专利名称：用于表达两种外源基因的载体的制作方法传递基因的载体可用于研究和基因治疗以便在靶细胞中表达外源基因。在所述情况下，有时需要在同一靶细胞中表达两种基因。这将允许插入了治疗基因的靶细胞通过联合表达选择性基因与治疗基因而选择性地增生或死亡。另一方面，这将允许通过联合表达治疗基因与标记基因(如GFP等)而监控治疗性转基因细胞的体内动力学。而且，这将允许那些通过在两类亚基之间形成复合物而起作用的蛋白，如受体和转录因子表达。过去已报道过插有多个启动子的形式和一个启动子与IRES(内部核糖体进入位点)序列结合的另一种形式作为共表达两种基因的载体系统。但是，这些载体的表达性能却不能令人满意。例如，由于启动子之间的干扰，含有多个启动子的载体仅从其中一个启动子表达时出现表达效力的问题。另一方面，含有一个启动子与IRSE序列组合的载体存在的问题是从IRES的3’端表达基因时，其表达水平仅仅是从IRES 5’端表达的1/5到1/10。
本发明的目的是提供一种可以共表达两种外源基因的载体。更具体地说，本发明的目的是提供一种可以用RRE序列共表达两种外源基因并且可以通过修饰RRE序列来调节两种外源基因表达水平比例的载体。在优选的实施方案中，提供了一种病毒载体，其中可以将源自病毒的表达调控序列改变成另一种表达调控序列，这样就消除了对源自病毒的蛋白的依赖。在另外一个优选实施方案中，提供了一种含有包装信号的病毒载体，其中可以改变该载体，从而降低因基因重组产生野生型病毒株的风险并使该载体不再表达病毒结构蛋白。本发明者使用RRE和有各种优点的猴免疫缺陷病毒(SIV)产生了一种新的病毒载体，其中所述优点如与基因治疗领域中常用的人类免疫缺陷病毒(HIV)相比更好的安全性。具体地说，首次将依次含有5’LTR区、RRE、CMV启动子、EGFP基因(或β-半乳糖苷酶基因)和3’LTR的载体构建为基于SIVagmTY01的基因转移载体，其中的SIVagmTY01是非致病性非洲绿猴免疫缺陷病毒的一个克隆。
由于将基因转移载体包装到载体颗粒中需要包装细胞中对基因转移载体反式作用的病毒结构蛋白，本发明人为了在包装细胞中提供病毒结构蛋白还构建了一种包装载体。也就是说，构建了在包装细胞中表达病毒外壳蛋白(VSV-G)的载体和表达病毒核心蛋白(gag)和逆转录酶(pol)的载体。
慢病毒5’LTR的转录活性一般取决于Tat蛋白，这种蛋白是一种源自病毒的因子。所以，本发明人随后又产生了一种基因转移载体，在该载体中用另外一个启动子序列取代U3区，即5’LTR的启动子序列，从而消除了所产生的基因转移载体对Tat蛋白的依赖性并且通过用具有较强转录活性的启动子序列进行取代来增加载体滴度，这样就提供了不依赖Tat的载体。
已发现在慢病毒载体中，因为在靶细胞中逆转录时将3’LTR区中所含的启动子序列U3区插入到5’LTR的U3启动子区，在基因转移载体质粒的3’LTR区所含的U3区发挥5’LTR的U3启动子的功能，它与靶细胞基因组中的基因表达有关。所以，产生一种用另一启动子序列取代基因转移载体中3’LTR的U3区的载体来测定是否能够用不含有U3序列的启动子取代靶细胞内与基因表达相关的启动子。此外，为测定是否能够同时缺失靶细胞内5’LTR中的启动子序列，产生了一种基因转移载体，其中3’LTR的U3区已缺失。
将基因转移载体包装到载体颗粒中需要包装信号，一种对基因转移载体起顺式作用的因子，此外，通过增强载体的包装效率将会提高载体滴度。所以，应当插入尽可能长的含有包装信号的区域，以便保持包装信号序列所形成的结构。然而，另一方面，使基因转移载体的包装信号和包装载体之间的序列重叠最小化就将由于两种序列间可能出现的重组引起的野生型病毒的产生频率抑制到最小。所以，为了构建载体系统，必需正确鉴定有效包装基因转移载体所需的最小包装信号序列。这样，本发明人将含有不同长度的5’LTR下游区域的DNA片段插入了基因转移载体来提供安全而有包装能力的载体。
接着，本发明人产生了一种允许同时表达两种外源基因的病毒载体。Rev应答元件(RRE)是源自病毒的Rev蛋白结合位点，它与RNA从核到胞质的运输有关。使用这种RRE/Rev系统，可以检测出通过剪接效率的调节是否可产生可以从单一启动子共表达两种不同类型的蛋白的系统。
首先，为了检测RRE是否能够调节两种不同类型蛋白的表达，产生了一种载体，其中分别在RRE的上游和下游插入萤光素酶基因和β-半乳糖苷酶基因作为报道基因，在萤光素酶基因的上游插入剪接供体序列并且在RRE序列的下游插入剪接受体序列。预计在这种载体中剪接过的mRNA会表达β-半乳糖苷酶蛋白并且没有被剪接的mRNA会表达萤光素酶蛋白。
而且，为了不仅能够检测两种不同基因的表达，而且也能够检测通过改变RRE的序列而对这两种基因的表达量之比的调节，产生6种插有RRE序列的载体来测定在每种这类载体中报道基因的表达水平。
结果发现含有RRE序列的载体能够表达两种不同类型的基因，并且通过RRE序列的取代能够调节两种基因的表达效率。此外，因为没有包装载体时可以表达两种不同类型的基因，故发现该基因表达系统可以不依赖于Rev蛋白的存在而表达两种类型的基因。
过去人们认为RRE的作用依赖于Rev蛋白，并且Rev/RRE的调节是“全或无”的情况。因此，在Rev-的情况中均是剪接形式，而在Rev+的情况中为非剪接形式。也就是说，从来没有改变RRE序列造成剪接比例改变的例子。所以，上述结果首次证实了改变RRE序列能够改变剪接的比例。
本发明人还检测了利用RRE共表达两种基因的系统是否能应用于使用各种非5’LTR启动子的表达系统。使用了源自人巨细胞病毒(CMV)的其他启动子和源自哺乳动物细胞的启动子(EF1α启动子)。结果发现即使当使用非5’LTR启动子时，也能够同时表达两种类型的基因。此外，发现两种类型基因的表达水平的调节依赖于RRE序列。所以，发现在利用了各种启动子的表达系统中，使用RRE共表达两种基因的系统有广泛的用途。
另外，还根据报道基因插入RRE上游或下游的不同情况检测了每种基因的不同表达水平。产生了在基因转移载体中萤光素酶和β-半乳糖苷酶位置互换的两种载体以比较这两种载体中两种报道基因的表达水平。结果发现不论将它们插入RRE的上游或下游，在报道基因的表达水平上都没有差异。
如上所述，本发明人成功地产生了一种新型病毒载体，这种载体能够用RRE序列共表达两种基因并且因所用的RRE序列中的差异能够调节两种基因的表达比例，由此完成了本发明。
更具体地说，本发明涉及(1)一种能表达两种外源基因的载体DNA，该载体DNA从5’端到3’端依次含有下列部分(a)表达调控序列；(b)剪接供体序列；(c)第一种外源基因的插入位点；(d)RRE核心序列；(e)剪接受体序列；和(f)第二种外源基因插入位点；(2)一种能表达两种外源基因的载体DNA，该载体DNA从5’端到3’端依次含有下列部分(a)表达调控序列；(b)剪接供体序列；(c)RRE核心序列；(d)第一种外源基因的插入位点；(e)剪接受体序列；和(f)第二种外源基因插入位点；(3)按照(1)或(2)所述的载体DNA，其中RRE核心序列源自逆转录病毒；(4)按照(1)或(2)所述的载体DNA，其中RRE核心序列源自慢病毒；(5)按照(1)或(2)所述的载体DNA，其中RRE核心序列源自免疫缺陷病毒；(6)按照(1)到(5)中任何一项所述的载体DNA，其中表达调控序列含有LTR；
(7)按照(1)到(6)中任何一项所述的载体DNA，其中表达调控序列含有非LTR的表达调控序列；(8)按照(7)所述的载体DNA，其中非LTR的表达调控序列选自CMVL启动子、CMV启动子和EF1α启动子；(9)按照(1)到(8)任何一项所述的载体DNA，其中剪接供体序列和剪接受体序列源自逆转录病毒；(10)按照(1)到(8)任何一项所述的载体DNA，其中剪接供体序列和剪接受体序列源自慢病毒；(11)按照(1)到(8)任何一项所述的载体DNA，其中剪接供体序列和剪接受体序列源自免疫缺陷病毒；(12)按照(1)到(11)任何一项所述的载体DNA，其中该载体DNA还在能被转录的区域上含有包装信号；(13)按照(12)所述的载体DNA，其中包装信号源自逆转录病毒；(14)按照(12)所述的载体DNA，其中包装信号源自慢病毒；(15)按照(12)所述的载体DNA，其中包装信号源自免疫缺陷病毒；(16)按照(13)到(15)中任何一项所述的载体DNA，其中所述载体DNA被构建成不能表达完整的gag蛋白；(17)按照(13)到(16)中任何一项所述的载体DNA，其中gag蛋白的翻译起始密码子已突变；(18)按照(1)到(17)中任何一项所述的载体DNA，其中已经将第一种外源基因和第二种外源基因插入该载体DNA中；(19)一种逆转录病毒载体，在其病毒颗粒中含有来自(12)到(17)中任何一项所述的载体DNA的转录产物，其中已经将第一种外源基因和第二种外源基因插入该载体DNA中；(20)一种慢病毒载体，在其病毒颗粒中含有来自(12)到(17)中任何一项所述的载体DNA的转录产物，其中已经将第一种外源基因和第二种外源基因插入该载体DNA；(21)一种免疫缺陷病毒载体，其病毒颗粒中含有来自(12)到(17)中任何一项所述的载体DNA的转录产物，其中已经将第一种外源基因和第二种外源基因插入该载体DNA；(22)一种制备病毒载体的方法，该方法含有将(12)到(17)中任何一项所述的载体DNA导入包装细胞的步骤，其中将第一种外源基因和第二种外源基因已插入该载体DNA中，和从该细胞的培养物上清液中收集所产生的病毒颗粒的步骤。
