专利名称:植物种的转化和外源基因的表达的制作方法本发明涉及一种改良植物的基因型和表型的方法，该方法对植物子叶组织，特别是对用一种由植物饲养细胞制备的培养基预处理的子叶引入一种农业土壤杆菌(Agrobacterium)的转化系统。该方法能高效地用于转化植物以达到增强性能和/或提供新的表型。植物育种方法的应用一直受到限制是由于很难在植物种间进行基因转移，因此开发一种方法用于植物种的遗传工程可能是具有吸引力的，但是植物细胞与其他类型的细胞对转化系统的要求实质上是很不相同的。首先，植物细胞不同于单细胞微生物，它们的增殖率低;其次，对于生存、增殖和再生来说，植物细胞对它们所处的环境极为敏感;第三，为了确定外源基团是否已起作用地被整合在植物细胞内，需要证实再生植株是否已表达了基因产物;最后，使植物细胞具有硬质的细胞壁进行遗传工程将更加困难。由于在植物细胞操作和基因有效表达的证实之间有着相当长的时间间隔，因此，在转化、细胞生长及再生植株的每个阶段要求实现高效率是必不可少的。另外还应考虑到使特定技术和该技术中所利用的材料与特定植物种之间的相匹配问题。此外，为了从转化细胞的愈伤组织获得再生植株，还需进一步机虑转化培养物的连续手工操作。A.L.Gunay et al.Plant Science Letters(1978)11365-372，介绍了从红胡椒子叶离体再生胡椒;J.R.Liu et al.，Plant Cellorgan Culture(1983)2293-304，介绍了从包括子叶在内的苹果幼苗外植体的再生;B.R.Thomas et al.，Theor.Appl.Genet.(1981)59215-219，介绍了蕃茄再生培养基;The 1985 Calgene U.S.Patent Application Serial No.798，050 by Fillatti et al.介绍了本发明的农业土壤杆菌;in Horsch et al.Science(1985)2281229-1231介绍了用叶圆片法根癌农业土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciene)转化植物;也可参考Herrera-Estrella et al.，Nature(1983)303209-213;Fraley et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)804803-4807;and Bevan et al.，Nature(1983)304184-187，in Stalker et al.，J.Biol.Chem.(1985)2604724-4728，介绍了草甘膦抗性aro A基因;而由deGreve，J.Mol.Appl.Genet.(1983)1499-511;Salomon et al.，EMBO J.(1984)3141-146;Velten et al.，ibid.(1984)32723-2730;Garfinkel et al.，Cell(1983)27143-153;and Barker et al.，Plant Mol.Bio(1983)2335-350.介绍了转录起始区和终止区;Comai et al.，Nature(1985)317741-744，介绍了对草甘膦提供耐性的鼠伤寒沙门氏菌突变基因aro A在植物体中的表达;其它讨论蕃茄子叶再生的报导包括Orsay，French Theor.Appl.Genet.68(4)，1984，317-322;Seeni，S.et al.，Canadian J.Botany 59(10)，1981，1941-1943;and Vnuchkova，V.A.，Fiziol Rast(Moscow，USSR)，24(5)，1977，1094-1100。本发明提供的方法是产生转化的植物种，所得到的植物种含有能稳定表达的新核苷酸构建物。这些方法是采用改装的(disarmed)农业土壤杆菌和植物子叶组织的高效率转化技术。植物子叶组织正常情况是与由植物饲养细胞所限定的培养基预培育。这种方法可得到高比例的正常转化细胞，而后这些正常转化的细胞能再生成植株，这些植株能生长成植物并结实。该技术能为稳定表达的引入的基因提供保证，尤其是引入的外源基因使植物具备新的表型。本发明提供了包括用植物子叶组织将新的核苷酸构建物引入植物种的细胞的新方法和新产品。