次的下游处理期间加入多粘菌素，最终得到在疫苗中的非常低的多粘菌素含量(约2-4 μδ/ ml)。在此研究中，通过向每ml各个培养物的发酵液(fermentation broth)的上清中加入 30 μδ多粘菌素B或多粘菌素E硫酸盐制备疫苗，随后从这些上清中分离与LPS复合的毒素 Apxl、II、III以及42kD OMP。在Diluvac forte中配制这些分离的亚单位以得到每ml疫苗约25单位的毒素和OMP和约IxlO6 IU的LPS。在这些疫苗中，发现约22 IU (2. 6 μδ/ ml)的多粘菌素E和约35 IU (4.2 Pg/ml)的多粘菌素B的多粘菌素浓度。为了检测安全性，每组10只6周龄SPF猪的2组接受4 ml各个疫苗。如第一项研究中所示的评估临床症状。结果两种多粘菌素中的任一种对直肠温度没有显著效果。然而，对内毒素休克症状有显著影响。在下文的表1中，提供了每组症状的总结。在组1中，在超过一半的动物中观察到典型的临床症状，如呕吐(60%)和增加的呼吸速率(66%)。在此组中2只猪(4%)死于内毒素休克。相反地，在组2和3中仅观察到非常轻微的症状。在两组中洲的猪(50只动物中的 1只)出现呕吐。另外，组3的洲的猪具有增加的呼吸速率。因此得出结论，多粘菌素适于减少由APP疫苗中的LPS引起的严重的内毒素休克症状。表1.用多种APP疫苗接种后的内毒素休克症状 _本发明涉及包含脂多糖的针对猪胸膜肺炎的疫苗，其中所述疫苗包含用于减少由所述脂多糖引起的内毒素休克症状的多粘菌素。本发明也涉及得到这样的疫苗的方法和对受试动物施用所述疫苗的方法。