专利名称：一种高黄酮含量杭白菊的培育方法杭白菊为菊科植物菊的干燥头状花序，栽培历史悠久，据有关史料记载，迄今至少已有360余年之久，系“浙八味”地道药材之一。杭白菊含有木犀草素-7-β -D-葡萄糖苷、 芹菜素-7- β -D-葡萄糖苷、金合欢素-7- β -D-葡萄糖苷等多种黄酮类有效成分，抗氧化作用优良，具有“清热散风、平肝明目”之功效。早期研究发现表明，杭白菊具有解热、抑菌、抗流感病毒、抗心血管、抗炎等作用，近年来国内外有研究显示杭白菊具有抗氧化、抗肿瘤、抗爱滋等作用。目前，加工生产企业主要提取分离菊花总黄酮，因此，选育高黄酮含量的杭白菊新品种成为育种的主要方向。
正是在上述背景下，本发明的目的是提出ー种高黄酮含量杭白菊的培育方法，以获得高黄酮含量杭白菊，进行类黄酮的开发，用于食品和医药エ业。本发明的高黄酮含量杭白菊的培育方法，包括以下步骤1)取杭白菊的子叶为外植体，接种至诱导培养基，在25士1°C、光强3000勒克司光条件下诱导形成愈伤组织；2)将诱导形成3周的愈伤组织，转移至继代培养基，继代培养至愈伤组织进入成倍増殖期；3)将成倍増殖的愈伤组织，在25士1°C避光的黑暗条件下进行受体愈伤组织的预培养 2天；4)将经过预培养的愈伤组织，在农杆菌悬浮液中浸泡15分钟，之后弃去菌液，用无菌滤纸吸干，接种于共培养基上，在25士 1°C避光的黑暗条件下共培养2天；5)将上述共培养愈伤组织，洗浄、晾干后，转移到筛选培养基，在25士1°C避光的黑暗条件下培养6周，收集新长出的抗性愈伤组织，转移至新的筛选培养基上，再进行连续2轮继代筛选，每隔3周转继1次；
6)取3轮筛选后的抗性愈伤组织，转移至分化培养基，在25士1°C、光强3000勒克司光条件下诱导分化成苗，对抗性植株进行组织化学染色和分子检测，选留含目的基因插入序列的的转基因植株，所说的目的基因插入序列是指目的基因查耳酮合酶基因CHS、标记基因葡糖苷酸酶基因GUS和筛选基因抗潮霉素基因HPT的插入序列，目的基因查耳酮合酶基因 CHS片段长960bp ；
7)取入选的转基因植株，田间种植測定花瓣中总黄酮含量，选留总黄酮含量高于3%的转基因植株；
8)继续种植步骤7)筛选的转基因株系，评价黄酮含量的表达稳定性，繁殖总黄酮含量稳定高于3%的优良株系，为培育的高黄酮含量杭白菊。
本发明中，所说的诱导培养基为MS基本培养基添加IAAO. ;3mg、6-BAiaiig、蔗糖30g 和琼脂粉6. 8g，pH灭菌前5.7。本发明中，所说的继代培养基为MS基本培养基添加IAAO. ;3mg、6-BAiaiig、蔗糖30g 和琼脂粉6. 8g，pH灭菌前5.7。本发明中，所说的共培养基为MS基本培养基添加IAAO. :3mg、6-BAiaiig、乙酰丁香酮lmg、蔗糖30g和琼脂粉6. 8g, pH灭菌前5. 7。本发明中，所说的筛选培养基为MS基本培养基添加IAAO. ;3mg、6-BAiaiig、潮霉素 25mg、羧卞200 mg、蔗糖30g和琼脂粉6. 8g，pH灭菌前5. 7。本发明中，所说的分化培养基为MS基本培养基添加IAAO. ;3mg、6-BA^ig/L、羧卞 200mg、蔗糖30g和琼脂粉6. 8g，pH灭菌前5. 7。上述的MS 基本培养基为(NH4)2NO3 1650mg、KNO3 1900mg、CaCl2 · 2H20 440mg、 MgSO4 · 7H20 370mg、KH2PO4 170mg、MnSO4 · 4H20 22. 3mg、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg、Na2MoO4 · 2H20 0. 25 mg、CuSO4 · 5H20 0. 025mg、CoCl2 · 6H20 0. 025mg、Na2-EDTA · 2H20 37. 3mg、FeSO4 · 7H20 27. 8mg、H3BO3 6. 2mg, KI 0. 8;3mg、肌醇 lOOmg、烟酸 0. 5mg、维生素 B6 0. 5mg、维生素 Bl 0. 5mg和甘氨酸ang。本发明中，所说的农杆菌的菌株为EHA105，内含质粒pCAM1305，pCAM1305的T-DNA 区域携带目的基因插入序列，包括目的基因查耳酮合酶基因CHS、标记基因葡糖苷酸酶基因GUS和筛选基因抗潮霉素基因HPT的插入序列。目的基因查耳酮合酶基因CHS片段长 960bp，与35S和nos终止子共同构成表达框架。查耳酮合酶基因CHS是类黄酮生物合成中第一个关键酶，CHS的活性直接关系到类黄酮的合成，可以调控提高黄酮的含量。菌株为 EHA10方便购买或赠送获得，在一般植物遗传实验室均有保存，参见文献吴关庭等，中国农业科学，2005，38 (12) :2395-2402。上述的标记基因葡糖苷酸酶基因⑶S的组织化学染色方法参见Rueb和Hensgens. Rice Genetics Newsletters, 1989，(6): 168-169，筛选基因抗潮霉素基因 HPT 的分子检测方法参见文献吴关庭等，中国农业科学，2005，38 (12) :2395-对02。本发明中，所说的黄酮含量检测方法，以芦丁为标样的比色法在波长510nm处测定，参见文献杨美华，卢充伟，匡岩巍，等.柱色谱-紫外分光光度法测定广金钱草中总黄酮的含量.中草药，2004，35(6) 688 690。上述的稳定性是指入选杭白菊中黄酮含量在不同年份间(2年以上)、季节间(2季以上)以及地点间(2个地点以上)的含量变化不显著。本发明培育的高黄酮含量的杭白菊，具有以下优点
本发明首先利用查耳酮合酶基因CHS，通过调控类黄酮合成第一个关键酶的活性，显著提高黄酮的含量，培育出高黄酮含量杭白菊，进行高效生物提取，发展新型保健食品添加剂和营养强化剂，用于食品、医药领域。