这些被转化的细胞的再生形成表达存在于该核苷酸构建物中的一种或多种基因的植物体，从而至少提供一种不同于原来栽培品种的植物的性状，尤其是表型性状。所用的方法是利用受伤的子叶组织与限定的培养基一起预培育，所预培育的植物子叶组织与经过改装并被转化的农业土壤杆菌在适当的营养培养基中共培养，这种农业土壤杆菌具有转化植物细胞的能力，并且有一种DNA的构建物连结在T-DNA的一个边界上。这种构建物的制备是通过连结异源的DNA片段，其中包括至少能在寄主体内转录的一个基因。当构建物中有一种选择标记物时，共培养的细胞可转移到再生培养基中，该再生培养基通常含有为转化细胞而选用的杀菌剂。带叶分枝形成后，将分枝转移到选择的生根培养基中形成完整的小植株，而后小植株可能会长大以提供种子，插条等等，以便繁殖新的植物。所以，该方法能保证高效率转化植物细胞及由这些转化细胞再生出植物体。可被转化的植物种都是那些大批生产有待于培养和经营的植物，这些植物包括蔬菜、水果、观赏花、木本植物种等等，如下述的双子叶植物和多子叶植物蕃茄、松属、胡椒、莴苣、黄瓜、大豆、芸苔属(油菜子)、杨树、观尝花等等。用灭菌的种子作植物子叶的来源，这些子叶可以是成熟的或不成熟的、可以是已经从种子内伸出的或还存在于种子内的、也可切开种子并从种皮内解剖出子叶。许多植物的子叶会是已经伸出来的，但有少数几种，如松树，其子叶可能是未成熟的，而要从种子内获得。为了得到伸出的子叶，通常要在合适的萌发培养基中，萌发至少4天，但要少于约15天，最好为6到8天。所得到的子叶组织用作转化织织的来源，子叶受到损伤作为再生部位，再生发生在靠近基部的受伤细胞部位是较好的。最方便的是将子叶切成几片，通常切成三片，而利用中间的那片。
将受伤的子叶组织转移到饲养平板上，饲养平板上的细胞对受伤的子叶组织作为一种滋养培养物并提高转化效率。
任何适合的植物细胞悬浮液均可作饲养培养物，如烟草(Nieotiana)或玉米，尤其是前者。然而烟草饲养细胞对于某些作物，例如蕃茄是最佳的，玉米即其他的植物饲养细胞作为饲养细胞也有用。与饲养细胞所限定的培养基的预培育的时间通常至少6小时，但不得超过约48小时，通常是用12到24小时。
制备饲养平板是通过用植物悬浮液培养物，如烟草细胞约104-1010细胞/毫升，通常107-108细胞/毫升，置于软的琼脂培养基内，一般为含有约0.5%至1%琼脂和适宜的生长培养基，如Murashige和Skoog基本有机培养基、适量的激素，即植物生长素，如2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、激动素和维生素，如硫胺素，再与培养基一起适当调pH至5-6，最好为pH5.5。激动素和硫胺一般约为0.75-1.5毫克/升，而2，4-D一般约为0.05-0.2毫克/升。最理想是临用前配制饲养平板，通常在使用前至少一天或两天配制。
用多孔盖覆盖饲养平板(软琼脂层)以防止饲养细胞与子叶外植体进行接触，该多孔盖使外植体浸于所限定的培养基中。用无菌滤纸圆片很容易制成上述多孔盖。接着让子叶预保温，随后将子叶转移到含有转化植物细胞的DNA构建物的农业土壤杆菌的肉汤液体培养基的培养物内，使该DNA构建物的遗传能力转移到植物细胞内。一般农业土壤杆菌的数量约为106-1010细胞/毫升，通常约为108-1010细胞/毫升，随特定菌株的不同不各有差异。
子叶在细菌液体培养物中接触农业土壤杆菌的时间通常至少约1分钟，不超过1小时，平均约30分钟。该细菌液体培养物如MG/L(同LBMG;见Garfinkel et al.，J.Bacteriol.(1980)144732-743)。接着从细菌肉汤液体培养基中将子叶切片转移，除去过量的表面液体并将子叶切片放回到饲养平板上。在饲养平板上的细菌共培养时间通常至少为6小时、12小时、不超过约4天，平均约1-3天。随后将与细菌共培养后的子叶片转移到再生培养基中。
