专利名称:适合临床应用于免疫介导性疾病的、具有增强型抑制功能的调节性t细胞的体外扩增方法众所周知的是,调节性T细胞(或Treg)在通过抑制免疫系统的激活而维持对自身抗原的耐受方面起着关键作用。在罹患炎性/自身免疫疾病(例如系统性红斑狼疮、多发性硬化症、类风湿性关节炎、哮喘、溃疡性结肠炎和克隆氏病)的患者中,表达转录因子 Foxp3的⑶4+⑶25+Treg出现功能缺陷或频率降低。在这些自身免疫疾病中,人体的免疫系统无法将细胞或细胞的一部分识别为自身的,从而导致组织破坏。在对多种动物疾病模型(包括但不限于类风湿关节炎、哮喘和移植物抗宿主病 (“GVHD”))进行治疗的过程中已表明施用⑶4+⑶25+Treg具有治疗效果。在治疗应用中采用Treg却困难重重,因为它们只占人外周血单核细胞非常小的百分比,大约1至2%。因此,开发了体外激活和扩增或增殖Treg的方法,以用于治疗某些疾病。图1为示出取自实例1群体的⑶4+FoXp3+Treg的频率的曲线图。图2为示出实例2的⑶4+Treg的纯度的曲线图。图3为示出实例3的Treg扩增情况的曲线图。图4为示出实例3中表达了 Foxp3的体外扩增细胞的百分比的曲线图。图5为示出实例4的扩增所得Treg的抑制活性的曲线图。ο本发明将通过以下非限制性实例阐明。SM实例1从9名SLE患者、7名RA患者、7名哮喘患者、10名MS患者和7名⑶患者以及11 名未患自身免疫疾病的人中各采集50cc的大约5至10个外周血样。从这些样品的外周血单核细胞(“PBMC”)中分离和纯化出⑶4+Treg。通过采用聚蔗糖-泛影葡胺(Amersham)的密度梯度离心从血样中分离出PBMC。使用人⑶4+⑶25+4调节性T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)按照制造商说明书通过autoMACS 从PBMC纯化出⑶4+⑶25+Treg。简而言之,首先通过用抗人⑶8、⑶14、⑶16、⑶19、⑶36、 ⑶56、⑶123、TCR γ / δ和⑶235a的单克隆抗体的混合物耗尽非⑶4细胞,对PBMC中的 CD4+T细胞进行阴性分离。然后用抗人CD25抗体偶联的微珠对富集的CD4+细胞群中的人 CD4+CD25+Treg进行阳性分离。使用细胞内Foxp3染色法评估表达Foxp3的CD4+Treg并通过流式细胞术对其进行分析。结果示于下图1中,图中示出了各个人的CD4+细胞库群体中 CD4+Foxp3+Treg 的百分比。实例2从9名SLE患者、7名RA患者、7名哮喘患者、8名MS患者和7名⑶患者以及25 名未患自身免疫疾病的人中各采集50cc的大约5至10个外周血样。从样品的PBMC中纯化出⑶4+Treg。纯化是使用实例1中所述的方法进行的。使用细胞内Foxp3染色法评估O天时纯化的CD4+Treg的纯度,并通过流式细胞术对其进行分析,结果示于图2的曲线图中。大约40至75%的纯化细胞表达了 Foxp3。实例3SLE、RA、哮喘、MS、CD和UC患者中各采集50cc的大约5至10个外周血样。从样品的PBMC中纯化出⑶4+Treg。纯化使用实例1中所述的方法进行。将CD4+Foxp3+Treg 培养于 X-VIVO 15 培养基(Cambrex Bio-ffhitaker, East Rutherford, NJ)中,该培养基补充有10%混合人AB血清(Cambrex)并存在1000IU/M1的人rIL-2 (Proleukin)。此夕卜,以1 3的细胞与小珠比率添加抗-⑶3/抗-⑶28包被的小珠(Dynal,Oslo, Norway)。在37°C的培养箱中培养3周后,扩增的Treg达到超过100至 1,000倍的扩增水平,或达到了 10亿个细胞,如图3中的曲线图所示。图4的曲线图示出, 平均40至50%的体外扩增细胞表达了 Foxp3(通过在第2周时进行细胞内染色得出)。实例 4在2周时按照以下标准化抑制测定法评估实例3的Treg。对于抗-CD3刺激的培养物,将来自同一供体的异源CD4+CD25+人T细胞(5 X IO4细胞/孔)用作应答细胞,将Img/ ml抗-CD3(0KT3)和异源人树突状细胞(得自一个供体,5 X IO3细胞/孔)以及系列稀释的扩增Treg以一式三份的方式加入96孔板中。对于同种异体抗原刺激的培养物,将来自一个供体的⑶4+⑶25+人Treg细胞(5 X IO4细胞/孔)、来自另一个供体的5 X IO3人树突状细胞以及系列稀释的扩增Treg以一式三份的方式接种到96孔板中。体外功能测定的结果(示于图5的曲线图中)证实,体外扩增的人Treg具有抑制 T细胞增殖的有效抑制活性。另外,与从同一人中新鲜纯化的Treg相比,该Treg的抑制活性得到增强。这种抑制活性可用来抑制自身免疫/炎性疾病中有害的人免疫反应并且表现出对自身免疫/炎性疾病的临床治疗潜力。
本发明公开了用于体外扩增CD4+CD25+Treg的方法。本发明还公开了制备体外扩增Treg的方法,这些Treg可用于抑制人体对自身抗原或过敏原的有害免疫反应。另外,体外扩增的Treg可供治疗炎性/自身免疫疾病。
适合临床应用于免疫介导性疾病的、具有增强型抑制功能的调节性t细胞的体外扩增方法
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