一种细菌生物膜研究模型的制作方法[0002]在自然界、某些工业生产环境以及人和动物的体内外，绝大多数细菌是附着在有生命或无生命物体的表面，以生物膜(biofilm)的方式生长[CostertonJ.ff., LewandowskiZ., CaldwelI D.E., KorberD.R., Lappin-Scott H.M., Microbialbiofilms, Annual Review ofMicrobiology, 1995, 49:711-745.] ? 细菌生物膜是指附着于生命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体[O’TooleG.A.,Kaplan H.B., Kolter R., Biofilm formation asmicrobialdevelopment, AnnualReview of Microbiology, 2000，54:49-79]。生物膜中水分含量可高达 97 %,除了水和细菌外，生物膜还含有细菌分泌的大分子多聚物、吸附的营养物质和代谢产物及细菌裂解产物等。生物膜的形成会使各种管道发生严重腐蚀，水质变差；致病菌在硬组织和医疗器械表面形成的生物膜往往导致感染，而感染增强了细菌的耐药性和对宿主免疫应答的抵御[Jesaitis AJ, Franklin MJ, Berglund D, et al, Compromisedhost defense on Pseudomonasaeruginosa biofilms:characterization of neutrophil andbiofilm interactions, J.1mmunol, 2003, 171(8):4329-4339];形成生物膜的细菌对高温、高渗、强酸等胁迫环境的抗性也明显提高[Latha Sabikhi, R.Babu,D.K.Thompkinson,Suman Kapila,Resistance of Mi croencapsulatedLactobacillus acidophil us LAlto Processing Treatments and Simulated GutConditions, FoodBioprocess Technol, 2010, 3:586-593]。研究发现，与浮游状态同一细菌相比，生物膜细菌的基因表达、信号传导和代谢特点均会有明显不同[An D, Parsek MR, Thepromise and peril oftranscriptional profiling in biofilm communities, CurrOpinMicrobiol, 2007, 10(3):292-6]。所以，如何在体外环境模拟生物膜状态及制备生物膜成为了生物膜研究的一个重要方向。[0003]目前体外构建生物膜的方法多数是采用将菌悬液涂于载玻片上，或细胞培养板中静置培养得到生物膜。此种方法得到的生物膜不易控制，制备量少，不能满足大量使用的需求。此外，细菌在生物膜内的生长呈现三维生长模式，而目前方法不能完全模拟细菌在生物膜内的这种生长方式。
[0004]针对上述问题，本发明提出一种生物膜模型。其优点是可按需要作不同菌株组合，模型内细胞经过生长繁殖，形成生物膜，细胞密度高，细胞状态与天然生物膜中细胞状态相似。微囊膜主要成分为多糖类物质，与生物膜成分相近。[0005]技术方案:[0006]本发明的技术方案是提供一种用于体外研究细菌生物膜的三维模型，其特征在于，具体步骤为:[0007]A:按106_108CFU/mL海藻酸钠的初始接种量将微生物细胞混悬在海藻酸钠溶液(0.l_50g/L)中，制备海藻酸盐微球，称之为A微球。其中，海藻酸盐微球的制备方法包括静电液滴法、锐孔挤出法、乳化-外部凝胶化法、乳化-内部凝胶化法或膜乳化法；[0008]B:将上述水凝胶微球浸入聚阳离子溶液中，微球与聚阳离子溶液体积比为1:1~1:40,反应1-60分钟，此时得到海藻酸钠-聚阳离子微胶囊。取出用生理盐水洗涤2-3次，称之为B微球；
[0009]C:将第二步中的B微球浸入金属螯合剂溶液中，液化微胶囊内部的海藻酸盐凝胶。参与液化反应的有机金属螯合剂溶液为40-70mmol/L的柠檬酸钠或50-200mmol/L的EDTA。微胶囊与有机金属螯合剂溶液体积比范围为1:1-1:40，反应1-60分钟，取出用生理盐水洗涤，此时得到内部液态核心的微胶囊，称之为C微球；
[0010]D:将B微球或C微球按照5-15%的体积接种到相应于可用于细菌细胞培养的培养基中，培养基种类、培养温度及培养时间依据所选定的细菌细胞确定。培养至细菌细胞为
IX IO9-1 X IO12细胞/毫升微球时结束培养。
[0011]其中，培养的细胞是任何可以产生生物膜的一种或多种细菌。如大肠杆菌(Escherichia Coli)、绿胺杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、乳酸杆菌(Lactobacilluslactis)、苏云金芽抱杆菌(BaciIIusthuringiensis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、等相关细菌菌株。
[0012]本发明与现有技术相比，具有如下优点和效果: [0013]1.生物膜载体微胶囊的 囊膜为生物多糖类物质，与天然生物膜成分相似，可以模拟生物膜。