其中“病毒载体”指含有能在宿主中表达外源基因的包装核酸分子的病毒颗粒。
按照本发明，载体DNA依次含有(a)表达调控序列、(b)剪接供体序列、(c)第一种外源基因插入位点、(d)RRE核心序列、(e)剪接受体序列和(f)第二种外源基因插入位点，该载体可用来表达两种外源基因(注元件(c)和(d)可以互换)。
两种外源基因一旦插入到这种载体DNA中，根据有无剪接，就能够共表达。下面描述构成本发明基础的理论。
一旦插有两种外源基因的载体DNA被导入适当的宿主细胞中，由于表达调控区的激活，就会产生转录产物，该转录产物依次含有剪接供体序列、第一种外源基因、RRE核心序列、剪接受体序列和第二种外源基因。如果在剪接供体序列和剪接受体序列之间没有出现剪接，从该转录产物产生的是仅编码第一种外源基因的mRNA。因为翻译mRNA上所编码的第一外源基因的核糖体因第一外源基因的终止密码子而离开RNA，所以第二基因不被翻译。另一方面，当在剪接供体序列和剪接受体序列之间发生剪接时，通过使含有第一外源基因的区域缺失就产生了只翻译第二外源基因的mRNA。所以，因有或无所述剪接，在导入了载体DNA的宿主细胞中能够表达出两种基因产物。
本发明的载体DNA上表达调控序列的类型不局限于LTR。但是，为了使用如下的病毒载体，可被逆转录的病毒基因组必需能通过病毒对靶细胞的感染而将病毒本身插入宿主染色体中。作为具有这种功能而不是LTR的表达调控序列的例子，可给出在实施例中描述的由LTR和其他启动子组成的嵌合启动子。
因为出现剪接的效率几乎是100％，所以本发明的载体DNA中无需优选剪接供体序列和受体序列的常规组合。在本发明中，优选能从一类RNA经不同剪接而表达两种或多种蛋白的序列。一般来说，人们知道逆转录病毒中有许多这类序列(A.B.Rabson和B.J.Graves，“病毒RNA的合成和加工”，在《逆转录病毒》，第205-262页(1997)编辑J.M.Coffin，S.H.Hughes以及H.E.Varmus，冷泉港实验室出版社)。例子包括SEQ ID NO76中所示SIVagmTYO1的基因组序列中碱基6964到碱基8177之间的区域。
在本发明的载体DNA中第一个外源基因的插入位点应当放在剪接供体序列和剪接受体序列之间。插入一个不抑制靶基因翻译的合适限制酶位点可产生第一个外源基因插入位点。在剪接受体序列和多聚腺苷加尾信号之间插入一个适当的限制酶位点可产生第二个外源基因插入位点。只要不抑制第一个外源基因的表达，就可以将RRE序列定位在第一个外源基因插入位点的5’端或3’端。
对第一个和第二个外源基因的组合没有特殊限制。认为有用的两种类型基因的组合例子如下所示。
a)治疗基因和抗药性标记用适当试剂在体内只选择治疗性转基因细胞，从而减少非转基因细胞同时增加转基因细胞。
b)治疗基因和生长因子或其受体通过刺激治疗性转基因细胞的生长，使得只有转基因细胞选择性增殖，从而提高治疗效果。
c)治疗基因和归巢受体为将治疗性转基因细胞特异性地传递到所希望的部位，共表达归巢受体，如AIDS的治疗基因和淋巴结的归巢受体。
d)治疗基因和标记基因可以一直监控带标记的治疗性转基因细胞的动力学和半寿期。如果能够体外测定蛋白，可以一直体外监控转基因细胞。
e)由两种类型的亚基组成的蛋白的表达已知各种蛋白可形成异源二聚体。因为本发明的载体DNA能够使这类蛋白表达，故对治疗基因的选择将扩大到过去可能获得的基因之外。
f)两类相互作用的基因的表达可以表达配体和受体、酶和其底物、信号转导分子及其受体等配对物。例如，共表达生长因子及其受体能够显著增加转基因细胞数。
g)有协同作用的两类基因的表达在各种信号转导系统中，经常可以因激活了多种信号转导系统而观察到协同作用，例如来自两类配体的刺激物产生的协同作用。通过表达具有这种作用的两类基因，会提高治疗效果。
此外，修饰本发明载体DNA上的RRE序列，可以调节转录产物的剪接效率。这样，就能够调节宿主细胞中所表达的两种基因产物的数量比例。而且，基因产物的量本身可得到调节。
例如，如图8所示，用c/SA或c/tr序列作RRE序列就能够提高第一外源基因的表达率；相反，用c/c或c/x序列作RRE序列能够提高第二外源基因的表达率。另外，如图8所示，外源基因的表达水平本身可用不同的RRE序列改变。调节外源基因的表达水平有许多优点。例如，在基因治疗中表达两种类型的基因产物时，存在最佳表达水平，通过控制数量比而调节到最佳表达水平，就会提高治疗效果。例如，对异源二聚体来说，认为使异源二聚体的每一多肽、亚基以1∶1表达是最有效的，而对酶和底物来说，认为降低酶量并增加底物量会使效率升高。
体内导入本发明载体的方法可以如下所述进行。
a)DNA本身的给药由于可以只用DNA对肌肉细胞进行给药，因此DNA本身可以作为载体而给药。
b)非病毒载体的给药DNA可以与用于转染的合成化合物如脂转染胺试剂或聚阳离子脂质体以复合物的形式给药。
c)病毒载体的给药DNA可以通过插入DNA型病毒载体如腺病毒而给药。
为了生产包装了本发明载体DNA的病毒颗粒，在载体DNA的可转录区需要包装信号。需将尽可能长的含包装信号的区域插入到载体中，以维持包装信号序列所形成的结构。另一方面，为了抑制因载体DNA上的包装信号和包装载体之间的重组引起的野生型病毒的产生频率，要将这些载体间的序列重叠保持在最小。所以，在产生本发明的载体DNA时，优选使用含包装必需的序列，但同时又尽可能短的序列，以使包装效率和安全性都最大化。
对包装信号不作限定，只要转染细胞可以包装该包装载体就行。这样，按照包装载体的类型，可以使用源自逆转录病毒的、源自慢病毒的、源自免疫缺陷病毒等的信号。
例如，用源自实施例中所述的SIVagm的包装载体时，可用的信号将只是源自SIV，因为HIV载体未被包装。但是，使用源自HIV的包装载体时，因为源自SIV的基因转移载体也被包装，就可以将源自不同慢病毒的基因转移载体和包装载体组合而产生载体颗粒，从而降低重组病毒的产生率。这时，优选灵长类慢病毒(如HIV和SIV)之间的组合。
在本发明的载体DNA中，优选能防止gag蛋白的表达的那些改变。病毒gag蛋白在体内会被识别为外源物质，由此会产生抗原性。它也会影响细胞功能。所以，在本发明的基因转移载体中，优选改变gag蛋白以防止其表达。
为了防止gag蛋白的表达，可通过gag的起始密码子下游的碱基缺失、添加等而进行修饰，以使读码框移动。此外，优选使gag蛋白的编码区发生部分缺失。为了包装病毒，认为gag蛋白编码区的5’端是必需的。所以，优选本发明的基因转移载体含有已缺失羧基末端区的gag蛋白编码区。优选，缺失的gag编码区尽可能宽，但对包装效率没有大的影响。具体是，可缺失150bp的gag编码区的3’端下游区域。此外，也可以优选将gag蛋白起始密码子(ATG)取代为非ATG的密码子。要被取代的密码子优选是对包装效率几乎无影响的密码子。通过将含有上述构建的包装信号的本发明载体DNA导入适当包装细胞，可产生病毒载体。可从包装细胞的培养上清中收集所产生的病毒载体。
对用作包装细胞的细胞没有限制，只要它们是产生病毒常用的细胞系就行。在用于人类的基因疗法中，细胞的适当来源可以是人或猴。例如，可以用作包装细胞的人类细胞系是293细胞、293T细胞、293EBNA细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、C8166细胞、MT-4细胞、Molt-4细胞等。源自猴的细胞系的例子是COS1细胞、COS7细胞、CV-1细胞、BMT10细胞等。
