一种来源于莫哈维芽孢杆菌的低温耐有机溶剂脂肪酶的制作方法【技术领域】，具体涉及一种来源于莫哈维芽孢杆菌的低温耐有机溶剂脂肪酶。[0002]脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)是一类特殊的酯键水解酶，广泛存在于动物组织、植物和微生物体中。脂肪酶具有催化疏水性的油脂变成水溶性的脂肪酸和甘油的生物功能，在无机溶剂中保持高催化活力和极强稳定性，以及脂肪酶对底物的广谱性/特殊专一性，赋予了脂肪酶在食品油脂加工、洗涤剂、生物柴油、酯键化合物的合成和手性药物合成等工业的巨大应用价值(CN201010599106)。[0003]在食品油脂加工及油脂化工行业可以利用脂肪酶制取脂肪酸和甘油、进行油脂改性、制备特种油脂、提高中性油得率和制备单甘酯等。该行业对于脂肪酶在温度、催化活性、底物选择性以及有机溶剂耐受性等多个方面特性的需求多种多样。[0004]在洗涤剂中加入脂肪酶具有提高去污能力、降低表面活性剂和三聚磷酸钠的用量、减少环境污染等优点。洗涤剂行业对脂肪酶特性的需求包括在洗涤体系中的良好的脂肪酶活性及稳定性，其最适PH和pH稳定区间均在碱性范围内。另外因为在亚洲的中国、日本都是常温或低温洗涤，因此开发合适洗涤用的低温脂肪酶则成为当前洗涤剂用脂肪酶研究的一个热点。[0005]在生物柴油工业中，酶法生产生物柴油是生物柴油工业化生产的发展方向。该方法的主要瓶颈之一是脂肪酶的热稳定性和对甲醇等短链有机醇的耐受性(李宇扬，孙佩慧，胡基埂等.中国生物工程杂志，2008，28 (10): 136-140)。另外低温脂肪酶的应用可以大大降低生物柴油反应所需的热能，在节能、环保、安全等方面都可进一步得到改善。如CN200810033414所述，用于全细胞`催化生产柴油的基因工程菌由于最适催化温度低而降低了反应所需的热能，有利于节约能源，因此低温脂肪酶的应用将使得生物柴油的生产更加f倉泛。[0006]在医药工业上，可以用脂肪酶来催化有机合成反应，如合成手性胺、硫氮酮等(Jaeger K.E., Reetz Μ.T.Trends in Biotechnology.1998，16:396 - 403),如此就要求月旨肪酶具有较强的有机溶剂耐受性、较强的催化活性等。[0007]综上所述，脂肪酶可以应用于食品加工、油脂化工、医药加工、洗涤剂及生物柴油等多个行业。其中低温脂肪酶因为其低温催化活性而可大大降低反应能耗。随着世界能源紧缺，石油价格上涨，节能降耗成为世界范围内亟待解决的热点问题。低温脂肪酶的研究因此在国内外引起广泛关注。发现了许多低温脂肪酶，如Acinetobacter sp.、Bacillus sphaericus、Pseudomonas sp.、Serratia marcescens 等细菌可产低温月旨肪酶，Trichosporon pullulans、Mortella sp.> Yarrowia lipolytica、Yersinia sp.等真菌产低温脂肪酶)。但是这些低温脂肪酶大都热稳定性能较差，这也是其商业化的瓶颈之一(BJoseph, Pff Ramteke, G Thomas.Biotechnol Adv, 2008，26:457-470)。[0008]与水相催化相比，酶在有机相中的催化反应有许多优点，例如，增加反应物的溶解度、分离简单、改变酶的选择性等，所以某些耐有机溶剂脂肪酶也被广泛地应用于食品、制药、精细化工、有机合成等领域。但脂肪酶在有机溶剂中容易变性或酶活力下降，虽然国内外许多学者已经研究了不同方法来增加酶在有机溶剂中的稳定性，但还是无法满足工业化的需求。因此寻找天然耐有机溶剂的脂肪酶，使其在有机溶剂或含有有机溶剂的环境中具有较高的催化活性，已成为脂肪酶研究领域的一个重要方向。
[0009]据报道，已经成功分离纯化了 70多种芽孢杆菌属的脂肪酶(M Guncheva, DZhiryakova.J Mol catal B:Enzym, 2011，68:1-21),其中具备低温、中温条件下稳定性好或耐有机溶剂的芽孢杆菌来源脂肪酶的文献和专利也不少，但是，几乎没有同时兼具这三种特性的芽孢杆菌脂肪酶的报道。因此，急需一种兼具这三种特性的芽孢杆菌脂肪酶。


[0010]本发明提供一种脂肪酶及其编码基因，该脂肪酶具有低温脂肪酶活性、宽广的pH稳定性、0-50°C条件下高稳定性以及对多种有机溶剂良好的耐受性等特点，因而该脂肪酶在生物柴油、医药工业、食品加工、油脂化工、环境保护、洗涤剂、纺织、造纸等多个工业领域具有广泛的应用价值。