[0014]2.微生物在微胶囊内呈三维生长方式，与自然环境生物膜内微生物的生长过程和生长状态更接近，可以模拟微生物在生物膜中的生长状态。
[0015]3.本发明产品的制备过程条件温和，有利于细胞活性的保持。
[0016]4.模型制备工艺简便，成本较低，可实现高通量大规模制备。



[0017]图1为海藻酸盐-聚阳离子微胶囊体系中培养绿脓杆菌不同时间菌体在微胶囊内生长过程图；
[0018]图2为微囊化培养绿脓杆菌经模拟胃肠液处理后与游离菌体活率比较图。

[0019]以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
[0020]实施例1
[0021]一种高通量高活性细菌生物膜模型，具体步骤为:
[0022]第一步:将5X IO8个大肠杆菌细胞混悬在ImL海藻酸钠溶液(8g/L)中，利用静电液滴法使液滴喷射入1.0moI/L的CaCl2溶液，反应30min，得到海藻酸钙凝胶微球粒径为300 μ m粒径分布呈正态分布，具有良好的单分散性；[0023]第二步:将上述水凝胶微球浸入质量浓度0.5%壳聚糖溶液中，微球与壳聚糖溶液体积比为1:10，反应10分钟，此时得到海藻酸钠-壳聚糖微胶囊。取出用生理盐水洗涤；
[0024]第三步:将第二步中的微胶囊浸入40-70mmol/L柠檬酸钠溶液中，液化微胶囊内部的海藻酸盐凝胶，反应5分钟，取出用生理盐水洗涤，此时得到内部液态核心的微胶囊；
[0025]第四步:将第三步制备的微胶囊按照10%的体积接种到大肠杆菌LB培养基中，37°C、200rpm培养48小时。培养结束细菌细胞(细胞/毫升微胶囊)为3 X IO11。
[0026]微囊化培养后的大肠杆菌在与细菌生物膜形成过程中菌体代谢相关的SdiA基因、tnaC基因、tnaA基因及tnaB基因表达与游离培养相比均上调5倍以上。(试验方法参考文献:Jintae Lee, ToshinariMaeda et al, Reconfiguring the quorum-sensingregulator SdiAof Escherichia coli to control biofilm formation via indoleandN-acylhomoserine lactones, Applied and EnvironmentalMicrobiology, 2009, p.1703-1716)
[0027]实施例2
[0028]第一步:将5X108乳酸菌细胞混悬在ImL混合有0&0)3的海藻酸钠溶液(8g/L)中，海藻酸钠与油相体积比为1:5，表面活性剂添加量为0.5% (v/v),乳化20min，加入HAC引发凝胶化反应。得到海藻酸钙水凝胶微球；
[0029]第二步:将上述水凝胶微球浸入到质量浓度0.3%壳聚糖溶液中，微球与壳聚糖溶液体积比为1:10，反应20分钟，此时得到海藻酸钠-聚阳离子微胶囊。取出用生理盐水洗漆; [0030]第三步:将第二步中的微胶囊浸入40-70mmol/L柠檬酸钠溶液中，液化微胶囊内部的海藻酸盐凝胶，反应5分钟， 取出用生理盐水洗涤，此时得到内部液态核心的微胶囊；
[0031]第四步:将第三步制备的微胶囊按照20%的体积接种到乳酸菌MRS培养基中，37°CU70rpm厌氧培养48小时，培养结束细菌细胞(细胞/毫升微胶囊)为2X1011。
[0032]培养结束，微囊化乳酸菌经培养后，与生物膜形成相关的IuxS基因表达与游离培养相比上调8倍，群体感应的信号分子A1-2浓度随培养时间延长也呈上升趋势。(试验方法参考文献:SaloomehMosleh1-Jenabian, Klaus Gori, Lene Jespersen, A1-2 signallingisinduced by acidic shock in probiotic strains ofLactobacillus spp., InternationalJournal of Food Microbiology, 2009, 135, 295-302.)
[0033]实施例3
[0034]第一步:将5X IO8鼠伤寒沙门氏菌细胞混悬在IOmL海藻酸钠溶液(8g/L)中，海藻酸钠与油相体积比为1:10，表面活性剂添加量为0.1 (v/v)乳化IOminJaA CaCl2引发凝胶化反应。得到海藻酸钙水凝胶微球；
[0035]第二步:将上述水凝胶微球浸入质量浓度0.3%聚赖氨酸溶液中，微球与聚赖氨酸溶液体积比为1:10，反应15分钟，此时得到海藻酸钠-聚赖氨酸微胶囊。取出用生理盐水洗漆;
[0036]第三步:将第二步制备的微胶囊按照10%的体积接种到沙门氏菌属BD培养基中，37°C、200rpm厌氧培养48小时。培养结束细菌细胞(细胞/毫升微胶囊)为3 X IO11。
[0037]结果发现，微囊化培养组中鼠伤寒沙门氏菌与生物膜形成相关的norB，norC和seo基因表达分别上调了 20、6、和7倍。(试验方法参考文献=Xinlong Heand Juhee Ahn, Differential geneexpression in planktonic and biofilm cellsof multipleantibiotic-resistant Salmonella Typhimurium andStaphy1coccusaureus, Fems Microbiology Letters, 2011, 325 (2):180-188.)