因为以慢病毒如HIV、SIV和FIV为基础产生的本发明载体能够将基因整合到没有分裂的细胞中，所以它们可提高基因治疗的效率，使之突破用逆转录病毒载体进行的常规基因疗法的限制。就是说，用本发明的载体使各种治疗性基因整合到没有分裂的细胞染色体中成为可能。
本发明也可以用于各种遗传疾病的基因治疗。可通过将基因插入到染色体而进行治疗的目标疾病及其致病基因的例子如下Gaucher’s疾病的β-脑干脂酶基因(20号染色体)、血友病的凝血因子8(X染色体)和凝血因子9(X染色体)、腺苷脱氨酶缺陷病的腺苷脱氨酶基因、苯丙酮尿症的苯丙氨酸羟化酶基因(12号染色体)、Duchenne营养不良的肌营养不良蛋白基因(X染色体)、家族性高胆固醇血症的LDL受体基因(19号染色体)、中性纤维化的CFTR基因等。本发明还包括涉及其他多种基因的目标疾病，包括神经变性疾病如Alzheimer疾病和帕金森氏症、局部缺血性脑病、痴呆、难治的感染如AIDS。也可以考虑使HIV转录因子失活的治疗，其中本发明基于SIV的载体可以在取自AIDS患者的造血干细胞外进行体外操作，以便先于HIV感染而增加源自SIV的基因组的转录，再将转染的细胞回输到患者体内。而且，能用于慢性疾病的例子包括对缺血性心脏病来说抑制VEGF和FGF2基因的表达，对动脉硬化的基因治疗来说抑制细胞增生相关基因的表达，如细胞增生因子(PDGF，TGF-β等)和细胞周期蛋白依赖性激酶的表达。另外，对糖尿病来说，BDNF基因也可以是一个候选基因。而且，这种方法可以用于取代疗法中，其中将诸如遗传突变后可引起癌变的抑癌基因p53等基因整合到染色体中，该方法在体外将一种多重抗药基因导入源自骨髓的造血干细胞中，然后将这些细胞回输到患者血液中，从而突破癌症药物治疗的局限。就自身免疫病如多发性硬化症、慢性类风湿性关节炎、SLE和肾小球肾炎的基因治疗而言，通过T-细胞受体、各种粘附因子(例如，ICAM-1、LFA-1、VCAM-1和LFA-4等)、细胞因子和细胞因子受体(例如，TNF、IL-8、IL-6和IL-1等)、细胞增生因子(例如，PDGF和TGF-β等)和激活因子(例如MMP等)的反义表达可实现表达抑制。就过敏性疾病的基因治疗而言，通过IL-4、FcεR-I等反义表达也可实现表达抑制。对于涉及器官移植的基因治疗而言，通过将非人动物供体的组织相容性抗原换成人型抗原可提高异种移植的成功率。而且，可以考虑将外源基因导入人ES细胞的染色体中，从而在胚胎期补充缺陷基因，以补充全身循环的酶、生长因子等的缺陷。
附图简述

图1是使用猴免疫缺陷病毒克隆SIVagmTYO1的慢病毒载体系统的简图。
图2是SIVagm基因转移载体的结构示意图，其中用其他启动子序列取代了U3区，5’LTR启动子序列。
图3是SIVagm基因转移载体的结构示意图(其中用其他启动子序列取代了3’LTR的U3区)，以及预期通过所述载体在靶细胞中的逆转录产生的5’LTR中U3启动子区的结构。
图4是鉴别基因转移载体的包装信号的方法草图。
图5是使用在基因转移载体中gag蛋白的翻译起始密码子位置经过点突变产生的突变体鉴定包装信号的方法草图。
图6是用RRE共表达两种基因的载体的结构示意图。分别在RRE的上游和下游插入萤光素酶基因和β-半乳糖苷酶基因作为报道基因。再将剪接供体序列插入萤光素酶基因的上游并将剪接受体序列插入RRE下游。根据有或无剪接事件从载体中产生两种类型的mRNA。
图7是含各种RRE序列的载体的结构示意图。
图8显示了通过测定在含5’LTR作启动子并含各种RRE序列的载体上两种基因的表达水平所获得的结果。
图9显示了在用除5’LTR外的各种启动子构建的两基因共表达系统中的基因表达。用源自人巨细胞病毒(CMV)的启动子和源自哺乳动物细胞的启动子(EF1α启动子)作为启动子。在较下面的图中显示了该载体的结构图。
图10显示了两种基因共表达的载体，其中报道基因β-半乳糖苷酶和萤光素酶位置互换(较下面的图)。它们都是SIVagm基因转移载体且含RRE6/s(6964-7993)序列。该图显示了各载体上两种报道基因之间表达水平的比较结果。
图11显示了用荧光显微镜得到的用SIVagm SIN载体将EGFP基因导入G2-M期的停滞状态的293T细胞中的照片(A)和导入已用视磺酸诱导了分化的SH-SY5Y细胞中的照片(B)。
图12显示了EGFP基因用SIVagm载体导入人PBMC后其表达的流式细胞仪分析图。纵轴表示细胞数而横轴表示相应于EGFP表达水平的荧光强度。在M1区域的细胞是EGFP阳性，而图中数值代表EGFP-阳性百分比(％)。
图13显示了EGFP基因用SIVagm载体导入源自人PBMC的T细胞后其表达的流式细胞仪分析图。
图14显示了EGFP基因用SIVagm载体导入源自人类骨髓的CD34阳性细胞后，其表达的流式细胞仪分析图。用相应于EGFP和PE的两种颜色系列进行分析以确定EGFP阳性比。在R2区域的细胞是GFP阳性，图中数值表示EGFP阳性百分比(％)。
图15是EGFP基因用SIVagm载体导入源自人脐血的CD34阳性细胞后，其表达的流式细胞仪分析图。
图16显示了EGFP基因用SIVagm载体导入源自恒河猴骨髓的CD34阳性细胞后，其表达的流式细胞仪分析图。
图17显示了将已经用SIVagm载体导入了EGFP基因的源自人脐血的CD34阳性细胞植入NOD/SCID小鼠5和6周后用流式细胞仪分析外周血液中人细胞的百分比的图。用PE-标记的小鼠外周血液淋巴细胞中抗人CD45抗体给人淋巴细胞染色，接着结合EGFP进行双色分析。UL、UR、LL和LR分别在各图中表示左上、右上、左下和右下区。在UL和UR区的细胞是CD45阳性，在UR区的细胞是CD45和EGFP双阳性。在图中的数值代表各区所含细胞数相对于总细胞数的百分比(％)。
实施本发明的最佳方式下面结合实施例详细说明本发明，但不是用来限定本发明的。
SIVagm载体的产生和其性能的鉴定使用源自猴的非致病性免疫缺陷病毒克隆SIVagmTY01按照下列方法制备新的慢病毒载体。图1显示了载体系统的示意图。
在载体系统的制备中使用含源自非洲绿猴的非致病性免疫缺陷病毒克隆的SIVagmTY01。在后文中，以病毒RNA的转录起始位点为+1，标明了全部核苷酸编号。用pSA212(病毒学杂志，第64卷，第307-312页，1990)作质粒，其中已经插入了SIVagmTY01。再用Ligation High(东洋纺)按照所附说明进行所有的连接反应。
a.包装载体的产生首先，以pSA212作模板使用引物1F(SEQ ID NO1)和1R(SEQ ID NO2)经PCR得到相应于含有vif、和tat/rev第一外显子的区域(5337-5770)的DNA片段。经过将PCR引物设计成含有EcoRI限制酶位点来制备在其3’端带有EcoRI位点的DNA片段。用BglII和EcoRI消化后，PCR片段经琼脂糖凝胶电泳和Wizard PCR Preps DNA纯化系统(Promega)纯化。在pBluescripKS+(Stratagene)中将从上述步骤得到的DNA片段和编码gag/pol区(含有从XhoI位点(356)到BglII位点(5338)的区域)的DNA片段在XhoI-EcoRI位点连接。然后，对相应于含Rev反应元件(RRE)和tat/rev第二外显子(6964-7993)的区域的DNA片段进行PCR扩增。以对上述PCR片段的相似方式，用pSA212作模板并用引物2F(SEQ ID NO3)和2R(SEQ ID NO4)进行PCR，以便在3’端添加一个NotI位点。DNA片段用EcoRI和NotI消化后，纯化并在已经插有gag-tat/rev的pBluescript KS+的EcoRI-NotI位点处插入。
再合成含剪接供体(SD)位点的DNA片段(序列3F(SEQ ID NO5)和3R(SEQ ID NO6))。在合成时，分别在DNA的5’和3’端整合一个XhoI位点和一个SalI位点，然后在上述插有gag-tat/rev的pBluescript KS+中的XhoI位点插入该DNA。用XhoI和NotI消化所得质粒，并纯化包含从SD到tat/rev的区域的片段。然后在EcoRI位点已经插有XhoI/NotI接头(序列4F(SEQ ID NO7)和4R(SEQ ID NO8))的质粒pCAGGS(基因，第108卷，第193-200页，1991)的XhoI-NotI位点插入该片段。将上述方法所得质粒用作包装载体(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)。