再生培养基通常含有一种杀菌剂，如羧苄青霉素(500毫克/升)，并可含有选择转化细胞的选择试剂，例如带有卡那霉素抗性基因(APH3′Ⅱ)，加入的卡那霉素至少约30毫克/升，通常不超过约500毫克/升，最好约为50-100毫克/升。再生培养基还常有一种适当的盐源，如Murashige Skoog盐培养基;一种适当的碳源，如蔗糖;及其它适合的附加物，如激素、玉米素等约0.75-2.25毫克/升，肌醇约50-200毫克/升等等。还可补充加入维生素，如Nitsch维生素，约加入1000X母液的0.5-1.5毫升/升，1.0毫升/升在再生培养基中是常见的。在100毫升最终体积中，1000X母液的Nitsch维生素含有50毫克盐酸硫胺素、200毫克甘氨酸、50毫克烟酸、50毫克盐酸吡哆素、50毫克叶酸、50毫升生物素并用水定容;碳源为10-30克/升。再生培养基通常含有约0.5-1.0%琼脂，将再生培养基调pH至pH6±0.5。
在2-3周内通常出现带叶的分枝，当长至1-2厘米长时，立即将它们在基部切断并转移到一种生根培养基中，这种培养基也可能是幼苗生长的培养基，同时加入羧苄青霉和卡那霉素硫酸盐。
可用各种改装的菌株以保证高效率转化植物。这些改装的菌株会全部或部分缺失T-DNA区，尤其是缺失激素基因区，也可能缺失一或二个边界，该区与冠瘿碱的表达有关，Ti或Ri质粒缺失一个与构建物顺序显著同源的区域是最理想的。
所用的农业土壤杆菌系统包括使用一种改装的株系例如根癌农业土壤杆菌PC2760(G.Coms et al.，Plasmid(1982)715-29;G.Coms et al.，Gene(1981)1433;A.Hoekema et al.，Nature(1983)303179-181;European Patent Application 84-200239.6，2424183)。
在植物细胞转化过程中所用的农业土壤杆菌本身用一种寄主范围广泛的质粒转化，这种广谱质粒可以从E.Coli穿梭至农杆菌。要实现这一点可用含有一个P-1不亲和群质粒复制子，例如RK2和能在E.Coli中提供多个拷贝，通常至少是5个，最好至少是10个直至200个拷贝的质粒的复制子。广谱质粒的特征是有至少一个T-DNA边界顺序，尤其是右边界顺序，或者由企图整合进入植物种的基因组内的各种构建物在一个方向将两个边界顺序分开。
被转化的植物细胞可以是培养的细胞、亦可以是愈伤组织中的无结构的细胞团、或者是结构的叶片外植体、带叶分枝培养物、种子、果实、叶片、根等、或者是有结构的完整的植物体。外源构建物通常存在于全部或基本上全部的植物组织的细胞中，然而外源构建物的表达可能仅限于特定的细胞或植物发育的特定阶段。这种外源构建物将包括转录和转译起始信号和终止信号，以有意义的基因的5′端为起始信号，而以其3′端为终止信号。
RNA聚合酶结合位点(启动子)的转录起始区对植物寄主可以是天然存在的或可能为其他来源，该区在蕃茄寄主体内是起作用的。其他来源包括农业土壤杆菌T-DNA基因，如胭脂碱、章鱼碱、mannopine或其他冠瘿碱生物合成的转录起始区、植物或不同于寄主的其它植物的转录起始区、各种病毒，尤其是各种寄主特异着毒的转录起始区，或部分或全部人工合成的转录起始区。
转录起始区不仅包括RNA聚合酶结合位点，而且还可包含能保证转录的调节区。该区的调节包括化学或物理阻遏或诱导，如代谢物或光或与叶、根、种子等等有关的以细胞分化为基础的调节。因此，可从适当的基因得到转录起始区或其调节部分，如光诱导的1，5-双磷酸核酮糖羧基酶基因、逆境诱导基因、受温度调节的热休克基因、创伤诱导基因、分生组织特异基因等。
3′端终止区可来自与转录起始区相同或不相同的基因，如该区有意义的基因具有一个在蕃茄种中起作用的转录终止区，该区可与这个基因一起保留下来。
构建一个能表达的盒带(Cassette)包含转录起始区，在转录起始区的转录调节控制下的有意义的基因、起始密码子、基因的编码顺序、有或无基因内区转译终止密码子，随后是转录终止区。转录终止区包括终止区、通常还包括多腺苷酸化的信号顺序以及与转录终止有关的其它顺序。转录方向是从5′→3′的方向。表达的盒带通常约少于10Kb基，经常约少于6Kb，至少约为1Kb，更常见至少约为2Kb。
有意义的基因可来自于染色体基因、cDNA、人工合成基因、或由此形成的结合物。该基因的表达产物存在于除细胞质之外的其它部位，其构建通常要包括导致将该基因表达产物转移到特定部位的特定氨基酸顺序。该特定部位可以是细胞器，如叶绿体、线粒体或细胞核、细胞质膜。该基因表达产物亦可分泌到细胞的外周胞质区或外界环境中。各种分泌引导体(leaders)、膜整合顺序以及为了将肽表达产物定向地引入特定部位的转运顺序都在文献中有描述，例如参阅Cashmore et al.，Biotechnology(1985 3803-808，Wickner and Lodish，Science(1985)203400-407。
