专利名称：一种含有人骨髓间充质干细胞的人工皮肤及其构建方法 人的骨髓组织中，除含有造血干细胞外，还含有一定量的骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞是一种相对幼稚的细胞，具有分化成表皮、真皮组织的潜能，促进创面愈合。体外细胞培养骨髓间充质干细胞至第10代，细胞仍具有分化潜能，这为利用培养增殖的骨髓间充质干细胞构建人工皮肤奠定基础。皮肤创面覆盖物有表皮移植物、真皮移植物、复合皮肤移植物。US 777419的美国专利提供了一种利用牛I、III型胶原构建人工复合皮肤的方法，但该人工皮肤存在以下缺点1、以戊二醛作为交联剂，对机体有毒性危害，且强度不高；2、未切除胶原抗原决定簇，免疫抗原性较强；3、采用单纯I、III型胶原作为支架，没有加入表皮生长因子。US 5800811的美国专利提供了一种利用含有转化生长因子胶原基质构建人工皮肤的方法，但该专利存在如下缺点1、人工皮肤仅为胶原支架，没有加入细胞成分；2、未切除胶原抗原决定簇，免疫抗原性较强；3、虽证明此支架可与骨髓间充质干细胞结合，但并未构建双侧生长有骨髓间充质干细胞的人工皮肤。US 6391059的美国专利公开了在修复骨缺损的人工皮肤支架中植入骨髓间充质干细胞技术，但支架成分简单，未经双层植入。
本发明的目的正是为了克服已有技术的不足，提供一种无抗原性、强度高、柔韧性和耐酶性好、对机体无毒害、含有人骨髓间充质干细胞的人工皮肤。本发明还提供人工皮肤的构建方法。本发明的目的是通过下列技术方案实现的。一种含有人骨髓间充质干细胞的人工皮肤，其特征在于它是以含有表皮生长因子的牛胶原膜为皮肤组织工程支架，在支架两侧植入人骨髓间充质干细胞密度为＞106个/cm2，中间为生长的人骨髓间充质干细胞密度为＞106个/cm2。
按下述步骤进行(1).含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架的构建(a)、将胎牛皮或牛跟腱按常规方法进行脱毛、清洗、冷冻、切薄片，用丙酮脱水，再用石油醚脱脂，真空抽去胎牛皮或牛跟腱切片上的石油醚，加入胃酶或无花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠萝酶，加入量按干胎牛皮或干牛跟腱重量的1～5％，在20～40℃、pH＝2～8条件下、机械振动8～12小时，降解组织纤维间的共价键，经离心分离，弃上清液取沉淀用蒸馏水洗涤后，再加入上述干料重量50～150倍的0.5M醋酸溶液，温度0～20℃，振动24～32小时，再加入NaCl至上述溶液中NaCl浓度达到2M，经离心分离，弃上清液取沉淀装入透析袋进行透析3～4次，收集透析后胶原溶液，加入干胎牛皮或干牛跟腱重量1～3％无花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠萝酶，在30～40℃、pH＝2～8条件下、机械振动4～8小时，去除抗原决定簇；用0.05～0.5M的醋酸溶液溶解，得到酸溶性0.5～4mg/ml的无抗原性胶原溶液；(b)、再将(a)项的胶原溶液倒入模型中，并在-10～-70℃温度下冷冻4～24小时，再冷冻干燥24～48小时，得到孔径均匀的胶原海绵膜，将胶原海绵膜置于0.5～10％浓度的丙三醇溶液中，吸附膨胀后取出，在105～130℃温度下真空干燥18～32小时；(c)、将肝素溶于0.005～1M醋酸溶液中，肝素与醋酸溶液用量比为W/V0.1～100mg/ml，用100目滤网过滤，得到肝素醋醋溶液；(d)、将表皮生长因子溶于三蒸水中，表皮生长因子与三蒸水的的用量比为W/V0.0001～0.1μg/ml，得到表皮生长因子水溶液；(e)、最后将(c)项的肝素醋酸溶液和(d)项的表皮生长因子水溶液按体积比1∶1～50∶1混合，振动混合48小时后取混合液与5％的丙三醇溶液以体积比0.1～5％混合，用混合液浸润(b)项的胶原海绵膜，润湿后，在-10～-70℃冷冻4～10小时，再真空干燥，得含有表皮生长因子的胶原海绵膜。
