一种胸苷酸合成酶基因3’-非翻译区多态性检测试剂盒的制作方法[0002]胸苷酸合成酶(Thymidylate synthase, TS)是由两个相同亚单位组成的二聚体蛋白，相对分子质量为72kDa，是DNA合成的关键酶，它催化脱氧尿苷酸甲基化，使之转变为脱氧胸苷酸。TS在DNA合成与修复、细胞增殖与分化中有十分重要的作用，是肿瘤化疗药5-Fu和甲氨蝶呤等重要靶酶。[0003]氟类药物包括5-氟尿嘧啶(5-FU)、替加氟、卡莫氟、氟尿苷、脱氧氟尿苷以及卡培他滨等。该类药物为尿嘧啶的氟代衍生物，在体内转化为5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸(5F-dUMP)后，可抑制胸苷酸合成酶(TS)，阻止脱氧尿苷酸(dUMP)甲基化为脱氧胸苷酸(dTMP)，从而抑制DNA合成。研究显示TS的高表达与这些药物的抗药性以及乳腺癌、胃癌和结直肠癌等肿瘤的预后差相关[0004]TS基因具有多态性，TS基因的多态性有可能导致酶活性或功能的改变，从而改变个体对癌症的易感性以及癌症患者对化疗药物的敏感性。TS基因3’ -非翻译区(3’ -untranslated region, 3’ -UTR)的1494bp处存在6个喊基缺失和插入多态。多数学者认为3’-UTR多态性在mRNA稳定和翻译中发挥重要作用，体外研究表明含有-6bp的基因型与含有+6bp的基因型相比mRNA出现了较高的降解率；+6bp/+6bp基因型的TSmRNA水平明显高于-6bp/-6bp基因型。因此认为_6bp等位基因降低TS mRNA的稳定性，从而降低了 TS的表达。[0005]研究表明TS-6/_6bp和_6/+6bp对氟类药物疗效好，+6/+6bp对氟类药物疗效差，因此，TS基因3’ -UTR多态性的检测对于指导临床肿瘤病人的个体化用药至关重要。但目前临床检测该基因多态性的检测试剂原料需多方配备，实验过程分步进行，耗时较长，容易污染，本方法简单快速可靠。[0006]实用新型内容[0007]本实用新型要解决的技术问题是提供一种胸苷酸合成酶基因3’ -非翻译区多态性检测试剂盒，该试剂盒结构简单、设计合理、使用方便、制造容易、检测过程不易受污染；该试剂盒在检测胸苷酸合成酶基因3’ -非翻译区多态性时具有敏感性高、特异性强、耗时短等优点；并且该试剂盒在运输过程中其内部的各种药剂不易破损。[0008]为了解决上述技术问题，本实用新型一种胸苷酸合成酶基因3’ -非翻译区多态性检测试剂盒，包括盒体和设置在盒体内的固定座，固定座上分别设置有放置装引物的试剂瓶、装酶混合物的试剂瓶、离心管和加样器吸头的孔，所述孔包括比放置在其内部的容器直径大的折痕线和沿径向设置的切口，所述孔的开口要小于放置在其内部的容器的直径，固定座上还设置有支撑板，所述支撑板的两端与盒体的内侧壁固定连接，所述支撑板的高度为所述固定座上表面到盒盖内表面的距离。[0009]其中，扩增引物为特异性扩增TSG3’ -UTR的引物，上游引物序列为CAAATCTGAGGGAGCTGAGT ;下游引物序列为:CAGATAAGTGGCAGTACAGA，引物浓度为 IOOpmo I/
L0
[0010]所述酶混合物包括浓度为0.4mmol/L 的 dNTPs，5mmol/L 的 Mg2+，2x Buffer,1U/25 μ I 的 rTaq ο
[0011]DraI mixture 包括 5x buffer, 3000U/ml 的 Dral。
[0012]本实用新型与现有产品相比，具有如下积极有益的效果:
[0013]本试剂盒结构简单、设计合理、使用方便、制造容易、检测过程不易受污染；本试剂盒在检测胸苷酸合成酶基因3’ -非翻译区多态性时具有敏感性高、特异性强、耗时短等优点；并且由于各种药剂都在固定座上的孔内固定，同时固定座与盒盖之间还设有支撑板，用于支撑试剂盒所受到的压力，保证了运输过程中试剂盒中的各种药剂不易破损。
[0014]


[0015]图1为本实用新型的整体结构示意图。
[0016]图2为本实用新型的固定座的俯视图。

[0017]下面结合附图和实施例对本实用新型进行进一步说明。
[0018]表I为本实用新型PCR反应体系。
[0019]如图1、2所示，本实用新型的一个实施例为胸苷酸合成酶基因3’ -非翻译区多态性检测试剂盒，包括盒体1、固定座2、支撑板3、装引物的试剂瓶4、装酶混合物的试剂瓶5，离心管6、加样器吸头7和孔8 ;固定座2位于盒体I内部，装引物的试剂瓶4、装酶混合物的试剂瓶5，离心管6、加样器吸头7分别放置在孔8内，孔8包括比放置在其内部的容器直径大的折痕线81和沿径向设置的切口 82，所述孔8的开口要小于放置在其内部的容器的直径，孔8的形状依据不同离心管、加样器吸头的形状和大小而设置。当容器放置到孔8内时，孔8沿切口 82打开并沿折痕线81弯曲，从而将容器夹紧使其不易晃动。固定座2上还设置有支撑板3，所述支撑板3的两端与盒体I的内侧壁固定连接，所述支撑板3的高度为所述固定座2上表面到盒盖内表面的距离。支撑板3将承担试剂盒所收到的压力，避免压坏其内部的容器。
[0020]其中，扩增引物为特异性扩增TSG3’ -UTR的引物，上游引物序列为CAAATCTGAGGGAGCTGAGT ;下游引物序列为:CAGATAAGTGGCAGTACAGA，引物浓度为 IOOpmo I/
L0
[0021]所述酶混合物包括浓度为0.4mmo1 /I,的 dNTPs, 5mmol/L 的 Mg2+,2x Buffer,1U/25 μ I 的 rTaq ο
[0022]DraI mixture 包括 5x buffer, 3000U/ml 的 Dral。
[0023]操作方法:
[0024]I)取模板 DNA
[0025]取病人全血1ml，常规提取DNA，取IulDNA作为模板。
[0026]2)反应体系
[0027]将各反应物质按照如下表I中反应体系进行配比:[0028]表1
[0029]