用于植物种的有意义基因包括各种各样的表型性状或非表型性状基因，表型性状基因中有酶的，这些酶能提供抗逆境，如抗由热和盐分而引起的脱水、抗昆虫、抗除草剂、抗有毒金属或微量元素等。这些抗性可能是由于标部位的改变、受体细胞内目标蛋白量的提高，增加与某种产物的生物合成途径有关的一种或多种酶，保护受体抵抗逆境等等。这些基因可从原核生物或真核生物、细菌、真菌如酵母、病毒、植物、哺乳动物得到、或全部或部分由人工合成。所述基因包括抗草甘膦3-烯醇丙酮基二氧膦基莽草酸盐合成酶基因、腈水解酶、脯氨酸和谷氨酰胺生物合成途径中有关的基因、金属巯基蛋白基因、组氨酸三甲基内盐基因、硫酯酶Ⅱ基因、酰基载体蛋白质基因、乙酰基酰基转移酶基因等。其它有意义的基因是涉及调节生长的基因，如源/汇点(碳素分配)关系的控制，如固体含量的变化、或激素调节、光合效率、如改变RuBP羧基酶的效率、或改变植物品味的质量或营养价值、改变固体液体比例、粘性或植物果实的数量、大小、色泽、磨损抗性或硬度等基因。
也可用一个或多个表达盒带，在这里可以首尾相接的方式利用表达盒带以便各个基因表达，这些基因可以彼此独立地表达产物，也可能是同时受到调节。这些表达产物可以独立地起作用、亦可结合起来起作用。
用农业土壤杆菌的方法被转化到植物细胞中的表达盒带通常靠近T-DNA右边界或T-DNA的两个边界至少约1Kb之内。这些边界可由任何Ti质粒或Ri质粒获得，并可用常规方法与表达盒带连结。为了从除了Ti或Ri质粒之外的质粒直接转移以构建表达盒带，并通过同源重组方法将其整合进入Ti或Ri质粒的T-DNA区。因此，该表达盒带可在其一个或两个边缘处具有的DNA顺序与存在于Ti质粒或Ri质粒中的T-DNA区的顺序同源，要改装Ti质粒使之缺失表达对瘤形成所必需的蛋白质产物的基因。
通常在至少具有一个复制系统的载体上携带表达盒带，为便种起见常用的是具有一个在大肠肠杆菌中起作用的复制系统，如ColEl、pSC101、pACYC184等。在该方法每次操作后的每个阶段，使得得到的构建物克隆化、作顺序测定，并作测定后的矫正处理。除用大肠杆菌复制系统的部位外，还可用广谱的复制系统，如P-1不亲和质粒，如pRK290的复制系统，这些质粒与被改装的Ti质粒一起对于T-DNA转移到植物种寄主体内是特别有效的。
除了这种复制系统外，通常还至少存在一种标记物，该标记物可用于一种或多种寄主中，还可为个别的寄主提供各种不同的标记物，即为了在原核寄主体内的选择可用一种标记物，而对真核寄主，尤其是植物种寄主中的选择要用另一种标记物。这些标记物可保护宿主抗杀生物剂，如抗菌素、毒素、重金属等;或起互补作用，对营养缺陷型宿主提供原养型。所用的各种基因包括新霉素磷酸转移酶(NPTⅡ)、潮霉素磷酸转移酶(HPT)、氯霉素氨基转移酶(CAT)、腈水解酶、艮他霉素抗性基因等。对植物寄主的选择而言，特定有意义的标记物包括提供卡那霉素抗性或G418抗性的NPTⅡ、通过潮霉素抗性的HPT、提供氯霉素抗性的CAT、提供草甘膦抗性的aro A突变基因等。
用限制性核酸内切酶切割一种相当重复的体系，依次引入包括各种构建物、表达盒带、标记物等的各种片仔，并将特定构建体或片段插入有效的部位。在连接和克隆后，为了进一步的操作，可再分离出载体。所有这些技术在文献中都有详细地说明。在Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1982.中，还可找到特例。
现在可用适宜选择的方法分离出含有所期望结构建物的被转化植物细胞，这些转化细胞在一种选择的培养基中长成愈伤组织。该选择的培养基可能含有一种杀生物剂，即抗生素如G418、潮霉素、博莱霉素等，决定于构建物中所含有的特定标记物来保证抗性，根据植物细胞的敏感性，杀生物剂的浓度可以不同。无选用标记的，或该标记基因的表达已证明不宜用于选择，则可用南方(Sourhern)、北方(Northern)、或西方(Western)印迹法来检测转化细胞中的核苷酸顺序和蛋白质。
一旦愈伤组织形成带叶的分枝后，可将这些带叶分枝转移到生根培养基中，以产生能表达有意义基因的小植株。
所得到的小植物将具有各种不同的所期望的表型，如对热、盐度、除草剂等逆境的抗性、被改进的加工特性，被改进的能接受感觉的特性，植物特殊产物，如植物油的优先形成、细菌或哺乳动物蛋白质的产生等等。