(2).人骨髓间充质干细胞的纯化、增殖培养
(a)将人类骨髓血用等体积的PBS稀释、300g离心10min，弃上清，取沉淀的细胞用骨髓血2倍体积的PBS重悬，并通过注射器5号针头，使细胞成单个细胞，细胞计数，再用PBS稀释至1～2×1010个/ml的细胞悬液，再将5倍细胞悬液体积的Percoll放入离心管中，细胞悬液加入Percoll上层，以900g离心30min，吸取含有核细胞的白环层，并用3倍骨髓血体积PBS重悬，再以300g离心5min，弃上清，用3倍骨髓血体积PBS洗一次，离心，弃上清，收集有核细胞，用DMEM-LG按常规方法重悬，将所得有核细胞接种于培养瓶中，培养液为含10％胎牛血清的DMEM-LG，置37℃、5％CO2条件下培养24小时换培养液，弃未贴壁的细胞，得到人骨髓间充质干细胞。
(b)再将(a)得到的人骨髓间充质干细胞，按常规方法用PBS洗两次后，隔日接种于培养液中，两天换液一次，培养至人骨髓间充质干细胞铺满培养瓶底面时，用0.25％胰蛋酶和1mmol/l EDTA混合液于37℃，消化细胞3～5min，再按常规方法增殖培养得到大量用于植入皮肤组织工程支架的人骨髓间充质干细胞。
(3).含有人骨髓间充质干细胞的人工皮肤的构建用Co60γ射线照射(1)项中的皮肤组织工程支架后，用含有1×105μg/l青霉素与100mg/l的链霉素D-Hanks液冲洗后，加入DMEM-LG培养液浸泡24小时，再将(2)项的人骨髓间充质干细胞以3×105个/cm2密度接种于支架一侧，在37℃、5％CO2条件下培养2天后，反转支架180度，在支架另一侧以3×105个/cm2密度接种人骨髓间充质干细胞，在37℃、5％CO2条件下培养10天，即构成含有人骨髓间充质干细胞的人工皮肤。
本发明与现有技术相比具有以下优点及效果1).本发明制成的人工皮肤所用胶原海绵膜无抗原性。
胶原的免疫决定簇位于胶原分子的非螺旋的尾肽部分，本发明首先采用专一性强的胃酶或无花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠萝酶对胶原的共价键进行定向切除，然后用无花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠萝酶对胶原的尾肽进行切除，使胶原不再具有抗原性。
2).采用增塑和热交联联合处理工艺技术，制成的人工皮肤强度高、柔韧性和耐酶性好，对创伤机体无毒害。
已有技术的交联剂因会对机体产生毒害等均存在一定缺陷，本发明采用以丙三醇增塑和热交联联合处理的方法，制成的胶原海绵膜，具有强度高、柔韧性和耐酶性好、对机体无毒害的特点。
3).本发明在人工皮肤中加入表皮生长因子，可有效诱导创伤部位自体细胞生长，促进创面愈合。
外源性表皮生长因子能够诱导细胞分裂，加速创伤修复，已经应用于临床；将外源性表皮生长因子引入人工皮肤中，可有效诱导创面组织细胞分化生长。
4).本发明采用表皮生长因子缓释技术，使表皮生长因子可以持续释放。
无论体外细胞培养，还是创伤部位自体细胞生长，生长因子都需要与细胞接触超过一定时间才能有效发挥作用，如成纤维细胞需要与表皮生长因子接触超过3～4小时才开始分裂，而表皮生长因子在体内的活性半衰期很短(几小时或更短)，为解决此问题，本发明通过引入肝素，促使表皮生长因子与胶原形成一个缓释系统，逐渐释放出表皮生长因子，在创伤愈合前保持表皮生长因子持续作用于创面组织细胞。
