专利名称：蜂蜜基因的提取方法蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜物质。蜂蜜中含有多种糖，主要是果糖和葡萄糖。此外，还含有有机酸、酶和固体颗粒物如植物花粉等。由于蜂蜜市价较高，市场需求量大，有一些不法商贩以假乱真、以次充好，严重地损害了消费者利益，因此急需建立蜂蜜产品的鉴别评价体系。虽然蜂蜜产品从外观、口感等方面难以区分，但是蜂蜜DNA与蜜源植物有关，这是无法伪造的， 因此，基因检测手段在蜂蜜的质量控制方面显得尤为重要。目前国内外常用的种属成分检测方法，主要是以核酸为基础的聚合酶链式反应检测方法，简称PCR法。PCR法一般要求模板DNA的浓度达到20 ng/μ 1以上，纯度采用0D26(1/0D28(1比值来表示，0D26(1/0D28(1 比值需在1. Tl. 0之间。由于蜂蜜所含成分复杂，DNA较难提取，这在一定程度上限制了蜂蜜PCR检测方法的开展。目前常用的DNA提取方法主要有高盐低pH法、苯酚法和CTAB法。其中高盐低pH法主要用于植物组织DNA的提取。低pH有利于防止植物中的多酚类物质氧化，高盐则是有利于蛋白质沉淀。本实验尝试将高盐低PH法应用于蜂蜜DNA的提取中，经测定，采用高盐低PH法提取的洋槐蜂蜜DNA的浓度与纯度较低，DNA的浓度为 13ng/y l,OD260/OD280为1. 25，难以满足PCR反应的要求。经分析，高盐低pH法不适用于蜂蜜DNA提取的主要原因是与一般植物组织相比，蜂蜜样品中的DNA含量较少，采用高盐低pH 法难以达到富集纯化蜂蜜DNA的目的。苯酚法是采用裂解液将DNA释放出来，然后交替用苯酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性剂进行抽提，去除溶液中的蛋白质。苯酚、氯仿去蛋白质的能力较强而去多糖的能力较弱，适用于动物组织DNA的提取。本实验尝试将苯酚法应用于蜂蜜DNA提取中，样品经过苯酚及氯仿溶液的多次抽提后，所获得的DNA的质量较低，DNA的浓度为llng/μ 1，OD260/ OD28tl为1.43，难以满足PCR反应的要求。苯酚法不适用于蜂蜜DNA提取的主要原因是蜂蜜样品中的DNA含量低，在苯酚及氯仿溶液的多次抽提反应中损失较大，导致最终获得的DNA 含量偏低，DNA质量达不到下一步PCR检测的要求。CTAB法因为能较好地去除多糖杂质，故常用于植物组织DNA的提取。CTAB,即十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂。CTAB既可以裂解细胞膜，使核酸释放出来，又可在不同的盐离子浓度下选择性地沉淀多糖或者核酸，从而达到纯化DNA的目的。本方法尝试将常规CTAB法直接应用于蜂蜜DNA的提取中，所得蜂蜜DNA的浓度为16ng/y 1，OD260/ OD280为1. 39，不能满足后续PCR检测的需求。常规CTAB法不适用于蜂蜜DNA提取的主要原因是蜂蜜成分复杂，特别是多糖及蛋白含量高，应用常规CTAB法无法有效去除多糖以及蛋白杂质，影响了蜂蜜DNA的得率以及纯度。由于蜂蜜成分复杂，其中大约75%的成分为糖类，同时还含有多种酶、氨基酸、无机盐等，常规的CTAB法也无法提取获得高浓度与高纯度的蜂蜜DNA。所以必须改进，寻找能提取高浓度与高纯度蜂蜜DNA的方法，以满足PCR检测的要求。
本发明的目的是提供一种从蜂蜜中提取基因的方法。 本发明的技术方案采用蜂蜜基因的提取方法，按以下步骤顺序进行(1)取10mL以上蜂蜜，加入等体积的PH为7. (Γ8. 0的磷酸盐缓冲溶液，振荡广3小时，充分混勻后离心，弃去上清液，加入3 mL pH为7.CT8.0的磷酸盐缓冲溶液溶解沉淀，离心，弃去上清液，保留沉淀物；(2)加入1mL裂解缓冲液于沉淀物中，充分悬浮，混勻，加入10 4 1^农度为201^/1^的蛋白酶K溶液，混勻，置65 ！水浴加热45飞0 min，不时摇动；所述的裂解缓冲液是十六烷基三甲基溴化铵、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸和氯化钠的混合水溶液，其中十六烷基三甲基溴化铵的浓度为50mmol/L，三羟甲基氨基甲烷的浓度为lOmmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为2mmol/L，氯化钠的浓度为400mmol/L，用盐酸调pH至8. 0 ；
(3)取出，加入300μ 1饱和氯化钠溶液，剧烈振荡2分钟，置于0 °C下放置3、min, 离心；
(4)取上清液，加入等体积的苯酚氯仿异戊醇体积比为25:24:1的混合溶液，混勻， 离心；