[0038]实施例4
[0039]第一步:将5X IO8假单胞菌细胞混悬在IOmL海藻酸钠溶液(8g/L)中，海藻酸钠与油相体积比为1:10,表面活性剂添加量为1% (v/v)乳化20min，加入CaCl2引发凝胶化反应。得到海藻酸钙水凝胶微球；
[0040]第二步:将上述水凝胶微球浸入质量浓度I %聚赖氨酸溶液中，微球与聚赖氨酸溶液体积比为1:10，反应10分钟，此时得到海藻酸钠-聚赖氨酸微胶囊。取出用生理盐水洗漆;
[0041]第三步:将第二步制备的微胶囊按照5-15%的体积接种到假单胞菌LB培养基中，37°C、200rpm培养48小时。培养结束细菌细胞(细胞/毫升微胶囊)为I X 1011。
[0042]结果发现，微囊化培养组中，假单胞菌菌株对工业污水中甲苯的去除率与游离菌体相比提高了 20%，说明微胶囊内的菌株自身提高了对污水处理这种胁迫环境的抗性，模型培养过程菌体生物膜的形成过程也提高了菌体对甲苯的分解率。(试验方法参考文献:Cao Mingfu, Zhu Xun et al., Biofilm formation of Membrane Bioreactors (MBR)for toluene removal, Chinese Journal of Applied andEnvironmentalBiology, 2011，17(5):731-735.)
[0043]实施例5
[0044]第一步:将5X IO8绿脓杆`菌细胞混悬在IOmL海藻酸钠溶液(8g/L)中，海藻酸钠与油相体积比为1:10，表面活性剂添加量为0.5% (v/v)乳化20min，加入CaCl2引发凝胶化反应。得到海藻酸钙水凝胶微球；
[0045]第二步:将上述水凝胶微球浸入质量浓度0.7%聚赖氨酸溶液中，微球与聚赖氨酸溶液体积比为1:10，反应10分钟，此时得到海藻酸钠-聚赖氨酸微胶囊。取出用生理盐水洗漆;
[0046]第三步:将第二步中的微胶囊浸入40-70mmol/L柠檬酸钠溶液中，液化微胶囊内部的海藻酸盐凝胶，反应10分钟，取出用生理盐水洗涤，此时得到内部液态核心的微胶囊；
[0047]第四步:将第三步制备的微胶囊按照10%的体积接种到绿脓杆菌BD培养基中，37°C、200rpm培养48小时。培养结束细菌细胞(细胞/毫升微胶囊)为2.1XlOll0
[0048]培养结束后，微囊化组中，产生生物膜绿脓杆菌对抗生素及高渗透压的抗性分别提高了 3倍和4.5倍，为这种常见的病原菌的抗生素抗性机制和逆境高抗性机制提供了理论依据。(试验方法参考文献:WiIIiams P, Camara M, Quorum sensing andenvironmentaladaptation in Pseudomonas aeruginosa: a tale of regulatorynetworksand multifunctional signal molecules, Curr OpinMicrobiolj 2009, 12 (2):182-191.)
[0049]实施例6
[0050]第一步:将5 X IO8金黄色葡萄球菌细胞混悬在ImL海藻酸钠溶液(8g/L)中，利用静电液滴法使液滴喷射入1.0mol/L的CaCl2溶液，反应30min，得到海藻酸钙凝胶微球粒径为300 μ m粒径分布呈正态分布，具有良好的单分散性；
[0051]第二步:将上述水凝胶微球浸入质量浓度0.4%壳聚糖溶液中，微球与壳聚糖溶液体积比为1:10，反应10分钟，此时得到海藻酸钠-壳聚糖微胶囊。取出用生理盐水洗涤；
[0052]第三步:将第二步中的微胶囊浸入40-70mmol/L柠檬酸钠溶液中，液化微胶囊内部的海藻酸盐凝胶，微胶囊与有机金属螯合剂溶液体积比范围为1:10，反应10分钟，取出用生理盐水洗涤，此时得到内部液态核心的微胶囊；
[0053]第四步:将第三步制备的微胶囊按照10%的体积接种到金黄色葡萄球菌BD培养基中，37°C、200rpm培养48小时。培养结束细菌细胞(细胞/毫升微胶囊)为2 X IO11。
[0054]培养结束，微囊化组中，金黄色葡萄球菌的致病基因rot和arl的表达与游离培养相比分别上调了 5倍和2倍。这些基因处于生物膜形成基因下游，受生物膜形成的控制，只有生物膜形成基因表达，才会启动致病基因的表达。(试验方法参考文献:Cotar, AL, Dinu, S，Chifiriuc, MC, et al, Molecular markers ofquorum-sensing andvirulence gene regulators in Staphylococcus aureusstrainsisolated from biofilm associated infections, RomanianBiotechnologicalLetters, 2008，13(3):3771-3778.)