专利名称：小麦一个抗旱基因TaPK及其编码蛋白与应用的制作方法干旱是影响植物生长和农作物 产量的最主要的环境因子，是制约农业生产和发展的全球性问题，干旱不仅严重影响植物生长发育，造成作物减产，而且是生态环境日益干旱。随着对植物抗旱的基础分子生物学研究的不断深入和对抗性基因的不断发现和挖掘，利用转基因手段分离克隆抗旱基因，培育抗旱新品种来获得抗干旱的转基因植物，已经成为当今植物生物技术领域研究的热点之一。目前利用基因工程技术开展植物抗旱方面的研究已取得了较大进展。研究表明，将植物本身以及其它生物中抗旱相关基因转入植物中，其异源转录和翻译产物可以使植物的抗旱能力提高。本实验室以新疆春小麦主栽品种新春6号(典型既抗旱又具备高水分利用效率的品种)为实验材料，利用cDNA-AFLP技术分析该品种在两叶一心水分胁迫下基因表达的差异，获得一些可能与小麦抗旱和水分高效利用相关的基因表达序列标签。通过测序及序列分析，发现其中一个上调序列与丙酮酸激酶基因具有很高的同源性，预测丙酮酸激酶基因在小麦抗旱过程中可能发挥一定的作用。小麦是我国最重要的粮食作物之一，但我国小麦的主产区受到干旱和盐胁迫较为严重，小麦产量不同程度的受到了影响，因此，开展小麦抗旱相关基因的筛选克隆和功能研究，培育抗旱小麦新品种是非常必要的，也是非常迫切的研究课题。
本发明根据小麦干旱胁迫下cDNA-AFLP表达谱的数据选出在小麦叶片在水分胁迫下诱导表达的TaPK基因，然后根据序列设计特异性引物，从小麦叶片cDNA文库中克隆得到其全长cDNA，并在烟草中进行功能验证。本发明提供了一种小麦抗旱基因TaPK及其编码蛋白与应用。本发明的小麦抗旱基因，名称为TaPK，其cDNA是序列表中SEQ ID No. I的核苷酸序列。序列表中的SEQ ID No. I由1542个碱基组成。以上所说的小麦抗旱基因TaPK的编码蛋白，是下述氨基酸序列之一 (1)序列表中的SEQID No. 2序列； (2)将序列表中的SEQIDNo. 2氨基酸残基序列经过取代、缺失和/或添加一至多个氨基酸残基且具有同等抗旱活性由(I)衍生的蛋白质。以上所说的小麦抗旱基因TaPK的编码蛋白，是具有序列表中SEQ ID No. 2的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中的SEQ ID No. 2由514个氨基酸残基组成。含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系、转基因植株也在本发明的保护范围之内。扩增TaPK中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围还包括基因TaPK在培育抗旱植物中的应用，该植物为小麦或烟草。提高含有小麦TaPK基因的转基因植物抗旱性的方法，是将小麦基因TaPK导入宿主植物的细胞、组织或植株个体，得到具有抗旱性能的植株。提高含有权利要求I中所述小麦TaPK基因的转基因植物抗旱性的方法，其特征在于，所述的小麦的抗旱基因TaPK通过含有所述小麦的抗旱基因TaPK的植物表达载体pCAMBIA-2301/TaPK导入细胞、植物组织或植物个体，用于构建所述植物表达载体的出发载体为 pCAMBIA-2301。 0015以上所说的植物宿主为小麦或烟草。本发明的有益效果在于，克隆得到了小麦抗旱相关基因TaPK，并通过根癌农杆菌介导的方法将该基因转入烟草，经过比较分析证明，与野生型烟草植株相比，含有本发明的TaPK基因的转基因烟草植株的抗旱能力明显提高。
图I为小麦样品的cDNA-AFLP的部分扩增结果，A :部分引物选择性扩增产物；B A中方框的放大图，箭头所示为差异表达片段。M :DNA分子量Marker，下同；CK :正常灌水处理；D :干旱胁迫处理。
图2为TaPK基因全长cDNA序列的扩增结果，CK :阴性对照；1 :正常灌水处理；2 :干旱胁迫处理；3 :干旱复水处理。
图3为构建的植物表达载体pCAMBIA-2301/TaPK的酶切验证结果，I pCAMBIA-2301/TaPK 酶切产物；2 pCAMBIA-2301/TaPK 质粒对照。
图4为转基因烟草的PCR鉴定，WT :野生型烟草；1，2，3 :转TaPK基因烟草。
图5为转基因烟草的抗旱鉴定，A :野生型烟草干旱18天后的表型；B :转TaPK基因烟草干旱18天后的表型。

RNA 提取采用 TRizol 法。
(1)取约0.Ig幼叶,在液氮预冷的研钵中迅速磨成粉末状,移入装有ImL Trizol试剂的2. OmL离心管中。
(2)振荡混勻15-30S,平放离心管在冰上5min,4°C, 12000rpm离心lOmin。
(3)取上清于2mL离心管中，加入与上清等体积的氯仿/异戊醇(24 I)上下颠倒混勻，4°C, 12000rpm 离心 IOmin0