[0011]本发明的脂肪酶含有以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成:
[0012](I)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
[0013](2) SEQ ID NO:2第29 — 210位所示的氨基酸序列；或
[0014](3 )在(I)或(2 )的氨基酸序列的基础上经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有脂肪酶活性的由(I)或(2)衍生的脂肪酶。
[0015]本发明还包括编码本文所述脂肪酶的核酸。
[0016]优选的，本发明的核酸也可以是含有以下核苷酸序列或由以下核苷酸序列组成的核酸:
[0017](I) SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或
[0018](2)在严格条件下与(I)所限定的核苷酸序列杂交且编码具有脂肪酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
[0019]本发明还包括含有本发明编码序列的载体(优选是表达载体)以及含有所述载体的转化重组细胞(例如大肠杆菌)等。
[0020]在一具体实施例中,本发明的脂肪酶来自莫哈韦芽孢杆菌(Bacillus mojavensisWBRD1.10062302，CGMCC4961)。
[0021]Lip2-2的最适作用温度为35°C，在0_50°C温浴Ih酶活保持稳定；最适作用pH为
8.5，pH稳定范围为pH4-l I，且在pH3.0的环境下24h后仍能保存超过60%的酶活力；该脂肪酶对甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、异辛烷、二甲基亚砜、正己烷、苯、甲苯等多种有机溶剂表现出较强的耐受特性等。因此本发明所提供的脂肪酶Lip2-2具有低温脂肪酶特性且在0-50°C条件下保持稳定，具有更为宽广的PH稳定性和有机溶剂耐受性。具有如此特性的新颖脂肪酶无疑将在食品加工、油脂化工、生物柴油、有机合成、洗涤剂、环境修复等多个行业具有广阔的应用前景。例如，在洗涤行业，低温、弱碱性环境下，油性污垢难以去除，本发明所述脂肪酶具备低温、耐热性良好、碱性作用环境等优良特性，适合于在低温洗涤领域的应用；在污水处理和环境修复方面，作为低温酶，本发明脂肪酶可用于寒冷环境下的污水处理和环境修复，另一方面，由于对多种有机溶剂表现耐受，该酶可对苯、甲苯、丙酮等有机溶剂污染区域进行处理；在生物柴油工业中，脂肪酶的应用瓶颈是其热稳定性和对甲醇等短链有机醇的耐受性，本发明脂肪酶在上述两方面表现优良特性，因此适合生物柴油领域的应用，加之，本发明脂肪酶的低温作用特性可以降低生物柴油反应所需的热能，在节能、环保、安全等方面都可进一步得到改善。
[0022]因此，本发明也提供一种组合物，所述组合物含有本发明的脂肪酶。该组合物可以是洗涤组合物，用于洗涤油性污垢，例如在低温、弱碱性环境下进行洗涤。洗涤组合物还可含有适于洗涤用的其它各种已知成分，例如其它的洗涤剂、溶剂等。本发明的组合物也可以是用于处理污水的组合物。例如，可用于处理废纸脱墨过程中所产生的废水等。该组合物还可用于对有机溶剂(例如苯、甲苯、丙酮等)污染区域进行处理。本发明的组合物也可是用于制备生物柴油。
[0023]在一个具体实施例中，本发明的组合物是在适于本发明细胞表达本发明的脂肪酶的条件下培养所述细胞而获得的包含所述脂肪酶的发酵液。
[0024]本发明也包括本发明脂肪酶、多核苷酸、细胞和组合物等在食品加工、油脂化工、生物柴油、有机合成、洗涤剂、环境修复中的应用。
[0025]尤其是，本发明包括本发明的脂肪酶、多核苷酸、细胞和组合物在处理污染或制备生物柴油中的用途。
[0026]本文中，污染包括但不限于油性污垢、污水、或是有机溶剂如苯、甲苯、丙酮等造成的污染。
[0027]本发明提供一种 处理污染的方法，所述方法包括使本发明的脂肪酶或组合物与污垢接触，从而溶解污垢而除去 污垢。
[0028]在优选的实施例中，在适于细胞表达所述脂肪酶的条件下培养前述细胞，从而获得包含所述脂肪酶的发酵液，将所述发酵液用于洗涤油性污垢、处理污水或污染、或用于制备生物柴油。