以下提供的实施例，仅用以说明本发明但不限于本发明。
大肠杆菌MM294菌株(Hanahan，J.Mol.Biol.(1983)116557-580)被用作含有pRK290型复制子的双元载体的受体，上面已介绍了土壤杆菌C58菌株，PC2760是土壤杆菌LBA4404菌株(Hoekema et al.，Nature(1983)303179-180)的另一个名称。通过将pTIA6转化到A114.菌株(NT1)(Nester and Kosuge et al.，Nature(1983)303179)来产生K12菌株。用于大肠杆菌的抗菌素水平为毫克/升，卡那霉素为30、氯霉素为50、青霉素300、四环素为10、及艮他霉素为20。除非另有说明，用于土壤杆菌的其它抗菌素水平也是以毫克/升计，各为100毫克/升卡那霉素或艮他霉素和50毫升/升羧苄青霉素或氯霉素。
限制性核酸内切酶和T4连接酶由市场购得，并按照生产者的建议来使用，可用上述Maniatis等人所介绍的标准方法进行克隆和分子分析。
实施例1质粒的构建将含有APHⅡ(Jorgensen et al.，Mol.Gen，(1979)17765)的完整结构基因的Tn5的BglⅡ-SmaⅠ片段克隆到pUC8(Vieira and Messing，Gene(1982)19259)中，由于有一个很贴近SmaⅠ位点的EcoRⅠ位点，可将上述片段转化成HindⅢ-EcoRⅠ片段。然后将含有APHⅡ基因的3′部分的PstⅠ-EcoRⅠ片段与EcoRⅠ-BamHⅠ-SalⅠ-PstⅠ衔接物一起组入pUC7(pCGN546W)的EcoRⅠ位点中。由于该构建体不提供卡那霉素抗性，因此卡那霉素抗性是通过将APHⅡ基因的BglⅡ-PstⅠ片段插入BamHⅠ-PstⅠ位点(pCGN546X)来获得。这个步骤是使APHⅡ基因重新组装，以使EcoRⅠ位点位于该基因的侧面。有一个ATG密码子是在从带有APHⅡ起始密码子ATG的解读密码以外的上游。通过将APHⅡ的5′端的Sau 3A-PstⅠ片段插入pCGN546W的BamHⅠ-PstⅠ位点可获得质粒pCGN550，由于APHⅡ5′端的Sau 3A-PstⅠ片段缺失不需要的ATG，因此可避免产生不期望的ATG。
然后将含有APHⅡ基因(1ATG)的EcoRⅠ片段克隆到pCGN451的EcoRⅠ单一位点中，该位点含有能表达的章鱼碱合成酶盒带，得到pCGN552(1ATG)。
将含有章鱼碱盒带5′一非编码区的1556bp的质粒与PTiA6的章鱼碱合成酶的3′非编码区融合，此种融合是通过一种EcoRⅠ的衔接物。如由Barker et al.，Plant Mol.Biol.(1983)2325所确定的，对于3′区来说pTi的相同区为11，207到12，823碱基对，5′区的相同区为13，643到15，208碱基对。
得到的5′片段如下含有编码区的5′端的一个小的再克隆片段，如BamHⅠ-EcoRⅠ片段克隆在pBR322中，即为质粒pCGN407。BamHⅠ-EcoRⅠ片段具有编码区XmnⅠ位点，而pBR322则具有2个XmnⅠ位点。pCGN407用XmnⅠ消化，用Bal 31核酸切割，并将EcoRⅠ衔接物加入到这些片段中。在EcoRⅠ和BamHⅠ消化后，按大小分离这些片段，随后将各分离部分克隆化和顺序化。有一种情况是，整个编码区和5′非翻译序列的10bp已经被除去，留下5′非转录区、mRNA帽子位点和5′完整非翻译区至一个BamHⅠ位点的16个碱基对。通过在7%丙烯酰胺凝胶上按大小分离可得到此小片段，同时洗脱出长约130碱基对的几个片段。将此分离的DNA连结进入M13mp9，并对上述几个克隆进行顺序测定，再将此顺序与已知的章鱼碱合成酶基因的顺序进行分析比较。M13构建体称为pI4，用BamHⅠ和EcoRⅠ消化pI4质粒得小片段，将该小片段与含有pTIA6(Garfinkel and Nester，J.Bacteriol.(1980)144732)上游5′顺序的XhoⅠ至BamHⅠ的片段连接，并同时与含有3′顺序的EcoRⅠ至XhoⅠ片段连结。将所得到的XhoⅠ片段克隆到pUC8衍生质粒，即为pCGN426的XhoⅠ位点。该质粒与pUC8不同之处在于只含有用DNA多聚酶Ⅰ插入唯一EcoRⅠ位点。当XhoⅠ衔接物插入pUC8的HincⅡ单一位点时，由于HincⅡ限制性核酸内切酶污染核酸酶而失去PstⅠ和HindⅢ位点。得到的pCGN451质粒含有单一的EcoRⅠ位点，以便在5′非编码区(该5′非编码区含有包括T-DNA的右边缘的1550碱基对的5′非转录顺序、mRNA帽子位点和16碱基对的5′非转译顺序);和3′区(该3′区含有267碱基对的编码区、终止密码子、196碱基对的3′非转译DNA、多腺苷酸A位点和1，153碱基对的3′非转录顺序之间插入蛋白质的编码顺序。