5).本发明在人工皮肤中加入骨髓间充质干细胞，可加速创面的愈合。
骨髓间充质干细胞具备向表皮、真皮细胞分化的潜能，加入人工皮肤中，可增殖分化成皮肤组织，加速创面愈合。骨髓间充质干细胞可从自身骨髓中提取并大量扩增，且传至第40代，细胞分化潜能并无明显改变，故获得骨髓间充质干细胞所需费用较低。


图1为本发明的人工皮肤组织学结构图(H.E染色×100倍)。

实施例1将胎牛皮按常规方法进行脱毛、去筋膜、脂肪和血污、清洗、冷冻，切成0.5mm薄片，用丙酮脱水三次，用石油醚脱脂三次，再抽真空除去石油醚，制成脱水脱脂的胎牛皮为原料，取10g原料，用双蒸水洗涤后加入反应器内，加入由0.1g胃酶和100g水配制的水溶液。进行一次酶处理，在20℃、pH＝2条件下，机械振动24小时，降解组织纤维间的共价键，经离心分离，弃上清液，取沉淀，用双蒸水洗涤三次，加入500g的0.5M醋酸水溶液，在0℃温度下，机械振动32小时后再加入氯化钠，使溶液中氯化钠浓度达2M，沉淀完全后，离心分离，弃上清，取沉淀装入透析袋进行透析三次，收集透析后胶原溶液加入反应器内，并加入0.3g菠萝酶与100g水配制的水溶液，进行二次酶处理，在30℃、pH＝6条件下，机械振动8小时，除去抗原决定簇，再按常规方法酶灭活处理，经离心分离，弃上清，用0.05M的的醋酸水溶液100g溶解，用失重法测得含有0.4g/ml无抗原性胶原溶液，并倒入直径100mm的预冷模具中，在-10℃温度下，冷冻24小时，再真空干燥24小时，得到孔径均匀的厚度为0.1mm胶原海绵膜0.15g，然后置入0.5％浓度的7.5ml丙三醇水溶液中吸附膨胀后取出，在105℃温度下，真空干燥32小时，得干胶原海绵膜，取肝素与0.005M醋酸水溶液中，使肝素含量为0.1mg/ml，再将表皮生长因子溶于三蒸水中，使表皮生长因子含量为0.01μg/ml，取上述肝素醋酸水溶液100ml与表皮生长因子水溶液100ml混合，机械振动48小时后，取上述混合液0.1ml与5％浓度丙三醇水溶液100ml再次混合，并浸润干胶原海绵网，润湿后在-70℃温度下，冷冻4小时，再真空干燥，得到含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架；取2ml人骨髓血与2ml PBS稀释，300g离心10min，弃上清，取沉淀细胞，再用4ml PBS重悬，通过注射器5号针头，使细胞成单体细胞，细胞计数，用PBS稀释至1×1010个/ml密度的细胞悬液1ml，将5ml Percoll放入离心管中，细胞液加到Percoll上层，以900g离心30min，吸取含有核细胞的白环层，并用6ml PBS重悬，300g离心5min，弃上清，取沉淀加入6ml PBS洗一次，离心、弃上清、收集有核细胞，用DMEM-LG按常规方法重悬，得到有核细胞接种于含有10％胎牛血清的DMEM-LG培养液，置于37℃、5％CO2条件下培养24小时，换培养液，弃未贴壁的细胞，得到人骨髓间充质干细胞，再按常规方法用PBS洗两次后，换培养液，两天换液一次，培养至人骨髓间充质干细胞铺满培养瓶底面时，用0.25％胰蛋白酶加1mmol/l EDTA混合液于37℃，消化细胞5min，再按常规方法增殖培养得到人骨髓间充质干细胞；取1cm2皮肤组织工程支架，用Co60γ射线照射后用含有1×105μg/l青霉素与100mg/l的链霉素D-Hanks液冲洗后，加入DMEM-LG培养液浸泡，将人骨髓间充质干细胞以3×105个/cm2密度接种于支架一侧，在37℃、5％CO2条件下培养两天，反转支架180度，在支架另一侧以3×105个/cm2密度接种人骨髓间充质干细胞，在37℃、5％CO2条件下培养10天，即构建成1cm2含有人骨髓间充质干细胞的人工皮肤。由图1所示，1为支架，2-1为人工皮肤一侧骨髓间充质干细胞，2-2为人工皮肤另一侧骨髓间充质干细胞，3为人工皮肤内部生长的骨髓充质干细胞。