[0029]本发明也包括脂肪酶的制备方法，所述方法包括在适于细胞表达所述脂肪酶的条件下培养本发明所述的细胞，从而表达所述脂肪酶。本发明的制备方法还包括纯化所述脂肪酶的步骤。



[0030]图1:Lip2-2的SDS-PAGE图，其中，M为蛋白分子量标准，I显示0.1445U的Lip2-2, 2 显示 0.289U 的 Lip2_2。
[0031]图2:Lip2-2的反应温度和酶活力关系曲线。
[0032]图3:Lip2_2的温度稳定性曲线。
[0033]图4:Lip2-2的反应pH和酶活力关系曲线。
[0034]图5:Lip2-2的pH稳定性曲线。
[0035]图6:Lip2_2水解三油精反应的底物及产物的薄层色谱图(TLC图)，其中，I显示无添加酶(空白对照)，2显示Rhizomucor miehei脂肪酶(RML)，3显示RML，4显示Lip2_2，5显示 Lip2_2。[0036]图7:Lip2-2对不同碳链长度脂肪酸酯键的作用。

[0037]本发明涉及低温耐有机溶剂脂肪酶及其编码序列。
[0038]本发明的脂肪酶来自莫哈韦芽孢杆菌(Bacillus mojavensis WBRDl.10062302，CGMCC4961)，具有优异的热稳定性、宽广范围pH的稳定性和有机溶剂耐受性。
[0039]在一具体实施例中，本发明的脂肪酶如SEQ ID NO:2所示，其为莫哈韦芽孢杆菌脂肪酶Lip2-2的包含信号肽的完整氨基酸序列，其中1-28位氨基酸为信号肽区域。[0040]本发明包括SEQ ID NO: 2的变异形式，包括但并不限于:一个或多个(通常为1_10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。这些变异形式仍然具有本发明脂肪酶的活性。优选是保守性变异形式。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明脂肪酶中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。
[0041]此外，本领域技术人员公知，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白Α、如6His或Flag的标签，或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点。应理解，这些氨基酸序列的存在不会影响到所得脂肪酶的活性。因此，本发明也包括在本发明脂肪酶的C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸所得的脂肪酶，这些脂肪酶仍具有本文所属的热稳定性、宽广范围的PH稳定性以及有机溶剂耐性。例如本发明的脂肪酶可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基或6His。
[0042]在另一个实施方式中，本发明脂肪酶包括与SEQ ID NO:2的序列相同性为至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%的氨基酸序列。
[0043]本文所用术语“序列相同性”或“相同性”指比对两条序列以最大程度提高亚基匹配，即考虑缺口和插入时，两条序列中相应位置上相同亚基的百分数。两条序列中的亚基位置被同一核苷酸或氨基酸占据时存在序列相同性，例如，若两个DNA分子的某个给定位置都被腺嘌呤占据，则这两个分子在该位置上相同。例如，若在长度为10个氨基酸的序列中有7个位置与长度为10个氨基酸的第二序列的相应位置相同，则这两个序列具有70%序列相同性。通常采用序列分析软件(例如，位于威斯康星州麦迪逊53705大学大道1710号的威斯康星大学生物技术中心的遗传计算机组(Genetics Computer Group, University ofWisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, ffis.53705)的序列分析软件包)，测定序列相同性。
[0044]根据重组生产方案所用的宿主，本发明的脂肪酶可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。