所得到质粒PCGN451有恰当排列方向的OCS5′和OCS3′，此质粒用EcoRⅠ消化，从pCGN551消化得来的EcoRⅠ片段含有完整的卡那霉素抗性基因，此基因被插入EcoRⅠ位点，使得pCGN552具有的卡那霉素抗性基因处于恰当的排列方向。
用此OCS/KAN(章鱼碱合成酶基因/卡那霉素抗性基因)为反式二元载体pCGN587提供一种可选择的标记。
所设计的章鱼碱合成酶启动子盒带的5′部分是由TiA6DNA的XhoⅠ片段的15208-13644碱基对(Barker′的编号组成的，该5′部分还含有与T-DNA转移有连带关系的T-DNA界面顺序(边缘)。在质粒pCGN587中，从pCGN552中的OCS/KAN基因能提供一种可选择的标记和右边缘，由HindⅢ-EcoⅠ片段再克隆的左界面区为pCGN565中的KpnⅠ-EcoRⅠ片段得到pCGN580。pCGN565是一种以pUC8-Cm为基础的克隆载体，但含有pUC18衔接物，pCGN580与BamHⅠ联成线状用以取代pVCK102的较小的BglⅡ片段(Knauf and Nester，Plasmid(1982)845)，产生pCGN585。
通过用含有OCS/KAN基因的pCGN552的XhoⅠ片段代替pCGN585的较小的SalⅠ片段，可得到pCGN587。
pPMG85的构建由pTiA6(Salomom et al.，EMBO J.(1984)3141∶146)的mannopine合成酶基因(mas)5′区来构建pPMG85。该基因从(Knauf and Nester，Plasmid(1982)845-54)的pTiA6的T-DNA的一个柯氏质粒(cosmid)克隆而获得，此质粒称为PVCK232。用EcoRⅠ消化pVCK232，所得到的称为Eco13或EcoC的其中一个片段被克隆在pACYC184中，得到质粒pCGN14。用CalⅠ和SphⅠ消化pCGN14，得到一种片段的混合物，其中有所需要的片段，该所需要的片段是从ClaⅠ位点20128处到SphⅠ位点21562切下来(Barker et al.，Plant Mol.Bio(1983)2335-350)而得到的。此片段含有mas 5′区并被克隆在pUC 19(Yanisch-Perron et al.，Gene(1985)33103-119)，pUC19，SphⅠ和AccⅠ变成线性分子的得到质粒pCGN40。将pPMG34(Stalker et al.，J.Biol.Chem.(1985)2604724-4728)的aro A BamHⅠ片段，以适当的排列方向克隆进入pCGN40中，在这里，aroA基因和mas启动子区融合，得到pPMG67。
要得到一个多腺苷酸化的信号，可用pTiA6(Garfinkel et al.，Cell(1983)27143-153)的tml3′区。含有该区的T-DNA BamHⅠ片段(9062-13774;Barker编号)定向地从pVCK232被克隆在pACYC184中。在此处，13774核苷酸是靠近载体的HindⅢ位点。用SmaⅠ消化得到的质粒，该质粒在tml3′区的11210核苷酸(Barker的编号)切断至插入一个八聚体XhoⅠ衔接物(由新英格兰生物实验室合成，用HindⅢ、XhoⅠ消化所得到的质粒pBamⅩ，通过用HindⅢ和SalⅠ消化pPMG67得到含有大部分mas5′区和aro A基因的片段克隆进入线状的pBamⅩ，所得到的质粒pPMG73含有5′-mas-aroA-tml-3′杂合基因。
考虑到在农业土壤杆菌中进行有效选择，可将pUC4K(Vieira and Messing，Gene(1982)19259-268)的卡那霉素抗性基因从SalⅠ处切割并克隆在存在于已知的pPMG76的mas5′区的aro A末端的XhoⅠ位点。
