专利名称：蛋白酶体抑制剂及其用途的制作方法蛋白酶体抑制剂及其用途技术领域和本发明在其一些实施方式中涉及蛋白酶体抑制剂及其用途。蛋白酶体是真核细胞中的主要蛋白水解复合物，用于降解多种细胞蛋白质。该多蛋白复合物存在于细胞质和细胞核中，催化短寿命调节蛋白的ATP-依赖性蛋白水解，以及受损和异常蛋白质的快速消除。26S蛋白酶体是 2. 5MDa的大复合物。基于生物化学分析，该复合物可分解成两 种具有不同功能的亚复合物，作为蛋白水解组分的20S核心颗粒(CP)和用于识别、展开多泛素化的底物并将其转位至20S CP的19S调节颗粒(RP)，它们在那里被降解。20S CP是670kDa的桶状蛋白质复合物，其由四个堆叠的七元环(4X7个亚基)，即两个外部的α环和两个内部的β环组成。两个匹配的α环位于桶的外缘，朝向19S调节复合物。蛋白水解活性位点位于两个相同的β_环上，它们位于20S复合物的中心。在真核细胞中，蛋白酶体的催化活性仅限于三个β_亚基。尽管蛋白酶体能够催化大多数氨基酸之间的酰胺键，但是使用荧光底物测定的蛋白水解活性确定了三种不同(尽管不是结论性的)的裂解偏爱[5] :β 2具有胰蛋白酶活性(即在碱性残基后裂解)；β 5表现出糜蛋白酶活性(chymotryptic activity)(即在疏水残基后裂解)；以及β I具有“半胱天冬酶样”或“酸性残基后的”活性。在所有三个活性亚基中，蛋白水解活性与它们的N-端苏氨酸残基相关，其充当肽键水解中的亲核剂。蛋白酶体抑制剂作为候选药物的用途来自如下观察结果在特定的浓度下，它们能够在某些来自白血病和淋巴瘤的细胞中诱导凋亡而不会相似地影响它们的非转化的对应细胞(counterpart)。进一步的研究和临床试验导致被称作硼替佐米的经修饰的含硼的二肽Pyz-Phe-boroLeu被批准为用作治疗多发性骨髓瘤的药物。大多数合成的蛋白酶体抑制剂是模拟蛋白质底物的短肽。通常，与20S蛋白酶体活性位点内的苏氨酸残基反应并抑制该苏氨酸残基的药效团结合该肽的羧基残基。一些典型的合成抑制剂是醛基肽类(或肽醒类，peptide aldehyde)、乙烯砜肽类(peptide vinyl sulfone)、硼酸肽类(peptideboronate)以及环氧酮肽类(peptide epoxyketone)。大多数天然的来自细菌的非肽类抑制剂中值得注意的是裂-乳胱氨酸(乳胞素)-β -内酯(claso-lactacystin-β -lactone)(Omuralide)。相关的药物例如 Salinosporamide A (NPI-0052)和 Carfilzomib (PR-171)目前正处于后期临床试验阶段。但是，尽管已在蛋白酶体抑制剂的研发中付出了大量努力，但是由于耐药性细胞的出现和现有抑制剂对不同细胞的不同作用，仍存在对新的抑制分子的不断增加的需求。大多数现有的蛋白酶体抑制测定法是基于无细胞测定，其需要从不同的来源纯化26S或20S蛋白酶体。在原理上此类测定法可适用于高通量筛选，但是它们难以预测活细胞中的抑制活性。为了解决这一问题，将基于细胞的筛选结合于药物发现过程中。例如，目前可从Promega Corporation获得用于测量培养的细胞中糜蛋白酶样、胰蛋白酶样或半胱天冬酶样蛋白酶体活性的经修改的“经典”方法[Moravec RA et al.，2009，Anal Biochem387 :294-302]。还使用了多种荧光报告分子来监测蛋白酶体的活性。Dantuma等人使用位于N-端的标准的肽键构建了 GFP与泛素的融合物(Ubi [G76VJ-GFP)[Nat Biotechnol 18:538-543,2000]。Bence等人设计了另一种蛋白酶体传感器构建体，其是GFP与的人工肽CLl(在酵母中鉴定出)的融合物(Science 292:1552-1555，2001) ο Andreatta研究小组和BD Biosciences Clontech提出了表达具有小鼠鸟氨酸脱羧酶(MODC)片段的GFP融合蛋白的传感器细胞系，所述融合蛋白可在无需泛素化的情况下被蛋白酶体降解[Andreatta等人，2001, Biotechniques 30:656-660]。