[0045]本发明还包括SEQ ID NO:2的活性片段。SEQ ID NO:2的活性片段通常含有SEQID NO:2的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，更佳地至少约100个连续氨基酸，更佳地至少约150个连续氨基酸。本发明也包括含有SEQ ID NO:2的活性片段、且保留SEQ ID NO:2的脂肪酶活性的多肽序列。
[0046]本发明的脂肪酶可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。
[0047]本申请包括本发明脂肪酶的编码序列，SEQ ID NO:1显示了本发明脂肪酶的编码序列之一。所述“编码序列”包括编码本发明所述脂肪酶的核酸序列，与SEQ ID N0:1高度同源的序列或在严格条件下与SEQ ID NO:1杂交的核苷酸序列或与上述分子高度同源的家族基因分子。提到核苷酸序列时，本文所用的“高度同源”可以指与所提及序列的相同性为至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或100%的核苷酸序列。编码本发明脂肪酶的序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，但与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列有差别的核苷酸序列。
[0048]编码本发明脂肪酶的序列包括:只编码成熟脂肪酶的编码序列；成熟脂肪酶的编码序列和各种附加编码序列；成熟脂肪酶蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
[0049]本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的脂肪酶的片段、类似物、衍生物和变异形式。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码本发明脂肪酶的多核苷酸。
[0050]本发明的脂肪酶的编码序列可选自:(i)SEQ ID NO:1 ;和(ii)与⑴对应的RNA序列在严格条件下与⑴或(ii)限定的序列杂交的分子。
[0051]如本文所用，术语“严格条件”是指:(I)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2 X SSC,0.1%SDS, 60 °C ;或(2)杂交时加有变性剂，如50%(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.l%Ficoll，42°C等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50%，优选55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更优选是95%以上时才发生杂交。例如，所述序列可为(a)中所限定序列的互补序列，或者可以是与(a)中所限定序列的互补性为至少50%、优选55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更优选是95%以上的序列。
[0052]本发明的脂肪酶的编码序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0053]本发明采用对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)法来测定脂肪酶的活力大小，该方法以对硝基苯棕榈酸酯为反应底物，通过脂肪酶的催化产生有色产物对硝基苯酚(p-NP)，该产物在405-410nm波长下具有强烈吸收。酶活力单位定义为:I个单位即指在标准实验条件下每分钟催化释放Iymol的p-NP所需的酶量。该方法是国内外测定脂肪酶活力的常用方法，操作简便，反应快且灵敏度高，是一种精确而高效的活力测定方法。
[0054]下文将以具体实施例的方式描述本发明。应理解，本发明并不限于这些具体的实施方式。实施例中所采用的反应试剂、条件等，除非另有说明，否则为本领域常规的试剂、条件等。[0055]实施例1:脂肪酶基因的克隆
[0056]1.保守序列的获取
[0057]根据脂肪酶基因的保守区域Oxyanion hole和Activity center的保守序列P (V/I)V(M/L) (V/L)HG和AHS(M/Q)GG，设计的兼并引物见表1:
[0058]表1引物信息
[0059]