将在pRiA4T-LT-DNA(White and Nester，J.Bacteriol(1980)1411134;Taylor et al.，Mol.Gen.Genet.(1985)201546)的Hind17区中的一个2.0Kb EcoRⅠ片段克隆在pPMG76的氯霉素抗性基因EcoRⅠ位点中，得到pPMG82。
为选择抗卡那霉素的转化植株，霉构建msa-npt杂合基因(见Velten et al.，EMBO J.(1984)32723-2730用一种类似的构建)。通过用EcoRⅤ(21552;Barker的编号)和EcoRⅠ(在pUC19多聚衔接物)消化pCGN40以切割mas5′区并克隆在用SmaⅠ和EcoRⅠ消化的pCGN451中。限制性缺失pCGN451的全部ocs5′区并在该位插入mas5′区。此外，pUC19多聚衔接物从XbaⅠ到EcoRⅠ的部分被插入在mas启动区和ocs多腺苷酸化作用的位点之间，为待表达基因的插入可选择不同的位点。将带有Tn5 npt基因(Rothstein et al.，Cell(1980)19795-805)的pCGN552的EcoRⅠ片段插入质粒pCGN46的EcoRⅠ位点中，此处除去了5′区未转译的ATG顺序。
通过用XhoⅠ消化以切断mas-npt-ocs杂合基因，并将其克隆在pPMG82的SalⅠ位点中，得到pPMG85。
所得到的质粒pPMG85包含从EcoRⅠ位点起始、来自pACYC184的一个EcoRⅠ-HindⅢ 1.5Kb片段和顺时针排列的来自pUC4K的细菌卡那霉素抗性基因、以顺时针方向定位的mas5′区核苷酸21476到20128、包含来自pPMG34片段的BamHⅠ-SalⅠaro A、从核苷酸11207到9062的tml3′区、一个来自pACYC184的四环素抗性基因的BamHⅠ-SalⅠ片段、来自pCGN552的npt基因、一个来自pACYC184的2.5Kb SalⅠ-EcoRⅠ片段和来自在BglⅡ-HindⅢ-17片段(Huffman et al.，J.Bacteriol(1984)157269-276)上的pRIA4的2Kb EcoRⅠ片段。
实施例2蕃茄子叶组织的转化从幼苗得到完全无菌的蕃茄子叶组织，幼苗是于24℃下在含有Murashige-Skoog盐培养基和0.8%琼脂(pH6.0)的100×25毫米培养皿中生长发育16小时/8小时日/夜周期时间。各蕃茄种均可使用，但本发明是用UC82B近交繁殖系，它可从戴维斯站(澳)加利福利亚大学蔬菜作物系CA 95616得到。将子叶切成三片并将中间一片子叶置于饲养平板上预培育24小时。用滴管将0.5毫升的烟草悬浮培养物(106细胞/毫升)移到含有Murashige基本有机培养基(K.C.生物制品)、2、4-d(0.1毫克/升)激动素(1毫克/升)、硫胺素(0.9毫克/升)和磷酸氢钾(200毫克/升、pH5.5)的0.8%琼脂培养基上，以制备饲养平板，该饲养平板在使用前两天制备。烟草悬浮细胞生长两天后，将一张含有饲养培养基的3毫米无菌滤纸圆片放在烟草细胞的上部。
将子叶切片中三分之一的中间那些子叶切片预保温后，置于根癌土壤杆菌2760/587/85菌株(1×107-1×108细菌/毫升)的液体MG/L肉汤液体培养物(1-5毫升)中。(将质粒pCGN87和pPMG85转化到大肠杆菌C2110(polA)利用卡那霉素和草甘膦抗性选出共合体，引自Fromard et al.，Bio Technology，May1983，PP.262-267)。用两个菌株大肠杆菌和一个菌株的土壤杆菌进行细菌接合，其中一株大肠杆菌(MM294)具有提供迁移功能的pRK2073，而另一株大肠杆菌(C2110)带有卡那霉素抗性标记的质粒将被转移到土壤杆菌中去。两株大肠杆菌均于37℃在LB肉汤液体培养基中震荡培养过夜，土壤杆菌株则于28℃在MG/L肉汤液体培养基中培养过夜。三种菌株各取50微升置于MG/L平板的硝化纤维滤纸上混合，该平板于28℃保温3天，混合液在补加100微克/毫升卡那霉素和100微克/毫升链霉素的AB基本培养基上划线后，于28℃保温两天，所加的链霉素使两株大肠杆菌致死。通过在上述培养基上两次以上的划线培养以纯化和挑取单个菌落。将子叶切片与细菌在饲养平板上共培养48小时，随后将其转移到含有500毫克/升羧苄青霉素和100毫克/升卡那霉素的再生培养基中。再生培养基是含有玉米素(2毫克/升)、肌醇(100毫克/升)、蔗糖(20克/升)、Nitsch维生素及0.8%琼脂(pH6.0)的一种K.C.生物制品Murashige-Skoog盐培养基。发育2-3周后即可观察到带叶枝条的生长，当带叶枝条长至约1.25厘米长时，将其切下断并转移到含有羧苄青霉素(500毫克/升)和卡那霉素(500毫克/升)的Murashige和Skoog培养基中以便生根，10-12天内发育出根。