近期基于稳定表达p27kipl-GFP融合物的另一种报告细胞系被用于发现新的蛋白酶体抑制剂argyrinA[Nickeleit I等人，2008，Cancer Cell 14:23-35]。大多数这些GFP-融合报告子的共同特征为它们是基于在正常条件下被蛋白酶体快速降解的蛋白质，导致细胞产生非常低的荧光，而在蛋白酶体活性被抑制后，由于报告蛋白质的积累而使得细胞的总荧光信号迅速增加
根据本发明的一些实施方式的一方面，本文提供了治疗抑制蛋白酶体对其有利的疾病的方法，所述方法包括向个体给予治疗有效量的选自NSC321206、NSC310551、NSC99671和NSC3907的化合物，由此治疗所述疾病。根据本发明的一些实施方式的一方面，本文提供了治疗抑制蛋白酶体对其有利的疾病的方法，所述方法包括向个体给予治疗有效量的结合细胞的蛋白酶体的化合物，所述化合物包含与配体结合的铜，所述配体被构造为使得与蛋白酶体结合后铜与蛋白酶体的β 2亚基的半胱氨酸31相互作用并且进而与蛋白酶体的β 3亚基的半胱氨酸118相互作用，由此治疗所述疾病。根据本发明的一些实施方式的一方面，本文提供了鉴定蛋白酶体抑制剂的方法，所述方法包括(a)使候选抑制剂与表达本发明的分离多肽的细胞群接触；和(b)分析所述多肽在细胞群中的细胞定位，其中多肽定位的变化是所述候选抑制剂为蛋白酶体抑制剂指征。根据本发明的一些实施方式的一方面，本文提供了在存在或不存在蛋白酶体抑制剂的情况下具有不同细胞定位的包含P53氨基酸序列的分离多肽，所述多肽与可检测的部分连接。根据本发明的一些实施方式的一方面，本文提供了表达本发明多肽的细胞群。根据本发明的一些实施方式的一方面，本文提供了包含作为活性成分的选自NSC321206、NSC310551、NSC99671和NSC3907的化合物和药学可接受的载体的药物组合物。根据本发明的一些实施方式的一方面，本文提供了包含作为活性成分的结合细胞的蛋白酶体的化合物的药物组合物，所述化合物包含与配体结合的铜，所述配体被构造为使得与蛋白酶体结合后铜与蛋白酶体的β 2亚基的半胱氨酸31相互作用并且进而与蛋白酶体的β 3亚基的半胱氨酸118相互作用。根据本发明的一些实施方式的一方面，本文提供了包含作为活性成分的根据本发明方法鉴定的化合物和药学可接受的载体的药物组合物。根据本发明的一些实施方式的一方面，本文提供了包含编码本发明多肽的核酸序列的分离的多聚核苷酸。根据本发明的一些实施方式，所述疾病是癌症。根据本发明的一些实施方式，所述疾病是炎性疾病。根据本发明的一些实施方式，所述疾病是神经变性疾病。根据本发明的一些实施方式，所述分离的多肽包含SEQ ID NO :3列出的氨基酸序列。根据本发明的一些实施方式，所述分离的多肽包含SEQ ID NO :6列出的氨基酸序列。根据本发明的一些实施方式，所述分离物在存在蛋白酶体抑制剂的情况下具有细胞核定位而在不存在蛋白酶体抑制剂的情况下具有细胞质定位。根据本发明的一些实施方式，所述分离的多聚核苷酸包含SEQ ID NO :4中列出的核酸序列。根据本发明的一些实施方式，所述分离的多聚核苷酸包含SEQ ID NO :5中列出的核酸序列。根据本发明的一些实施方式，所述细胞群包含H1299非小细胞肺癌细胞。除非另外定义，本文使用的所有技术和/或科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管可使用与本文所述实施方式相似或相同的方法和材料实施或检测本发明的实施方式，但是仍在下文描述了示例性方法和/或材料。如有冲突，以包括定义在内的专利说明书为准。另外，所述材料、方法和实施例仅为示例性的并且不一定具有限制性。