类风湿性关节炎易感性无创检测试剂盒（ERα等基因）的制作方法[0002]类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA)是一种常见的以关节组织慢性炎症病变为主要特征的高致残率的全身性疾病，世界各国均有报告，但患病率相差很大，从5.3%到0.05%。流行病调查资料显示，RA可发生于任何年龄，发病率随年龄增加而增加，女性发病率约为男性的3倍，特别是在55岁以下的患者中这种比例更高。类风湿性关节炎可归于慢性自身免疫性疾病，由遗传背景与多种危险因子如环境因素等共同作用所致。RA的早期诊断对病情的控制和治疗相当重要，但是长期以来，对RA的诊断主要依靠临床表现、X线检查及检测类风湿因子，符合此标准时病人常已出现骨关节破坏。因此通过一定检测手段筛查出易患类风湿性关节炎的高危人群，指导这类人群提早预防疾病的发生至关重要。[0003]单核苷酸多态性(SNP)是人类基因组DNA序列变异的主要形式，是决定人类疾病易感性和药物反应性 个体差异的重要因素。现有的研究已经明确了一些类风湿性关节炎的致病基因和位点以及一些基因多态性位点与该病的相关性。[0004]人类雌激素受:体ct (Estrogen Receptor- α )基因定位于6q24~q27,全长140kb,由8个外显子和7个内含子组成，可与雌激素结合形成二聚体，通过与靶基因中的雌激素反应元件特异性结合，刺激靶基因转录，从而促进细胞增殖和分化。雌激素受体α基因内存在常见的多态性为Pvu II和XbaI酶切基因型，当突变发生时，两个酶切位点会消失。Pvu II限制性酶切位点位于第一内含子，距第二外显子约0.4kb，多态性表现为单核苷酸T突变为C (突变后为P基因型)，由此分为三种基因型:PP、Pp> PP。XbaI酶切位点位于Pvu II酶切位点下游约50 bp处，其多态性表现为单核苷酸A突变为G (突变后为X基因型)，三种基因型分别表示为:XX、Xx、xx。ERa多态性可能直接影响ER-a基因的转录能力。[0005]ER-a基因XbaI和PvuII等位基因频率比较发现，X和P的基因频率高于对照组，说明这两种等位基因可能与RA发病有一定的关系，进一步对XbaI和PvuII酶切基因亚型的研究发现，PP和XX基因型在女性RA患者中表达明显增加，显示P和X等位基因是类风湿性关节炎的易患基因。[0006]转化生长因子β? (Transforming growth factor betal, TGF-βΙ)是一种对细胞生长、分化具有双重调节作用的多肽因子，研究发现该基因的T869C位点多态性与类风湿性关节炎的发生有较高相关性。这种基因多态性能引起编码区第10密码子亮氨酸(Leu)替换为脯氨酸(Pro)，影响蛋白的疏水性，引起TGF-β I的表达降低，从而导致炎症活动的升高。有研究发现携带T等位基因的2种基因型(CT及TT基因型)在患病组的分布频率显著高于正常对照组，显示T等位基因是类风湿性关节炎发生的易患基因，而C等位基因则是其发生的保护基因。[0007]单核苷酸多态性已成为人类群体遗传学的生物学标志，因此建立简单、快速的类风湿性关节炎易感基因无创检测方法，能够检测出与类风湿性关节炎发生相关的单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患该病的高危人群进行预防，对降低类风湿性关节炎的发病率有着重要意义。

[0008]基于ERa 基因上 Pvu II (rs 2234693)、ER a 基因上 Xba I (rs 9340799)、TGF-β I基因上T869C (rsl982073)的3个单核苷酸多态性位点基因型可用来评估类风湿性关节炎发病风险级别，本发明提供一种类风湿性关节炎基因无创检测试剂盒。
[0009]该试剂盒包括:
检测 ERa 基因上 Pvu II (rs 2234693)、ER a 基因上 Xba I (rs 9340799)、TGF-β I基因上T869C (rsl982073)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；
PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；
PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；
DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等)。
[0010]本发明试剂盒的组分和含量包括:
PCR 反应体系:10 XPCR 反应缓冲液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul。
[0011]PCR 产物纯化体系:iu/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20
3.875ul。
[0012]测序反应体系:25%BigDyemix lul ；3.2uM DNA 测序引物 lul ; 125mM EDTA 溶液lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul。
[0013]本试剂盒供一人份检测使用，试剂盒的保存温度为-20°C。

[0014]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0015]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0016]
实施例1.检测试剂盒的使用 1、抽提DNA模板
刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。
[0017]2、PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对:(1)ER α (Pvu II)正向引物:5’ CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTA3’
ER α (Pvu II)反向引物:5’ CTCCTGCACCAAGCCCCATTC3’
(2)ERa ( Xba I)正向引物:5’ CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTA3’
ERa ( Xba I)反向引物:5’CTCCTGCACCAAGCCCCATTC3’
(3 ) TGF- β I (T869C)正向引物:5’ AAAGAAATGGAGGCAATAGGTT3’
TGF- β I (T869C)反向引物:5’ TCATCTGGAGGAAGCGGTAG3’
PCR扩增的反应体系为:10XPCR反应缓冲液2.5ml ;25mM的dNTP混合液0.2ml、5U/ul Taq 酶 0.125ml,DNA 模板 Iml (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0.25ml、ddH2019.175ml ； 反应条件为:94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C I分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。
[0018]3、PCR扩增产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去离子水 3.875ul。
[0019]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。
[0020]4、DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物:
(1)ERa(Pvu II)测序引物:5’CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTA3’
(2)ERa ( Xba I)测序引物:5’CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTA3’
(3)TGF-β I (T869C)测序引物:5’ AAAGAAATGGAGGCAATAGGTT3’
反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA测序引物lul，去离子水2ul。
[0021]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98°C 2min，进行25个循环的960C 30s,55°C 30s, 60°C 4min。
[0022]反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室温下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min离心15min,轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入测
序仪中。
[0023]5、基因型分析
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。
[0024]实施例2.为人群进行预防类风湿性关节炎基因无创检测的服务
1.采样及抽提DNA
由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
[0025]2.基因型检测
使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的ERa基因上Pvu II (rs 2234693)、ERa 基因上 Xba I (rs 9340799)、TGF_ β I 基因上 T869C (rsl982073)的 3 个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这3个SNPs位点的基因型。[0026] 3.类风湿性关节炎高危人群风险评估分析
通过对受检者SNPs基因型的分析，出具类风湿性关节炎风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者 ERa 基因上 Pvu II (rs 2234693) ,ERa 基因上 Xba I (rs 9340799)、TGF-β I基因上T869C (rsl982073)的3个SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读类风湿性关节炎基因无创检测 报告单。