b.基因转移载体的产生以pSA212为模板用引物5-1F(SEQ ID NO9)和5-1R(SEQ ID NO10)对源自SIVagmTY01的5’LTR区(8547-9053+1-982，在5’端加KpnI位点和在3’端加EcoRI位点)进行PCR扩增；用引物5-2F(SEQ ID NO11)和5-2R(SEQ ID NO12)对RRE(7380-7993，在5’端加EcoRI位点和在3’端加SacII位点)进行PCR扩增；或用引物5-3F(SEQ ID NO13)和5-3R(SEQ IDNO14)对3’LTR(8521-9170，在5’端加NotI和BamHI位点和在3’端加SacI位点)进行PCR扩增。以pEGFPC2为模板用引物6F(SEQ ID NO15)和6R(SEQ ID NO16)经PCR扩增源自pEGFPC2(Clontech)的CMV启动子和EGFP编码区(1-1330；它在5’端加SacII位点并在3’端加NotI位点和BamHI位点以及翻译终止密码子)。分别用KpnI和EcoRI限制酶、EcoRI和ScII限制酶、BamHI和SacI限制酶、和SacII和BamHI限制酶消化四种类型的PCR片段，接着纯化。然后将其按5’LTR、3’LTR、RRE和CMV启动子EGFP的顺序连接，之后插入pBluescript KS+中的KpnI-SacI位点之间(pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR)。当用β-半乳糖苷酶作报道基因时，如上所述经PCR制备分别含5’LTR区和3’LTR区的DNA片段。分别用限制酶KpnI和EcoRI以及限制酶NotI和SacI消化这些DNA片段后，将其纯化，然后分别插在pBluescript KS+中的KpnI-EcoRI位点和NotI-SacI位点(pBS/5’LTR.U3G2/WT3’LTR)。将含有pCMV-β(Clontech)的β-半乳糖苷酶编码区(820-4294)的NotI片段插入该质粒的NotI位点(pBS/5’LTR.U3G2/β-gal/WT3’LTR)。然后，将已经以pSA212为模板用引物7-1F(SEQ ID NO17)和7-1R(SEQ ID NO18)经PCR扩增的RRE序列(6964-8177；它在5’端加有EcoRI位点并在3’端加有NotI位点)插入质粒pBS/5’LTR.U3G2/β-gal/WT3’LTR的EcoRI-NotI位点(pBS/5’LTR.U3G2/RRE6/tr/β-gal/WT3’LTR)。在插入已经以pSA212为模板用引物7-2F(SEQ ID NO19)和7-2R(SEQ ID NO20)经PCR扩增的RRE序列(7380-7993；它在5’端加有EcoRI位点并在3’端加有NheI位点)前用EcoRI和NheI消化RRE序列。所得质粒(pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/β-gal/WT3’LTR)用NheI和SmaI消化并钝端化后，向其中插入源自pEGFPN2(Clontech)的CMV启动子区(8-592；钝端化的AseI-NheI片段)(pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR)。按照所附的说明用Blunting High(东洋纺)进行所有的钝端化反应。分别用KpnI和SacI消化质粒 pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR和pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR，得到含5’LTR-3’LTR之间的区域的DNA片段。将这些片段插入pGL3对照载体(Promega)的KpnI-SacI位点，用作基因转移载体(pGL3C/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal或EGFP/WT3’LTR)。为了鉴定包装信号，用KpnI和EcoRI从pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR质粒中切下5’LTR区，以pSA212作模板用引物8F(SEQ ID NO21)和一系列引物8-1R到12R(SEQ ID NO22-33)经PCR制备含不同长度的区域的各种DNA片段。将所得12种DNA片段中的每种都插入上述质粒中的KpnI-EcoRI位点。所得载体可以用于鉴定。
接着，将使用8-FSF(SEQ ID NO34)和8-FSR(SEQ ID NO35)并以pSA212作模板经PCR制备的DNA片段插入已经在KpnI-EcoRI位点插有使用引物8F(SEQ ID NO21)和8-3R(SEQ ID NO24)并且以pSA212作模板经PCR制备的DNA片段的载体上的EcoRI位点，获得已将移码导入了gag多肽编码区的载体。将使用8-FSF(SEQ ID NO34)和8-FSR(SEQ ID NO35)并以pSA212作模板经PCR制备的DNA片段插入已经在KpnI-EcoRI位点插有使用引物8F(SEQ ID NO21)和系列引物8-PMR1到9(SEQ ID NO36到44)并且以pSA212作模板经PCR制备的DNA片段的载体上EcoRI位点，获得已经在gag多肽的转录起始密码子(ATG)处导入了点突变的载体。
下面描述一种确认载体性能的典型方法。以每孔5×105个细胞的细胞密度将293T细胞铺板至6孔塑料平板(Sumitomo Bakelite)上。然后在CO2培养箱(含10％CO2气体的空气，37℃)中培养48小时。培养后，将培养基换成800μl/孔的OptiMEM用来转染。每孔的DNA用量对基因转移载体来说是300ng，对包装载体来说是600ng而对VSV-G表达载体(pHCMV-G，细胞生物学方法，第43卷，第99-112页，1994)来说是100ng。将这些DNA溶于100μl的OptiMEM中，然后向其中加入6μl的PLUS试剂。将该混合物搅拌并置室温15分钟后，向该混合物中加入4μl等份试样的用100μl的OptiMEM稀释的LIPOFECTAMINE，接着再搅拌并再置室温15分钟。将所得含有上述方法制得的DNA和LIPOFECTAMINE的复合物的溶液滴注到在6孔平板的孔中培养的293T细胞上并轻微搅拌，接着在CO2培养箱(含10％CO2的空气，37℃)培养3小时。培养后，向混合物中加入1ml/孔含20％灭活的胎牛血清的D-MEM，然后在37℃、CO2培养箱的10％CO2的空气中培养12小时。然后，将混合物的培养基换成2ml/孔的含有10％灭活的胎牛血清的D-MEM，接着培养24小时。用孔径0.45μm的滤膜(DISMIC-25CS滤膜；ADVANTEC)过滤细胞培养物的上清用于测定。
在制备浓缩原种时，首先以每孔2.5×106个细胞的细胞密度将293T细胞铺板至15-cm塑料平板(Sumitomo Bakelite)，然后在CO2培养箱(含10％CO2气体的空气，37℃)中培养48小时。然后，将培养基换成10ml/孔的OptiMEM用于转染。每孔的DNA用量对基因转移载体来说是6μg，对包装载体来说是3μg而对VSV-G表达载体(pHCMV-G)来说是1μg。将这些DNA溶于1.5ml的OptiMEM，然后向其中加入40μl的PLUS试剂。搅拌该混合物并置室温15分钟。向该混合物中加入60μl用1ml的OptiMEM稀释的LIPOFECTAMINE等份试样，接着再搅拌并再置室温15分钟。将含有上述方法制得的DNA和LIPOFECTAMINE的复合物的溶液滴注到在6孔平板的孔中培养的293T细胞上并轻微搅拌，接着在CO2培养箱(含10％CO2气体的空气，37℃)中培养3小时。培养后，向混合物中加入10ml/平板的含有20％灭活的胎牛血清的D-MEM，然后在37℃、含10％CO2气体的空气的培养箱中培养12小时。然后，将混合物的培养基换成20ml/平板的含有10％胎牛血清的D-MEM，接着培养24小时。用孔径0.45μm的滤膜过滤细胞培养物的上清并在Centriplus YM-100(Amicon)中在4℃以3000g离心170分钟使滤液超滤浓缩100倍。将浓缩的样品保存在-80℃以备测定。