图1是本发明所用的查耳酮合酶基因CHS插入序列的载体构建示意图。

以下通过具体实例进一步说明本发明。实施例1
以取杭白菊品种“迟小洋菊”的子叶为外植体，接种至诱导培养基，在25士 1°C、光强 3000勒克斯光条件下诱导形成愈伤组织；
取诱导形成3周的愈伤组织，转移至继代培养基，继代培养至愈伤组织进入成倍增殖
期；
取成倍增殖的愈伤组织，在25士 1°C、避光的黑暗条件下进行受体愈伤组织的预培养2天；
取经过预培养的愈伤组织(约400个培养皿，含2500块以上的愈伤组织)，在农杆菌悬浮液中浸泡15分钟，之后弃去菌液，用无菌滤纸吸干，接种于共培养基上，在25士 1 °C、避光的黑暗条件下共培养2天；
取上述共培养愈伤组织，洗净、晾干后，转移到筛选培养基，在25士 1°C、避光的黑暗条件下培养6周，收集新长出的抗性愈伤组织(约420块愈伤组织)，转移至新的筛选培养基上，再进行连续2轮继代筛选，每隔3周转继1次；
取3轮筛选后的抗性愈伤组织(约60块愈伤组织)，转移至分化培养基，在25士 1°C、光强3000勒克斯光条件下诱导分化成苗75株，对抗性植株进行标记基因GUS组织化学染色和筛选基因HPT分子检测，选留含目的基因查耳酮合酶基因CHS插入序列的转基因植株21 株(目的基因插入序列的载体构建如图1所示)。取入选的转基因植株，田间种植后收获种子，进行叶片内黄酮含量检测，选留总黄酮含量高于10%的转基因植株7株，继续种植转基因株系；
2008-2010连续3年，分别在浙江杭州、临安、富阳三地三季评价黄酮含量的表达稳定性，繁殖总黄酮含量稳定高于10%的优良株系，最终培育高黄酮含量杭白菊2个=T-HBJ-I 和T-HBJ-2，其花瓣中总黄酮含量分别为11.9%、10. 3%，而原杭白菊的总黄酮含量仅为 6. 93%。


本发明涉及一种高黄酮含量杭白菊的培育方法，步骤包括取杭白菊的子叶为外植体，诱导愈伤组织，继代培养至成倍增殖期，暗条件预培养，进行农杆菌共培养转化，转移到筛选培养基进行3轮筛选，取抗性愈伤组织诱导分化成苗，对抗性植株进行标记基因组织化学染色和筛选基因分子检测，鉴定含目的基因查耳酮合酶基因CHS插入序列的分化小苗，对入选的转基因植株进行花瓣中总黄酮含量检测，选留总黄酮含量高于10%的转基因植株，继续种植评价黄酮含量的表达稳定性，繁殖总黄酮含量稳定高于10%的优良株系。本发明的高黄酮含量杭白菊，可发展新型保健食品添加剂和营养强化剂。