通过结合附图和图像仅以举例说明的方式在本文中描述本发明的一些实施方式。在具体结合附图的详细内容时，应强调的是所显示的细节仅为示例性的并且用于举例说明本发明的实施方式。就此而言，描述与附图一起使得如何实施本发明的实施方式对本领域技术人员是显而易见的。在所述附图中图I是PIR蛋白的示意图。PIR蛋白由与人类突变的(R175H)p53的C-端融合的黄色荧光蛋白(YFP)组成，其在双组分核定位信号中(SEQ ID NO 7)携带三联突变，其中三个连续的赖氨酸残基Lys-319、Lys-320和Lys_321被丙氨酸置换。图2A-图21是图解说明用蛋白酶体抑制剂处理后PIR蛋白的细胞核积累的照片。A-H :将PIR细胞暴露于指定浓度的MG132、硼替佐米和ALLN 6小时并监测PIR报告子的YFP-荧光(上图)或者用抗-β_连环蛋白抗体染色(下图)。I :将PIR细胞在无蛋白酶体抑制剂的情况下(对照)或与IOyM MG132温育6h。分离细胞质和核组分的细胞裂解物。通过免疫印记法用多克隆抗-P53抗体检测到对应于PIR报告子的条带。 图3A-图3H是图解说明鼠双微体2 (MDM2)促进PIR核易位的照片。在无另外的刺激下，MDM2的过表达引起PIR核定位。用野生型MDM2、p53结合缺陷的MDM2突变体(D9-58)或E3连接酶位点(Ser440)被破坏的MDM2突变体转染PIR细胞。通过用抗-MDM2单克隆抗体进行免疫荧光染色使表达P53和MDM2 二者的细胞可视化。PIR在表达wt MDM2和MDM2(Ser 440)的细胞中具有核定位，而在用MDM2 (D 9-58)转染的细胞中保留在细胞质内。图4A-图4H是图解说明Mdm2siRNA防止硼替佐米诱导的PIR向核易位的照片。用200pmol对照-siRNA或Mdm2-siRNA瞬时转染PIR细胞。转染后四十八小时，加入硼替佐米(O. I μ Μ)并再持续6小时，并且如材料和方法中所述进行MDM2的免疫荧光染色。图5是筛选操作的流程图。对于筛选测定，将H11299-PIR报告细胞接种至384-孔板24小时并在两个浓度(I μ M和10 μ Μ)下用NCI Diversity Set library的化合物处理,每孔一种化合物。温育12小时后，用3%多聚甲醛固定细胞并通过自动化显微镜系统筛选PIR蛋白的定位。分析细胞图像的PIR核易位并通过显微镜和生物化学方法验证所选的选中物(hit)，然后检测化合物的细胞毒性。图6是图解说明在筛选中鉴定的候选抑制剂对PIR核定位的作用的表格。 图7A-图7B是图解说明用选中化合物处理后全细胞裂解物的泛素化蛋白增加的照片。用以下浓度的选中化合物将PIR细胞处理6小时NSC3907-20 μ M、NSC99671_50 μ Μ、NSC310551-0. 3μΜ、NSC321206-0. 15 μ Μ。已知的蛋白酶体抑制剂 MG132 (5 μ Μ)用作阳性对照。对PIR细胞的全细胞裂解物进行免疫印迹分析以测定泛素(上图)和连环蛋白(中图)。微管蛋白(下图)信号表示内载荷参照。图8是图解说明候选抑制剂的体外蛋白酶体抑制的图。在存在30 μ M候选抑制剂的情况下(NSC3907为100 μ Μ)将从兔肌肉纯化的26S蛋白酶体温育指定的时间，将5 μ M浓度的MG-132用作对照。图9是图解说明候选抑制剂的细胞毒性活性的图。A :在O. 1-100 μ M的11个浓度下用选中化合物将PIR-H1299细胞处理48小时。如(材料和方法)所述进行细胞活力测定。将结果表示为GI5tl，相对于未处理的对照将被处理的细胞的生长减少50%的浓度。所有结果显示为六个重复实验孔的平均值和标准偏差。图10是图解说明NSC321206对癌细胞活性的作用的图。图11是显示候选抑制剂对NCI-60组人肿瘤细胞系的体外细胞毒性的图表。