实施例2将牛跟腱按实施例1的方法进行脱水、脱脂、抽真空除石油醚，制成脱水脱脂的牛跟腱为原料，取原料10g，用双蒸水洗涤后加入反应器内，加入由0.3g胰蛋白酶与100g配制的水溶液进行一次酶处理，在30℃、pH＝6条件下，机械振动16小时，降解组织纤维间的共价键，经离心分离、弃上清、取沉淀，用双蒸水洗涤四次，加入1000g0.5M醋酸水溶液，在10℃温度下，机械振动28小时，再加入氯化钠，使溶液中氯化钠浓度达2M，沉淀完全后，离心分离，弃上清，取沉淀，装入透析代进行透析四次，收集透析后胶原溶液加入反应器内，并加入0.2g木瓜酶与100g水配制的水溶液进行二次酶处理，在35℃、pH＝7条件下，机械振动6小时，除去抗原性决定簇，再按常规方法酶灭活处理，经离心分离，弃上清，用0.1M的醋酸水溶液100g溶解，用失重法测得含有2mg/ml无抗原性胶原溶液，并倒入直径100mm的预冷模具中，在-40℃温度下，冷冻10小时，再真空干燥36小时，得到孔径均匀厚度为0.25mm胶原海绵膜0.3g，并置入5％浓度的30ml丙三醇水溶液，吸附膨胀后取出，在120℃温度下，真空干燥20小时，得到干胶原海绵膜，取肝素溶于0.1M的醋酸溶液中，使肝素含量为5mg/ml，再将表皮生长因子溶于三蒸水中，使表皮生长因子含量为0.01μg/ml，取上述肝素醋酸水溶液10ml和表皮生长因子水溶液200ml混合，机械振动48小时后，取上述混合液1ml，与5％浓度丙三醇水溶液100ml再次混合，并浸润干胶原海绵膜，浸润后在-40℃温度下，冷冻6小时，再真空干燥，得到含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架。
取2ml人骨髓血与2ml PBS稀释，300g离心10min，弃上清，取沉淀细胞，再用4ml PBS重悬，通过注射器5号针头，使细胞成单体细胞，细胞计数，用PBS稀释至1×1010个/ml密度的细胞悬液1ml，将5ml Percoll放入离心管中，细胞悬液加入Percoll上层，以900g离心30min，吸取含有核细胞的白环层，并用6ml PBS重悬，300g离心5min，弃上清，取沉淀加入6ml PBS洗一次，离心，弃上清，收集有核细胞，用DMEM-LG按常规方法重悬，得到有核细胞接利于含行10％胎牛血清的DMEM-LG培养液，置于37℃、5％CO2条件下培养24小时，换培养液，弃未贴壁的细胞，得到人骨髓间充质干细胞，再按常规方法用PBS洗两次后，换培养液，两天换液一次，培养至人骨髓间充质干细胞铺满培养瓶底面时，用0.25％胰蛋白酶加1mmol/l EDTA混合液于37℃，消化细胞5min，再按常规方法增殖培养得到人骨髓间充质干细胞；取1cm2皮肤组织工程支架，用Co60γ射线照射后用含有1×105μg/l青霉素与100mg/l的链霉素D-Hanks液冲洗后，加入DMEM-LG培养液浸泡，将人骨髓间充质干细胞以3×105个/cm2密度接种于支架一侧，在37℃、5％CO2条件下培养两天，反转支架180度，在支架另一侧以3×105个/cm2密度接种人骨髓间充质干细胞，在37℃、5％CO2条件下培养10天，即构建成的1cm2含有人骨髓间充质干细胞的人工皮肤。