将在含有卡那霉素培养基上发育并随后生根的带叶枝条进行APH酶活性和是否存在aro A蛋白质的检测。西方印迹法蕃茄植株的提取液在西方印迹法中(Comai et al.，Nature(1985)37341-344)显出aro A蛋白质的一条正常。用诱变的草甘膦抗性aro A基因表达产物，按常规方法使兔子产生免疫即可获得抗体用于西方印迹法。美国专利4，535，060的有关介绍已为本发明列入参考。在有标准条带的凝胶中证实草苷膦抗性酶确实生成并且在寄主细胞中也是稳定的。
在假定已转化的蕃茄植株和枝条上也进行了氨基糖苷磷酸转移酶(APH 3′Ⅱ)的分析，发育成带叶分枝条并随后在含有卡那霉素的培养基上生根的约90%的蕃茄植株已检验出对APH3′Ⅱ酶活性为正带，APH 3′Ⅱ提供对卡那霉素和新霉素的抗性。用电泳法将酶与其它干扰的蛋白质分离，分析APH 3′Ⅱ的活性(Reiss et al.，Gene(1984)30211-218)。亦可通过在原位卡那霉素的磷酸化作用检测出APH 3′Ⅱ的酶促活性。卡那霉素和〔γ-32P〕ATP都可作为底物用，并包埋在琼脂糖凝胶里，该琼脂糖凝胶被置于含有蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶的上面。酶促反应后，磷酸化的卡那霉素被转移到P-81二氧磷基纤维素离子交换纸上，用放射自显影法最后可见使放射性标记的卡那霉素显影。用0.1毫克/毫升的蛋白质酶K洗P-81离子交换纸，以改进Reiss等人的方法。
在子叶细菌共培养后，放在“2Z”再生培养基平板上的约90-100%子叶都再生出带叶枝条。放在含有羧苄青霉素和卡那霉素“2Z”培养基平板上约60-90%子叶也都形成了带叶枝条。在选择培养基上开始培养的约80%的带叶枝条随后都在含有卡那霉素(50毫克/毫升)的生根培养基上生出了根。通过蛋白质的西方印迹法分析，有90%以上的这些带叶枝条在产生了aro A蛋白质的卡那霉素上生出了根，表1列出了蕃茄转化的结果。
表1通过与农业土壤杆菌共培养的蕃茄转化处理 子叶数 总数不饲养物 13/19 68% 27/41 66%KCMS+培养基 14/22 64%玉米饲养物 10/14 71% 24/37 64.3%KCMS+培养基 6/11 55%8/12 67%烟草饲养物 12/12 100% 33/37 89.3%KCMS+培养基 10/12 83%11/13 85%无饲养物 4/18 22% 11/35 31/5%N6培养基 7/17 41%玉米饲养物 6/22 27% 11/32 29.0%N6培养基 5/10 31%对照数KCMS+培养基是烟草培养基，N6培养基是玉米培养基。
通过肉眼检查子叶在含有100毫克/升卡那霉素的2Z培养基上开始生长的绿色带叶分枝可测定出转化反应。
因此，以上介绍的蕃茄转化/再生系统是快速而有效的，85%以上的共培养的外植体随后都在选择的卡那霉素培养基上发育成带叶分枝并表达了aro A蛋白质。每个外植体长出了2-10个带叶分枝，6周后，每个外植体长出了10、20或甚至更多个的带叶的分枝。草甘膦喷霉试验证实得到的蕃茄植株对0.75磅/英亩的草甘膦具有抗性。
上述结果证明能够有效地转化植物种，利用此种方法外源基因可以整合进入植物基因组而且能够表述。并提供新的表型性状。根据高效的转化，在适当的期限内，又没有过多的重复步骤就可实现成功的转化。如上述介绍所证实的，所提供的植物种能保护植物免受除草剂的伤害，从而可以实现农作物的快速生长和高产。
为清楚理解起见，虽已通过说明和举例的方法，详细介绍了本发明，但显然可在申请的专利范围内实行某些变动和修改。


本发明涉及通过将子叶的带叶分枝培养物与外源基因共培养转化，随后由转化细胞再生出植物体，从而产生能表达外源基因的植物体以产生植物种，特别是利用一种受到控制的农业土壤杆菌(Agrobacte-rium)转化系统来转化蕃茄带叶分枝培养物，而后使转化的蕃茄组织再生成植物体。