使用人293T细胞系等能够测定上述制备的SIVagm病毒载体的基因转移效率。另外，通过下面描述的蚜栖菌素处理(在G1-S期停滞)或X-射线衍射(在G2-M期停滞)评价细胞周期的特殊期中基因转移的效率。
此外，当使用各种细胞进行导入试验时，能够测定出SIVagm载体是否能导入生理状态更接近的细胞中。例如，这类细胞包括经全转型视磺酸处理而诱导分化的人神经母细胞系RBTM1和SH-SY5Y细胞，还包括大鼠脑细胞的原代养物(见下文)等。
5’LTR的修饰慢病毒的5’LTR的转录活性一般取决于源自病毒的Tat蛋白的存在。因此，为了消除Tat依赖性以及用有较强转录活性的启动子序列取代来提高载体滴度，产生了一种SIVagm基因转移载体，其中作为5’LTR启动子序列的U3区用另外一种启动子序列取代(图2)。
按照下列方法实现用嵌合启动子对5’LTR的取代。用系列引物9-1F到3F(SEQ ID Nos45-47)和引物9R(SEQ ID NO48)以及以pSA212为模板经PCR扩增含有在5’LTR中TATA盒下游到gag区之间区域(9039-9170+1-982)的片段。接着，再分别用引物10-1F(SEQ ID NO49)和10-1R(SEQ IDNO50)以及以pCI为模板；用引物10-2F(SEQ ID NO51)和10-2R(SEQ IDNO52)以及以pEGFPN2为模板；用引物10-3F(SEQ ID NO53)和10-3R(SEQID NO54)以及以pEF-BOS为模板；以及用引物10-4F(SEQ ID NO55)和10-4R(SEQ ID NO56)以及以pCAGGS为模板经PCR扩增分别含有CMVL启动子(源自pCI(Promega)；1-721)、CMV启动子(源自pEGFPN2(Clontech)；1-568)、EF1α启动子(来自pEF-BOS的核苷酸2240-2740(核酸研究，第18卷，第5322页，1990))以及CA启动子(来自pCAGGS的核苷酸5-650)的片段。扩增后，将含有5’LTR的片段与上述分别含有每种启动子的片段混合。向其中加入相应于每种启动子5’端的引物(10-1F(SEQ ID NO49)、10-2F(SEQ ID NO51)、10-3F(SEQ ID NO53)或10-4F(SEQ ID NO55))和相应于5’LTR的3’端的引物(9R)，然后，再进行10个循环的PCR以得到由四种启动子的每一种与5’LTR组成的嵌合启动子的DNA片段。将所得DNA片段插入到基因转移载体(pGL3C/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR)中KpnI-EcoRI位点(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR、pGL3C/CMV.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR、pGL3C/EF1α.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR、pGL3C/CAG.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR)。
3’LTR的修饰在慢病毒载体中，当靶细胞逆转录时将包含在3’LTR中的启动子序列作为U3区整合到5’LTR的U3启动子区。结果发现基因转移载体3’LTR区所含的U3区变成了靶细胞基因组中参与基因表达的5’LTR的U3启动子(图3)。因此，制备SIVagm基因转移载体，在这种载体中3’LTR的U3区已用其他启动子序列取代，通过对所述其它启动子序列的评估可确定与靶细胞中基因表达有关的启动子是否也能够用非U3序列的其他启动子取代(图3)。另外，制备删除了3’LTR的U3区的SIVagm基因转移载体，通过对该载体的评估可判定靶细胞中5’LTR上的启动子序列是否可以缺失。
如下所述进行3’LTR的U3启动子序列的修饰和缺失。用引物11F(SEQID NO57)和11R(SEQ ID NO58)并使用pSA212作模板经PCR扩增不含3’LTR的U3的DNA片段。接着，用系列引物12-1F到3F(SEQ ID NO59-61)和引物12R(SEQ IDNO62)以及用已经插入了实施例2中所述方法获得的嵌合启动子的各种载体质粒pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR、pGL3C/EF1α.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR和pGL3C/CAG.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR作模板经PCR扩增已经用其他启动子取代了U3区的3’LTR。将PCR所得DNA片段用SaII和SacI消化、纯化并分别插入pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR的SalF-SacI位点(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/3LTRΔU3、pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/CMVL.R、pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/EF1α.R、pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/CAG.R)。
包装信号的鉴定将基因转移载体包装成载体颗粒需要在基因转移载体上的作为顺式作用元件的包装信号和由包装载体产生的反式作用蛋白。因为考虑到载体的包装效率提高会引起其滴度的提高，所以必须向载体中插入尽可能长的含有包装信号的区域来保持包装信号序列所形成的结构。另一方面，基因转移载体的包装信号序列和包装载体之间的重组可能产生野生型病毒，这种可能性能够通过将它们之间的重叠最小化来降到最小。因此，需要鉴定包装所需的最小区域。所以，为了有效包装基因转移载体以构建载体系统，需要对最小包装信号序列进行精确鉴定。用图4所示的方法能够实现对包装信号的这类鉴定。
将已经导入了图5所示突变的基因转移载体的包装效率与野生型基因转移载体的包装效率相比较可以解释包装是需要gag区域所表达的多肽还是gag区域的DNA序列本身。
新型两种基因共表达系统的研制Rev效应元件(RRE)是源自病毒的Rev蛋白的结合位点，它与RNA从核到胞质的转移有关。我们评价了用单一启动子启动的同时表达两种不同蛋白的系统是否能够使用RRE/Rev系统通过调节剪接效率来构建。
首先，为了测定两种不同蛋白的表达是否能够通过RRE来调节，产生了如图6所示的一种载体。更具体地说，将萤光素酶基因和β-半乳糖苷酶基因作为报道基因分别插入RRE的上游和下游。接着将剪接供体序列插入萤光素酶基因的上游并且将剪接受体序列插入RRE的下游来共构建一种载体。如图6所示，根据有或无剪接从这种载体中预期可以生产出两种类型的mRNA。换句话说，从经过剪接的mRNA可以生产出β-半乳糖苷酶蛋白，而从未经剪接的mRNA可以生产出萤光素酶蛋白。另外，为了评价通过修饰RRE序列是否能够既表达两种不同基因又控制这两种基因表达水平的比例，产生了一些载体，向各载体中插入六种类型之一的RRE序列来测定各载体中报道基因的表达水平。
如下所述产生插有两种基因表达系统的载体和用于检验RRE序列活性的载体。以pSP-luc+(Promega)作模板用引物13-1F(SEQ ID NO63)和13-1R(SEQ ID NO64)经PCR扩增DNA片段，该DNA片段中已在编码萤光素酶的基因片段的5’和3’端都添加了EcoRI位点。另一方面，以pEGFPN2(Clontech)作模板用13-2F(SEQ ID NO65)和13-2R(SEQ ID NO66)作引物经PCR扩增DNA片段，该DNA片段中已在编码EGFP的基因片段的5’和3’端都添加了EcoRI位点。