实施例3用实施例2的脱水脱脂的牛跟腱为原料，取10g，用双蒸水洗涤后加入反应容器内，加入由0.5g菠萝酶与100g水配制的水溶液进行一次酶处理，在40℃，PH＝8条件下机械振动8小时，降解组织纤维间的共价键，经离心分离、弃上清，取沉淀，用双蒸水洗涤四次，加入1500g的0.5M醋酸水溶液中，在20℃温度下，机械振动24小时后再加入氯化钠使溶液中氯化钠浓度达2M，沉淀完全后，离心分离，弃上清，取沉淀装入透析袋进行透析三次，收集透析后的胶原溶液加入反应器内，并加入0.1g胰凝乳蛋白酶与100g水配制的水溶液进行二次酶处理，在40℃、pH＝8条件下，机械振动4小时，除去抗原决定簇，再按常规方法酶灭活处理，离心分离，弃上清，取沉淀，用0.5M的醋酸水溶液100g进行溶解，用失重法测定，得到含有4mg/ml无抗原胶原溶液，并倒入直径50mm的预冷模具中，在-70℃温度下冷冻4小时，再真空干燥48小时，得到孔径均匀厚度为0.5mm胶原海绵膜0.3g，置入10％浓度的45ml丙三醇溶液吸附膨胀后取出，在130℃温度下，真空干燥18小时，得到干胶原海绵膜，取肝素溶于1M的醋酸水溶液中，肝素含量为10mg/ml，再取表皮生长因子溶于三蒸水中，表皮生长因子含量为0.1μg/ml，取上述肝素醋酸水溶液5ml，与表皮生长因子水溶液150ml混合，机械振动48小时后，取混合液5ml与5％浓度的丙三醇水溶液100ml，再次混合，并浸润干胶原海绵膜，润湿后在-10℃温度下，冷冻10小时，再真空干燥，得到构建的含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架。
取2ml人骨髓血与2ml PBS稀释，300g离心10min，弃上清，取沉淀细胞，再用4ml PBS重悬，通过注射器5号针头，使细胞成单体细胞，细胞计数，用PBS稀释至1×1010个/ml密度的细胞悬液1ml，将5ml Percoll放入离心管中，细胞液加到Percoll上层，以900g离心30min，吸取含有核细胞的白环层，并用6ml PBS重悬，300g离心5min，弃上清，取沉淀加入6ml PBS洗一次，离心，弃上清，收集有核细胞，用DMEM-LG按常规方法重悬，得到有核细胞接种于含有10％胎牛血清的DMEM-LG培养液，置于37℃、5％CO2条件下培养24小时，换培养液，弃未贴壁的细胞，得到人骨髓间充质干细胞，再按常规方法用PBS洗两次后，换培养液，两天换液一次，培养至人骨髓间充质干细胞铺满培养瓶底面时，用0.25％胰蛋白酶加1mmol/l EDTA混合液于37℃，5％CO2消化细胞5min，再按常规方法增殖培养得到人骨髓间充质干细胞；取1cm2皮肤组织工程支架，用Co60γ射线照射后用含有1×105μg/l青霉素与100mg/l的链霉素D-Hanks液冲洗后，加入DMEM-LG培养液浸泡，将人骨髓间充质干细胞以3×105个/cm2密度接种于支架一侧，在37℃、5％CO2条件下培养两天，反转支架180度，在支架另一侧以3×105个/cm2密度接种人骨髓间充质干细胞，在37℃、5％CO2条件下培养10天，即构建成的1cm2含有人骨髓间充质干细胞的人工皮肤。


本发明涉及一种含有人骨髓间充质干细胞的人工皮肤及其构建方法，它是以胎牛皮或牛跟腱为基料，经过两次酶处理的胶原海绵膜，再与肝素和表皮生长因子的混合物构建含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架，将从人骨髓血中纯化的人骨髓间充质干细胞植入支架两侧，构建支架两侧和内部均有骨髓间充质干细胞的人工皮肤。该产品具有无抗原性、皮肤强度高、柔韧性好、对创面和机体无毒害、可有效诱导创面部位自体细胞生长、促进创面愈合的优点和效果。