所述结果是基于作为Developmental Therapeutics Program的一部分在国家癌症研究所(National Cancer Institute)进行的针对全组60种人癌细胞系的抗癌药物筛选的数据。将所述组分为代表不同组织的九个亚组白血病、黑色素瘤、以及肺癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和中枢神经系统癌。将从该检测获得的结果表示为将细胞生长抑制50%的摩尔浓度的-log(活性化合物的-log GI50 > 4. 00)。图12A-图12B是与胰蛋白酶样活性位点相关的NSC321206的潜在对接位点(docking site)的图解。图12A图解说明了所述胰蛋白酶样活性位点的深疏水口袋以及其中对于NSC321206的Cu原子而言位于理想构象的两个Cys残基。图12B是胰蛋白酶样活性位点的空间填充图。将催化性苏氨酸描绘为橙色斑块，以红色示出万珂(Velcade)骨架。显示出三个能量上最优选的NSC321206群簇。

蛋白酶体是具有复合结构和功能的酶。它们大量存在于所有细胞中，无论是正常细胞还是癌性细胞，并且其功能是降解所有调节蛋白。由于调节蛋白对于包括细胞周期进程、转录和凋亡在内的许多细胞过程的活化或抑制是关键性的，所以蛋白酶体已成为用于治疗多种疾病的潜在抑制靶标。使用新的基于图像的筛选方法，本发明人检测了一系列的化学物质并且鉴定出四种具有明显的蛋白酶体抑制活性的化合物(图7A-图7B和图8)。该筛选是基于使用稳定表达荧光蛋白酶体抑制报告(PIR)蛋白的H1299报告细胞系。该筛选的原理是基于在以下的发现在蛋白酶体活性受到抑制后，该报告子向细胞核易位，引起明显的并且可检测的核荧光信号。该发现证明了该方法是非常灵敏的并且与高通量显微镜法相容。本发明人还证明了这些抑制剂中至少之一(NSC321206)能够选择性杀死癌性细胞，而不杀死非癌性细胞(图10)。将蛋白酶体和NSC321206抑制剂的3D结构的计算机分析用于鉴定抑制剂在蛋白酶体上的推定对接位点。本发明人假定所鉴定的位点可用于设计能够与这些结合位点发生强相互作用并且因此可抑制蛋白酶体活性的基于NSC321206的另外的小分子。如下文实施例部分所述，从这些研究推断所述蛋白酶体在该蛋白酶体的胰蛋白酶样活性位点内或其附近包含两个与NSC321206抑制剂的铜相互作用的半胱氨酸(图12A-图12B)。因此我们推断为了实现与这些结合位点的相互作用的数量和强度最大化，应设计小分子使得它们在与这些结合位点适合的距离和取向包含铜。因此，根据本发明的一方面，本文提供了分离的多肽，其包含在存在或不存在蛋白酶体抑制剂的情况下具有不同细胞定位的P53氨基酸序列，所述多肽与可检测的部分连接。术语“p53”是指与SEQ ID NO 1具有至少70%、至少80%、至少90%或至少95%序列同源性的人P53多肽。本发明人设想了细胞定位受到蛋白酶体抑制剂存在影响的所有p53序列，例如可溶的(即胞质的)或膜结合的P53序列、特定的细胞器或者特定的生物化学途径例如复制、转录或翻译等中的p53序列。示例性细胞器包括细胞核、线粒体、叶绿体、核糖体、ER、高尔基体、溶酶体、蛋白酶体、分泌小泡、液泡以及微粒体。本发明人已证明p53多肽的核定位信号内的突变可将该多肽的天然核定位变成细胞质定位。但是，在蛋白酶体抑制剂存在下，p53多肽恢复其核定位。因此，根据一种实施方式，p53多肽在存在蛋白酶体抑制剂的情况下具有细胞质定位而在不存在蛋白酶体抑制剂的情况下具有核定位。就具体的位点而言，本发明设想至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、至少90%甚至更优选至少95%的所述多肽位于特定的位置，其中其余的多肽位于细胞内的任何其他位置。所设想的突变包括例如对应于SEQ ID NO 1的赖氨酸319的位置处的突变、对应于SEQ ID NO : I的赖氨酸320的位置处的突变以及对应于SEQ ID NO : I的赖氨酸321的位置处的突变。