以pSA212作模板用14F(SEQ ID NO67)和14R(SEQ ID NO68)作引物经PCR可以得到含5’LTR的DNA片段，将此DNA片段插入用KpnI和EcoRI消化的质粒pBS/5’LTR.U3G2/RRE6/tr/β-gal/WT3’LTR(pBS/5’LTR.U3Met-/RRE6/tr/β-gal/WT3’LTR)。以pSA212作模板将两类引物15-1F(SEQ ID NO69)和15-2F(SEQ ID NO70)与三类引物15-1R(SEQID NO71)、15-2R(SEQ ID NO72)和15-3R(SEQ ID NO73)组合经PCR得到含有各种RRE序列的DNA片段。将这样得到的六种DNA片段用EcoRI和NheI或者用EcoRI和XbaI消化并纯化。通过用EcoRI和NheI消化质粒pBS/5’LTR.U3Met-/RRE6/tr/β-gal/WT3’LTR而切出RRE序列，用六种已纯化的DNA片段分别取代这些RRE序列从。将经PCR制得并用EcoRI消化后纯化的编码萤光素酶或EGFP的基因片段插入到所得质粒中的EcoRI位点用于RRE序列活性的检测(图7)。
下面通过取代转变报道基因。用NheI和SalI消化含有RRE6/s(6964-7993)序列的质粒pBS/5’LTR.U3Met-/RRE6/s/β-gal/WT3’LTR来除去含有β-半乳糖苷酶编码区的片段，然后向其中插入含有萤光素酶编码区的NheI-XhoI片段(源自pSP-luc+；17-1723)(pBS/5’LTR.U3Met-/RREc/s/luc+/WT3’LTR)。然后，将已经钝端化并纯化的来自pCMV-β(Clontech)的β-半乳糖苷酶编码区的NotI片段(820-4294)插入已经用EcoRI消化并钝端化的pBS/5’LTR.U3Met-/RREc/s/luc+/WT3’LTR。将所得质粒(pBS/5’LTR.U3Met-/β-gal/RREc/s/luc+/WT3’LTR)用于下列测定。按照所附说明用Blunting High(Toyobo)进行两种钝端化反应。
将以pSA212为模板用16F(SEQ ID NO74)和16R(SEQ ID NO75)引物经PCR得到的5’LTR的DNA片段插入已经用KpnI和EcoRI消化的质粒pBS/5’LTR.U3Met-/RREc/s/β-gal/WT3’LTR(pBS/5’LTR.U3G3/RREc/s/β-gal/WT3’LTR)。
将由PCR制备的编码EGFP的纯化基因片段用EcoRI消化后插入到pBS/5’LTR.U3G3/RREc/s/β-gal/WT3’LTR的EcoRI位点。所得质粒用KpnI-SacI消化来制备含5’LTR-3’LTR的DNA片段以便将其插到pGL3对照载体(Promega)的KpnI-SacI位点。所得质粒可以用于原位检验两基因表达系统。
用上述所得基因转移载体如下转染293T细胞以测定β-半乳糖苷酶和萤光素酶活性。正如图8所示，结果表明两种不同的基因能够在含有RRE序列的载体中共表达且RRE序列的取代可调节这两种基因的表达效率。另外，根据在没有包装载体的条件下共表达两种不同基因的结果，反映出在本基因表达系统中能够不依赖于Rev蛋白而表达两种基因。
在两基因共表达系统中对启动子的特异性对使用RRE的两基因共表达系统是否可以用于使用各种类型的启动子而不是上述实施例中所用的SIVagmTYO1的5’LTR启动子的其他表达系统进行了试验。将源自人巨细胞病毒(CMV)的其他启动子或源自哺乳动物细胞的启动子(EF1α启动子)用作启动子(图9下图)。
正如图9中所示，结果表明了使用非5’LTR的启动子可以实现两种基因的共表达。而且，发现根据RRE序列的存在可以调节两种基因的表达水平。因此，这表明使用RRE的两基因共表达系统可以广泛用于使用各种类型的启动子的表达系统。
报道基因的位置效应进行试验来测定将报道基因被插入RRE的上游或下游时各基因的表达水平是否变化。用SIVagm基因转移载体制备含有RRE6/s(6964-7993)序列的载体，其中将β-半乳糖苷酶和萤光素酶的位置互换(图10中下图)来比较两种载体上两种报道基因的表达水平。
正如图10的图所示，结果表明不论报道基因插入到RRE的上游或下游，报道基因的表达水平都没有差异。也就是说，发现使用RRE序列的两基因共表达系统可以用于通过1∶1摩尔比形成复合物而起作用的蛋白，特别是如各种受体和转录因子，的表达。
SIN载体(自我灭活载体)性能的鉴定考虑到实施例3中制备的基因转移载体pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/3’LTRΔU3缺失3’LTR的U3区，可假设作为自我灭活载体(SIN载体)提高了安全性，这种载体能够防止相应于整个载体的全长mRNA在靶细胞中转录。
为了测定基因转移效率是否因变成SIN而受影响，将SIVagm SIN载体对293T细胞的转染滴度与在相同条件下制备的含有野生型3’LTR的常规SIVagm载体的转染滴度进行比较。结果，常规型的转染滴度是2.4-2.8TU/ml而SIVagm SIN载体的转染滴度是2.5-2.9TU/ml。就是说，当常规型的转染滴度设定为100％时，SIVagm SIN载体的转染滴度为105％。
此外，进行实验以通过SIVagm SIN载体介导将EGFP基因转染入通过辐射而使细胞周期停滞的293T细胞和由视磺酸诱导了终末分化的SH-SY5Y细胞。用荧光显微镜对细胞周期停滞期的293T细胞中EGFP的表达进行观察显示基因被高效表达(图11中上图)。而且，确认在具有延伸的神经突的细胞中表达了EGFP，该细胞认为是SH-SY5Y细胞中分化成神经细胞的细胞，(图11中下图)。
如上所述，变成SIN后基因转移的效率下降。
基因由SIVagm SIN载体介导而向外周血淋巴细胞和CD34阳性细胞转移CD34阳性细胞作为含有造血干细胞的一种级分近来受到关注(血液，第87卷，第1-13页，1996)。因此，一旦能将基因转移到CD34阳性细胞中，基因就能够导入造血干细胞以及由其分化的所有类型的血细胞中。故用试验来评价通过SIVagm SIN载体介导将基因转移入人外周血单核细胞(PBMC)、人T细胞、源自人骨髓和源自脐血的CD34阳性细胞和源自恒河猴骨髓的CD34阳性细胞的可能性。
按照所附的说明，用含有200μl 0.5M EDTA的注射器将10ml人外周血收集到Lymphoprep试管(Nycomed)中，进行PBMC的分离。以2-2.5×105/孔的细胞密度将分离的细胞铺板至96孔塑料培养平板上，然后于37℃、5％CO2下在RPMI 1640培养基(Gibco BRL；含有5％灭活的牛血清)中培养。将分离的PBMC在含有5％FCS和5mg/ml PHA(SIGMA)的RPMI 1640中培养3天，向其中加入40U/ml IL2(SHIONOGI & CO)，继续培养3天，以诱导其分化成T细胞(最新免疫学方法6.16.4)。对源自人骨髓和源自脐血的CD34阳性细胞来说，按照所附的说明书复苏从PureCell公司购买的冷冻细胞并以2-2.5×105/孔的细胞密度铺板至96孔塑料培养平板上，接着在含有10％的BIT9500(StemCell)的IMDM(Gibco BRL)中培养。以2-2.5×105/孔的细胞密度将源自恒河猴(3-7岁，雄性；平均体重3.0kg)的骨髓的CD34阳性细胞铺板至96孔塑料培养平板上，接着在含有10％已灭活的牛血清(INTERGEN公司；REHATUIN?特级批号RB51901)的(-)MEM(SIGMA)中培养。
如下所述进行载体介导的基因转移。首先，从培养基中取出等份试样的上清液，在其上层添加实施例1中所述方法浓缩的载体pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF EGFP/3’LTRΔU3(滴度＝1-7×109TU/ml)至总体积50μl。然后，在32℃以200G将PBMC离心30分钟并在37℃、5 ％CO2中培养3小时。将200μl的培养基铺到其上层并将混合物培养48小时。对CD34阳性细胞来说，添加了载体后不离心，在37℃、5％CO2中将细胞培养3小时，在其上层加200μl培养基。将混合物培养48小时。
用流式细胞仪确认EGFP基因的转移。首先，从培养孔中收集培养的细胞，用含有3％FCS和0.05％NaN3的PBS冲洗。然后，按照所附的说明，将细胞的表面抗原用PE(藻红蛋白)标记的抗-CD3抗体、PE-标记的抗-CD14抗体和PE-标记的抗-CD19抗体(BectonDickinson)染色。染色后，洗涤细胞，然后用含有1％PFA的PBS固定以用于流式细胞仪分析。