(4)取上清至I.5mL离心管中，加入与上清等体积的预冷异丙醇，混匀后室温放置lOmin, 4°C，12000rpm 离心 IOmin0(5)弃上清，加入ImL预冷的75%乙醇洗涤RNA沉淀，4°C，12000rpm离心lmin。
(6)弃上清，用枪吸取剩余残液，超净台中，冰上干燥RNA沉淀5-10min，加入30yLl%的DEPC水溶解RNA，_70°C保存备用。cDNA的合成使用Takara的cDNA合成试剂盒进行,方法步骤按照试剂盒的说明进行
(1)将RNA溶液于65°C加热5min后迅速置于冰上，可以减弱二级结构的影响，提高反转录效率。
(2)在0.2mL离心管中加入下列试剂
RNA5 卩 L
5XI st strand synthesis buffer 4 jiL dNTP mixture I RNase inhibitor I xL 01igo(dT)I8 2ML Riverse transcriptase(M-MLV)(200U/fiL) 0.8 (xL RNase-free H Q_6 fiL
total20 ^iL
(3)轻柔搅拌混匀
(4)室温放置IOmin后，移至42°C恒温水浴锅内。
(5)42°C反应 Ih。
(6)反应结束后置于冰上冷却2min。
(7)在上述离心管内，按下列顺序配制cDNA第二链反应液
I st strand cDNA20 (iL
5 X2nd strand synthesis buffer30 ^iL
dNTP mixture3 ^iL
E,Coli DNA Polymerase2
E.Coli RNaseH E.Coli DNA Ligses Mixture 2 ^iL
RNase-free H^O_89 uL
total146 (xL(8)16°C反应lh，70°C加热 IOmin0
(9)加入4iiL 的 T4DNA polymerase,轻轻搅拌，37°C反应 lOmin。
(10)放入_20°C冰箱停止反应。3、引物序列
根据干旱胁迫下小麦幼苗cDNA-AFLP表达谱的差异片段设计特异性引物，以小麦叶片全长cDNA为模板扩增基因的全长cDNA。引物序列为TaPK-F5’-AAGGCATGGTGTCCAACGG_3’ ；TaPK-R5’ -AAAATGGTGTTGCGTTGCC-3’。4、PCR 反应体系(50 U L) 模板 cDNAI uL
IOxTaq buffer5 (iL
dNTPs (2.5mM each)0.5 iL
Primer Il(xL
Primer IIfiL
LATaq0.5 ^iL
dd H2O补至终体积50
PCR 反应程序为98°C预变性 2min ;94°C变性 30sec，56°C退火 30sec，72°C延伸 90sec，35个循环；72°C延伸7min。
PCR扩增产物使用I %琼脂糖凝胶电泳检测后发现在大约1500bp处有一个目的条带如附图2所示。5、扩增片段的回收、T载体连接
使用OMEGA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带，具体操作步骤参照说明书，同收产物与pGEM-T (Promega)载体连接，连接体系为
回收的PCR产物3iiL
2 X T4Ligase buffer 5 u L
pGEM-T 载体I ii L
dd H2O补至10 ii L于16°C水浴连接过夜。6、回收片段的克隆与测序
(I)大肠杆菌感受态细胞的制备
①从-70°C冰箱中取出保存于甘油管中的E.coliDH5a菌株，放在冰上缓慢解冻；
②使用接种环在LB固体培养基(不含Amp)上划线，将平板于37°C恒温培养箱倒置培养过夜；
③从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5 a单菌落，接种于3 5mL LB液体培养基中，37°C下振荡培养过夜(12h左右)；
④将该菌种悬液以I: 100的比例接种，取250 u L菌液转接到25mL LB液体培养基中，37°C振荡培养2 3h至0D_ = 0. 5左右；
⑤将菌液转入50mL离心管中，冰上放置IOmin；
⑥在4°C下，4000r/min离心lOmin。弃去上清,将管倒置Imin以便培养液流尽；⑦用冰上预冷的0.lmol/L的CaCl2溶液IOmL轻轻悬浮细胞，冰上放置30min ；
⑧0 4°C4000r/min离心lOmin,弃去上清,加入2mL预冷的0. lmol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置；
⑨在2mL制备好的感受态细胞中加入2mL30%甘油(即I: I体积，甘油终浓度15% )；