本文使用的术语“突变”是指与野生型序列(GeneBank登录号NP_000537. 3-SEQID NO:I)相比氨基酸序列中的变化。
所述突变可包含缺失或替换。示例性突变包括对应于319位赖氨酸的丙氨酸、对应于320位赖氨酸的丙氨酸和对应于321位赖氨酸的丙氨酸中的至少之一。因此，例如，本发明人设想了具有SEQ ID NO :2中列出的氨基酸序列的多肽的用途。所述p53多肽还包含能够延长其半衰期的突变。因此，本发明人设想了具有对应于175位组胺酸的精氨酸突变的p53多肽的用途。因此，例如，本发明人设想了具有SEQ ID NO :3中列出的氨基酸序列的多肽的用途。能够延长p53半衰期的其他突变包括Joerger AC, Fersht AR. Structuralbiology of the tumor suppressor p53 和 cancer-associated mutants. Adv CancerRes. 2007 ；97 :1-23)中描述的那些，其通过引用并入本文。另外，本发明的p53多肽可包含SEQ ID NO : I的其他保守变异。本文使用的短语“保守变异”是指氨基酸残基被另一生物学上相似的残基替换。保守变异的实例包括例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸的一个疏水残基被另一疏水残基置换，或者一个极性残基(solar residue)被另一个极性残基置换,例如赖氨酸置换精氨酸、天冬氨酸置换谷氨酸、或者天冬酰胺置换谷氨酰胺等。术语“保守变异”还包括用取代的氨基酸替换未取代的母体氨基酸，条件是产生取代的多肽的抗体也与未取代的多肽发生免疫反应。利用计算生物学可发现使p53具有稳定性或者将其细胞定位变成胞质定位的其他突变。例如，使用多种三维计算工具可通过计算机分析多个突变的P53肽序列的提供稳定性和细胞定位的能力。可使用可用于展示三维结构模型的软件程序例如RIBBONS (Carson, Μ. , 1997. Methods in Enzymology 277, 25)、0 (Jones, TA.等人，1991.Acta Crystallogr. A47,110) > DINO(DIN0 Visualizing Structural Biology(2001)www.dino3d. org)；以及 QUANTA、INSIGHT、SYBYL, MACR0M0DE、I CM, M0LM0L, RASMOL 和 GRASP (综述于Kraulis, J. , 1991. Appl Crystallogr. 24,946)建模预测的突变肽序列从而鉴定有用的突变。本文说明书中和下文权利要求部分中使用的术语“氨基酸”或“多个氨基酸”应理解为包括20种天然氨基酸；通常在体内被翻译后修饰的那些氨基酸，包括例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；以及其他非天然氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟基赖氨酸、异锁链素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。另外，术语“氨基酸”包括既D-氨基酸也包括L-氨基酸。下文中的表I列出了可与本发明一起使用的天然氨基酸。表I
氨基酸三字母缩写单字母符号
丙氨酸Al^A


本发明提供了治疗抑制蛋白酶体对其有利的疾病方法。所述方法包括向个体给予治疗有效量的结合于细胞的蛋白酶体的化合物，所述化合物包含与配体结合的铜，所述配体被构造为使得与蛋白酶体结合后，所述铜与所述蛋白酶体的β2亚基的半胱氨酸31相互作用，并且进而与所述蛋白酶体的β3亚基的半胱氨酸118相互作用，从而治疗所述疾病。还提供了另外的新的蛋白酶体抑制剂以及鉴定蛋白酶体抑制剂的方法。