结果表明在90m.o.i.时51.8 ％的人PBMC是EGFP阳性。尽管EGFP表达细胞的百分比随着m.o.i.而增加，但m.o.i.为36时EGFP阳性细胞的百分率是45％而m.o.i.高于此值时百分率的升高不超过大约50％。另外，用非浓缩的载体没有识别到基因的转移(图12)。对从人PBMC诱导的T细胞来说，在载体转染的48小时后的分析中，m.o.i.为50时在14.5％的细胞中识别到EGFP的表达，但是用非浓缩的载体没有识别到基因的转移(图13)。当m.o.i.为30时用源自人骨髓或源自脐血的CD34阳性细胞进行基因转移时，在26％的骨髓细胞(图14)或在11％的脐血细胞(图15)中表达了EGFP。发现在源自猴骨髓的CD34阳性细胞中转移效率随m.o.i.而增加，并且在m.o.i.为100时EGFP表达的百分比是58％(图16)。
上述结果显示SIVagm SIN载体能够高效介导基因转移进PBMC、T细胞和源自骨髓及源自脐血的CD34阳性细胞。
用SIVagm SIN载体将基因导入CD34阳性细胞后用该细胞重建造血系统使NOD/Lt小鼠(一种IDDM(胰岛素依赖型糖尿病)小鼠)与SCID小鼠(一种免疫缺陷小鼠)回交产生NOD/SCID小鼠株，其中所述SCID小鼠是已降低了NK细胞、巨噬细胞和补体的活性且源自SCID小鼠的T-细胞和B-细胞均已缺陷的联合免疫缺陷小鼠(免疫学杂志，第154卷，第180-191页，1995)。从Clea Japan购买属于该动物系的NOD/Shi-scid Jic小鼠(6周龄雄性)并喂养2周后用于实验。
将多能人细胞移植到NOD/SCID小鼠中以重建造血系统，使人的血细胞在小鼠体内循环(Nat.Med.，第2卷，第1329-1337页，1996)。将这种系统用来评价基因转移后由CD34阳性细胞引起的造血系统的重建以及用来评价其后血细胞中EGFP的表达(SCID种群恢复细胞试验)。
首先，将8周龄雄性NOD/SCID小鼠暴露在半致死剂量(300rad)辐射下。用日立MBR-1520R在150kv试管电压、20mA试管电流、0.5A1和0.1Cu滤膜(filter)下进行辐射。在辐射后的几小时内，用Myjector(带针头的Terumo29Gx1/2”注射器)经尾静脉注射移植细胞。
用于移植的细胞是源自人脐血的CD34细胞(PureCell)。用实施例9中所述的相同方法进行细胞培养和SIVagm SIN载体介导的基因转移。以100m.o.i.进行感染。在载体感染后将细胞培养6小时、收获、用IMDM(Gibco BRL)洗涤并以细胞密度1-3×106/ml悬浮于IMDM中。每只动物移植1×105个所得细胞/100μl。
移植后，将这些动物置于P3实验室级安全笼中无菌饲养。用4组小鼠进行实验，每组包括10只小鼠。向28只小鼠移植含有转移基因的细胞；向6只小鼠移植没有处理的细胞，剩余6只小鼠不进行移植，接着饲喂所有小鼠。在总共40只动物中，移植后6周时有25只存活，说明有60％的存活率。选5只存活的个体收集人细胞，其中2只移植了含有转移基因的细胞，3只移植了未处理的细胞。
移植的4-6周后收集外周血液。用剃刀截断尾静脉，收集50-100μl的外周血液并与10μl的0.5M的EDTA混合来防止凝固。向收集的血液中加入700μl的蒸馏水并吹打几次来裂解红细胞。再将700μl的2×PBS加入混合物中，混合，然后离心(5000rpm，1分钟)以回收外周血总白细胞。将所回收的白细胞悬浮于50μl的含有3％FCS和0.05％NaN3的PBS中，再向其中加入2μl的PE标记的抗人CD45抗体(Coulter)。将混合物冰浴孵育30分钟，用含有3％FCS和0.05％NaN3的PBS洗两次，用含有1％PFA的PBS固定以备流式细胞术分析。用两种颜色进行分析来检测小鼠白细胞中的人CD45-阳性细胞并检测表达EGFP的细胞。
结果表明移植了人CD34阳性细胞的小鼠的外周血中10-50％的白细胞表达人CD45。在移植了人CD34阳性细胞的小鼠的外周血白细胞中有20％的人CD45-阳性细胞有EGFP的表达(图17)，其中所述CD34阳性细胞已用SIVagm SIN载体导入了EGFP基因。
在下列(1)-(7)中描述了实施例中通用的方法。
(1)细胞培养在含有10％灭活型胎牛血清的D-MEM(GibcoBRL)中培养源自人胚肾细胞系的293T细胞(美国国家科学院学报，第90卷，第8392-8396页，1993)。293T细胞用蚜栖菌素处理(Galbiochem；以20μg/ml的终浓度处理48小时；停滞在G1-S期)或用X-射线辐射(以200rad/分钟辐射20分钟后，将细胞培养48小时；在G2-M期停滞)来使细胞周期停滞。在含有10％灭活型胎牛血清的RPMI1640(GibcoBRL)中培养人的成神经细胞RBTM1和SH-SY5Y(癌症研究，第58卷，第2158-2165页，1998)。通过全反型视磺酸(Sigma；以5μmol/ml的终浓度培养7天)处理来诱导分化为神经细胞。这些细胞应一直培养在塑料平板(Sumitomo Bakelite)中。
(2)制备大鼠脑细胞原代培养物的一般方法在含有5％灭活型胎牛血清和5％灭活型马血清(Gibco BRL)的D-MEM(Gibco BRL)中培养来自大鼠脑的原代培养细胞。用下列方法制备原代培养细胞。用二乙醚深度麻醉怀孕18天的SD大鼠，然后经腋动脉放血行安乐死。确认死亡后，通过剖腹术将子宫和胎儿整体切出。从子宫内无菌切除的胎儿的头部得到脑并将其放置在工作液(含有50％的D-MEM，50％PBS(Gibco BRL)，5×104U/L青霉素(Gibco BRL)和50mg/L链霉素)中。然后在立体显微镜下除去脑半球上的脑干和脑膜部分。用工作液冲洗脑组织一次，然后用手术刀将其切成条。用木瓜蛋白酶处理(在32℃，在含有1.5U/ml木瓜蛋白酶(Worthington Biochem)、0.2mg/ml半胱氨酸(Nacarai)、0.2mg/ml牛血清白蛋白(Sigma)、5mg/ml葡萄糖(和光)和0.1mg/ml的DNA酶I(GibcoBRL)的溶液中通过重复颠倒混合30分钟)后，通过吹打使细胞悬浮并离心(1200rpm，5分钟)收获。所收集的脑细胞用含有5％灭活的马血清、5％灭活的胎牛血清、5×104U/L青霉素和50mg/L链霉素的D-MEM洗两次。然后测定细胞数，以1-3×106每孔的细胞密度将细胞铺板至已用聚-L-赖氨酸(CellTight PL，Sumitomo Bakelite)包被的6孔平板上，在CO2培养箱中(37℃，5％CO2)培养。
(3)转染按照所附的说明用LIPOFECTAMINEPLUS(Gibco BRL)进行转染实验的所有步骤。以5×105每孔的细胞密度将293T细胞铺板至6孔塑料平板(Sumitomo Bakelite)上并在CO2培养箱中(37℃，10％CO2)培养48小时。在转染的30分钟前，将培养基换为800μl/孔OptiMEM(Gibco BRL)，然后继续培养。用于转染的DNA的量为300ng/孔基因转移载体和600ng/孔包装载体或空白载体。将DNA溶于100μl OptiMEM中后，向其中加入6μl的PLUS试剂(Gibco BRL)，搅拌，室温静置15分钟。向DNA和PLUS试剂(GibcoBRL)的混合物中加入用100μl OptiMEM稀释的4μlLIPOFECTAMINE等份试样，搅拌，室温再静置15分钟。将上述方法制备的含有DNA和LIPOFECTAMINE的复合物的溶液滴加在6孔平板上培养的293T细胞上，轻轻搅拌，然后在CO2培养箱中(37℃，10％CO2)培养3小时。完成培养后，给培养基中每孔加入1ml含有20％灭活的胎牛血清的D-MEM，然后在CO2培养箱中(37℃，10％CO2)孵育48小时以备β-半乳糖苷酶和萤光素酶的测定。
(4)β-半乳糖苷酶和萤光素酶的测定按照所附的说明，分别用β-gal发光检测试剂盒II(Clontech)和萤光素酶测定系统(Promega)进行β-半乳糖苷酶和萤光素酶的测定。所用的样品是细胞的裂解物，它们是通过用800μl/孔报道裂解缓冲液(Reporter Lysis Buffer)裂解经DNA转染的293T细胞，在4℃以12000g离心5分钟并分离上清而得到。在β-半乳糖苷酶测定中，将20μl的细胞裂解液和100μl的底物溶液混合，然后室温静置1小时，接着用发光计(AutoLumat LB953，berthold)测10秒钟发光强度。在萤光素酶测定中，将20μl的细胞裂解液和100μl的底物溶液混合并马上用发光计(AutoLumat LB953，berthold)测10秒钟发光强度。在两种测定中，每次测定都用一式三份的样品进行以测定平均值和标准差。