⑩将此感受态细胞分装成每份200ii L (I. 5mL离心管)，液氮速冻，快速转入-70°C冰箱保存。
(2)连接产物的转化 ①从-70°C冰箱中取出I管感受态细胞，置冰上缓慢解冻；
②向管中加入连接产物5ii L，轻弹混匀，冰浴静置30min ；
③将管置于42°C水浴中90sec，不要摇动；
④迅速转移至冰浴2min。
⑤加入600u I LB液体培养基(不含Amp)，混匀后37°C 220r/min振荡培养45min ；
⑥室温下6000rpm离心2min，弃掉650U I上清液后重悬菌体，加入32 X-gal和16 u I IPTG，然后用涂布器将其均匀涂布于含60 u g/ml Amp的LB平板上；
⑦将平板于37°C恒温培养箱倒置培养过夜，待出现明显单菌落时拿出；
⑧放入4°C冰箱I 2h，使蓝白斑显色明显；
⑨挑取白斑于LB液体培养基(60ii g/ml Amp)中摇菌，37°C 220r/min振荡培养过夜，提取质粒。
(3)重组质粒的PCR鉴定及测序
对重组质粒进行PCR鉴定，PCR扩增产物使用I %琼脂糖凝胶电泳检测，取阳性克隆的菌液送公司进行测序，测序结果见SEQ ID No. I。实施例2 CaMV35S启动子植物表达载体的构建
植物表达载体PCAMBIA2301的多克隆位点上含有限制性内切酶EcoRI和HindIII位点，根据植物CaMV35S启动子和TaPK的序列设计特异性引物，引物序列分别为CaMV35S_F (EcoRI) 5’ -GAATTCCCGCCTTCAGTTTAGCTTC-3’ ；CaMV35S-R (XbaI) 5’ -TCTAGAAGTCCCCCGTGTTCTCTCC-3’ ；TaPK-UP : (XbaI)5’ -TCTAGAAAGGCATGGTGTCCAACGG-3’ ；TaPK-DOffN (HindIII)5’ -AAGCTTAAAATGGTGTTGCGTTGCC-3，。使用上述引物扩增CaMV35S启动子和TaPK基因，然后分别用相应的限制性内切酶对PCAMBIA2301植物表达载体、CaMV35S启动子和TaPK基因进行双酶切，I %琼脂糖凝胶电泳分离后同收目的片段，然后进行连接，构建获得植物表达载体pCAMBIA-2301/TaPK。(I)质粒pCAMBIA-2301植物表达载体、CaMV35S启动子和TaPK基因双酶切 酶切体系如下
内切酶 l(EcoRI/XbaI)Iul
内切酶 2(XbaI/HindIII) I U I pCAMBIA-2301 载体 (CaMV35S 启动子 /TaPK 基因) 5 y I IOXbuffer MI U I
ddH20 补至20 u I
于37 °C恒温水浴酶切4h。(2)酶切产物的电泳与回收
双酶切完成后，以I X TAE为电泳缓冲液，将酶切产物进行I %琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下使用洁净刀片分别切下目的基因片段，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带。
(3)连接
经酶切的pCAMBIA-2301植物表达载体、CaMV35S启动子和TaPK基因目的片段以摩尔t匕I : 2 : 5的比例进行16°C过夜连接。
(4)转化 连接产物热激法转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，转化菌在含有Kan60 u g/ml的LB固体平板上37°C培养16h左右。
(5)重组子鉴定
挑取单克隆摇菌后提质粒，使用EcoRI和HindIII双酶切，酶切体系同实施例2中的(I)步骤，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，检测已切开的插入片段和载体片段大小，如附图3所示，证明载体构建正确。实施例3农杆菌感受态的制备与转化
1、农杆菌GV3101感受态的制备
(1)从新鲜的GV3101平板上挑取一个单菌落于YEB液体培养基(5ml)+Rif(50ug/ml)+Gen(50ug/ml)中，于 28°C、200rpm 振荡培养 18h ；
(2)取200ul菌液于20ml的含Rif(50ug/ml)及Gen (50ug/ml)的YEB液体培养基中活化培养至0D600 = 0. 5-0. 8收集菌液，冰浴30min ；
(3)4°C, 6000rpm离心5min,弃尽上清,收集农杆菌细胞；
(4)将沉淀的农杆菌使用IOml预冷的0.05mol/L CaCl2重悬,4°C, 6000rpm离心5min ；
(5)弃上清，再用lml0.05mol/lCaCl2 (10%甘油)重悬细胞，分装菌液200ul/管于I. 5ml离心管，液氮速冻后保存于_70°C。