(5)PCR用PCR Supermix High Fidelity(Gibco BRL)进行PCR实验的所有步骤。以1μg模板DNA作底物，以终浓度为1nmol/ml的两种合成寡核苷酸作引物，将它们添加至90μl反应溶液中。用蒸馏水将混合物的总体积调整到100μl，然后在热循环仪(GeneAmp PCR系统9600；Perkin Elmer)中进行反应。首先将样品在94℃加热一分钟，然后以94℃30秒、55℃30秒和68℃90秒进行10个循环，再在68℃保持5分钟。DNA用Wizard DNA Clean-upSystem(Promega)处理反应溶液来纯化，用所需的限制酶消化，然后用1％低熔点琼脂糖凝胶电泳(SeaPlaque GTG琼脂糖；FMC Biochem；溶于TAE缓冲液)分离。从凝胶中切出所需大小的DNA片段并用Wizard PCR PrepsDNA Purification System(Promega)纯化以备连接反应。
(6)SIVagm载体介导的基因转移的一般方法以5×105每孔的细胞密度将293T靶细胞铺板至6孔塑料平板(SumitomoBakelite)上并在CO2培养箱中(37℃，10 ％CO2)培养48小时以用于测定。将含有终浓度8μg/ml的Polybrene(Sigma)的载体溶液平铺到靶细胞上用来导入载体。载体感染的48小时后，以X-gal作底物用β-Gal染色试剂盒(Invitrogen)给靶细胞染色，然后在倒置显微镜(DMIRB(SLR)；Leica)下观察来检测靶细胞中β-半乳糖苷酶的表达。测定用X-gal染色成蓝色的细胞数，将能使一个293T细胞表达β-半乳糖苷酶的载体量计算为1个转导单位(TU)。
(7)用抗体染色基因转移细胞的一般方法载体感染的48小时后，靶细胞用PBS(日研生物医学研究所)洗，在室温下用含有4％低聚甲醛(和光)的PBS固定30分钟，用PBS洗三次，每次5分钟，然后将其置室温下用含有2％正常山羊血清(Gibco BRL)的PBS封闭1小时。针对源自大鼠脑的已分化神经元的第一抗体，使用经含2％正常山羊血清的PBS将抗-MAP-2单克隆抗体(小鼠IgG，BOEHRINGERMANHEIM)稀释到2μg/ml制得的溶液。针对导入了β-半乳糖苷酶的细胞的第一抗体，使用经含2％正常羊血清的PBS稀释抗大肠杆菌的β-半乳糖苷酶多克隆抗体(兔；5 prime→3 prime，Inc.)到浓度8.2μg/ml制得的溶液。在37℃反应30分钟。与第一抗体反应后，细胞用PBS洗三次，每次5分钟，然后与第二抗体反应。10μg/ml用Texas Red标记的抗小鼠IgG多克隆抗体(山羊；EY LABORATORIES公司)，或4μg/ml用Alexa568标记的抗小鼠IgG多克隆抗体(山羊；分子探针公司)用含2％正常羊血清的PBS稀释后作为针对已导入EGFP的大鼠脑细胞的第二抗体。另一方面，对已导入β-半乳糖苷酶的大鼠脑细胞，分别使用经Alexa488标记的抗小鼠IgG多克隆抗体(山羊；分子探针公司)和经Alexa568标记的抗兔IgG多克隆抗体(山羊；分子探针公司)用含2％正常山羊血清的PBS稀释到4μg/ml的溶液。对已导入β-半乳糖苷酶的非大鼠脑细胞的细胞，使用以含2％正常山羊血清之PBS稀释的4μg/ml经Alexa568标记之山羊抗兔IgG多克隆抗体。所有与第二抗体的反应都是在37℃下进行30分钟。与第二抗体反应后，靶细胞用PBS洗三次，每次5分钟，将PBS覆盖其上，然后在倒置显微镜(DMIRB(SLR)；Leica)下观察荧光以检测目的蛋白的表达。
工业实用性本发明提供了能够用RRE序列表达两种外源基因的载体。在该载体中通过修饰RRE序列可以调节两种外源基因的表达水平的比例。此外，通过修饰源自病毒的调控序列能够克服对病毒蛋白的依赖性，从而表达来源的蛋白。通过在载体中使用含包装信号的最小区降低了经基因重组向野生型回复的危险，并因此提高了载体的安全性。本发明的载体适合于在基因治疗等中使用。
序列表<110>株式会社载体研究所(DNAVEC RESEARCH INC.)<120>用于表达两种外源基因的载体<130>D3-008PCT<140><141><150>JP 1999-175646<151>1999-06-22<160>76<170>PatentIn 2.0版<210>1<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>1gcagatctca accaggaggc gaggctgcat tttggg 36<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>2gcgaattcta cttactggtg ctgtaaagga gccaaa 36<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>3atcggaattc ttttattgta agatggattg gtttttaaat40<210>4<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>4cgggatccgc ggccgcggat atggatctgt ggagatagag gaacatat 48<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>5tcgagactag tgacttggtg agtaggctt29<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>6tcgaaagcct actcaccaag tcactactc29<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的寡核苷酸序列<400>7aatttctcga gcggccgca 19<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的寡核苷酸序列<400>8aatttgcggc cgctcgaga 19<210>9<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>9gcggtacctg gatgggattt attactccga tagga35<210>10<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>10gcgaattcga tagggcttga aacatgggta ctatttctgc 40<210>11<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>11gcgaattccc gtttgtgcta gggttcttag gcttct 36<210>12<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>12tccccgcgga tatggatctg tggagataga ggaacatatc 40<210>13<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>13gcgcggccgc ggatccgtcg acgcactttt taaaagaaaa ggga44<210>14<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>14gcgagctcta atgcaggcaa gtttattagc tttcta 36<210>15<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>15ggaattcccg cggtagttat taatagtaat caattacggg40<210>16<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成