2、冻融法转化根癌农杆菌GV3101
(1)吸取10u I上述重组载体质粒(约0. 5 ii g/ ill)，与200 ill GV3101感受态细胞轻轻混匀，冰浴30min ；
(2)液氮冻存5min，然后迅速置于37°C水浴3min；
(3)分别向离心管中加入600ill液体YEB培养基(Rif+Gen)，28°C、200rpm振荡培养
5h ；
(4)将上述培养液于6000rpm离心lmin，收集农杆菌细胞，弃去650U I液体培养基，剩余150iU重悬细胞；
(5)将菌液涂布在含有Kan50 u g/ml，Rif 50 u g/ml及Gen50 u g/ml的固体YEB培养基平板上，28°C倒置培养18-36h。
3、农杆菌PCR鉴定
菌体的PCR鉴定引物、体系及程序同实施例I。实施例4基因功能验证一烟草的转化、筛选及表性分析 I、烟草无菌苗的获得
将烟草种子用70%乙醇浸泡2min,再用0. I %升萊浸泡IOmin,无菌水反复冲洗6遍，然后接种于无激素的MS培养基上,于26°C, 16hr40 u mo I s—1光照,70%相对湿度条件下培养4-6周。
2、烟草的叶盘法转化
(1)取出从_70°C保存的实施例3中的农杆菌活化至OD6tltl= 0. 4-0. 6，作为转化用的浸染液；
(2)于超净工作台上，将浸染液倒入无菌培养皿中，将无菌烟草叶片剪成Icm2大小的方块，放入菌液中，振荡浸染IOmin ；
(3)取出烟草叶片，用滤纸吸干净叶盘上附着的菌液；
(4)在共培养基(MS+6-BA2. Omg/L+IAA 0. 3mg/L)上覆一张无菌滤纸，将浸染过的叶盘均匀地摆放在滤纸上，在26°C暗培养条件下共培养2-3天。
3、烟草再生苗的筛选
(1)将共培养过的烟草叶盘转移至MS+6-BA2.0mg/L+IAA0. 3mg/L+Kan50mg/L+Cb500mg/L的烟草诱导选择培养基上，让叶盘的伤口充分接触培养基，直至叶盘边缘逐渐产生淡绿色、致密的愈伤组织，继续培养出丛生芽；
(2)待丛生芽长至2-3cm左右时，将其切下转接到MS+IAAO.3mg/L+Kan50mg/L+Cb500mg/L的烟草生根选择培养基上进行生根培养；
(3)待转基因烟草根系生成后，将根系生长良好的转化植株，去除封口膜，室温环境中 进行炼苗7天左右，然后用水洗净培养基，将苗转入基质(蛭石腐质土 =2 I)中，26°C，16hr 40 v- mo I m_2 s—1光照,70%相对湿度条件下培养,前2_3天需遮阴、避光、保湿。
4、再生烟草的PCR鉴定
(1)再生烟草的DNA提取
①取0.Ig新鲜叶片，用玻棒在1.5ml离心管内充分研磨；
②加入400u I提取缓冲液，充分混匀，12000rpm离心5min ；
③小心吸取300iiI上清液，加入300ii I异丙醇，室温沉淀20min, 12000rpm离心IOmin,收集沉淀；
④将沉淀充分风干，加400u I TE溶解沉淀；
⑤加入400iil酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)，充分混匀，静置10min，12000rpm离心IOmin ；
⑥小心吸取上清，加入400u I氯仿/异戊醇(24/1)，充分混匀，静置lOmin，12000rpm离心IOmin ；
⑦小心吸取上清，加入40u 13M NaAC (pH5. 2),800 U I无水乙醇，_20°C沉淀过夜；
⑧4°C, 12000rpm 离心 15min,弃上清；
⑨70%酒精洗涤两次，吹干后用30ill TE溶解。
(2)再生烟草的PCR鉴定
以提取得到的再生烟草DNA为模板进行PCR扩增，扩增体系同实施例1，扩增结果如附图4所示。
5、转基因烟草的表型鉴定
对PCR鉴定呈阳性的植株和对照植株同时进行干旱(控水)处理，停止浇水18d后观察植株表型，结果表明对照植株已经萎蔫，部分叶片出现枯黄，而转TaPK基因的烟草植株生长良好，如附图5所示，说明本发明的小麦基因TaPK具有良好的抗旱性。


本发明涉及小麦的一个抗旱相关基因TaPK及其编码蛋白，同时涉及TaPK基因在提高小麦抗旱能力中的应用。本发明小麦抗旱基因TaPK具有序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列。该基因的编码蛋白是下述氨基酸序列之一(1)序列表中的SEQ ID No.2序列；(2)将序列表中的SEQ ID No.2氨基酸残基序列经过取代、缺失和/或添加一至多个氨基酸残基且具有同等抗旱活性由(1)衍生的蛋白质。本发明的基因能够有效提高植物对干旱胁迫的抗性，将在培育抗旱性增强的植物中发挥重要的作用。