(5)取上清液，加入等体积的氯仿异戊醇体积比为24:1的混合溶液，混勻，离心；
(6)取上清液，加入十分之一体积的3mol/L醋酸钠溶液，混勻，加入与混合液等体积的异丙醇，混勻，在-20 °C放置2小时，离心，弃去上清液，保留沉淀物；
(7)取沉淀物用75、0%乙醇洗涤后，室温下将乙醇吹干，将沉淀在室温下干燥得蜂蜜 DNA干品或将沉淀溶于pH8. 0的TE溶液中，即得蜂蜜DNA试剂。TE溶液中三羟甲基氨基甲烷的浓度为lOmmol/L，乙二胺四乙酸的浓度为lmmol/L，其余为水。本发明方法中，各步骤所述的离心操作为本领域分离DNA的常规操作，离心速度和时间通常为12 000 rpm离心10 min，并尽量在低温下操作。本发明方法中，所述的蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜物质，如洋槐蜂蜜、荔枝蜂蜜等；
本发明方法采用了 10 mL以上的蜂蜜提取体系，通过增大样品量的方法提高所获得蜂蜜DNA的浓度，又采用磷酸盐缓冲溶液去除蜂蜜中的可溶性多糖，利用裂解缓冲液使蜂蜜中的植物成分细胞裂解，在裂解细胞的同时用高浓度的氯化钠溶液使蛋白沉淀，并利用 CTAB在高离子强度下能使多糖沉淀但不能使核酸沉淀的原理，有效降低了糖蛋白对DNA纯化的干扰。用苯酚、氯仿、异戊醇混合溶液进一步除去蛋白，最后用异丙醇在低温条件下使核酸沉淀，获得片段完整，高浓度高纯度的蜂蜜DNA。所得蜂蜜DNA可满足PCR反应的要求， 使得利用分子生物学手段鉴定蜂蜜品质得以实现。本发明方法结果稳定，重现性好，操作简便，无需特殊仪器和试剂。经测定，本发明方法提取的蜂蜜DNA的浓度在lOOng/μ 1以上，0D26(1/0D28(1的比值在1. 7 2. 0之间，具体数据参见实施例中表1。本发明采用PCR扩增反应以及DNA琼脂糖凝胶电泳等方法对不同方法提取获得的蜂蜜DNA质量进行了检测。检测结果表明，本发明方法提取的蜂蜜DNA质量较好，进行PCR反应时可获得目标PCR产物，本发明可广泛应用于蜂蜜的分子生物学检测领域。本发明针对蜂蜜样品的特殊性，开发了高效的蜂蜜DNA提取方法，成功地从多种类型的蜂蜜样品中提取获得了高质量的蜂蜜DNA。在本方法的基础上可进一步根据蜂蜜蜜源植物品种设计特异性、专一性的引物序列进行PCR反应扩增，根据检测结果快速鉴定所提取蜂蜜样品的植物来源。如蜂蜜外包装标识的是金银花蜂蜜，通过本发明提取蜂蜜样品 DNA并进行PCR检测，如获得的蜂蜜DNA达到PCR检测要求，而不能扩增检测出金银花特异基因序列，则说明该蜂蜜并不是来源于金银花。本发明方法可开发特异性的蜂蜜基因提取试剂盒，所提取的蜂蜜DNA是应用于后续PCR检测中的关键试剂，使得应用分子生物学手段来鉴定蜂蜜的植物来源成为可能。本发明建立了稳定的蜂蜜基因的提取方法，并通过多方面的实验验证了发明方法的可靠性与有效性。本发明可广泛应用于蜂蜜基因的提取、蜂蜜蜜源植物品种的鉴定以及开发蜂蜜基因提取试剂盒等方面，具有良好的经济与社会效益。



图1是蜂蜜DNA电泳图，其中泳道M =Marker DNA大小标准；P 玉米基因组DNA对照品；1 实施例1中高盐低PH法提取的洋槐蜂蜜DNA ；2 实施例2中苯酚法提取的洋槐蜂蜜DNA ；3 实施例3中常规CTAB法提取的洋槐蜂蜜DNA ；4-7 实施例4_7本发明方法提取的蜂蜜DNA ；
图2是实施例1-7所提取的蜂蜜DNA的PCR产物电泳图，其中泳道M =Marker DNA大小标准；P 阳性对照品；1-7 :PCR产物；8 空白对照。下面结合附图和实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明的方法应用不仅限于以下实施例。

取IOmL蜂蜜，加入IOmL磷酸盐缓冲溶液，混勻。摇床上振荡2小时，12 000 rpm离心 10 min。弃去上清液，加入3mL磷酸盐缓冲溶液溶解沉淀。12 000 rpm离心10 min，弃去上清液，加入ImL裂解缓冲液溶解沉淀。然后加入10μ L浓度为20mg/mL的蛋白酶K溶液，混勻，65 °C水浴45 min, 12 000 rpm离心10 min。取上清液，加入等体积的浓度为2. 5mmol/L 的醋酸钾溶液，混勻，0 °C下放置5 min沉淀蛋白质，12 000 rpm离心10 min。取上清液，力口入十分之一体积的3mol/L的醋酸钠溶液，混勻。加入与混合液等体积的异丙醇，混勻，-20 °C放置2小时。取出，12 000 rpm离心10 min，弃去上清液。取沉淀物用75%乙醇洗涤后室温下将乙醇吹干，DNA沉淀溶于TE溶液，获得DNA试剂。3、结果经核酸蛋白分析仪测定，采用高盐低pH法所提取的洋槐蜂蜜DNA的浓度与纯度较低，DNA的浓度为13ng/l·! 1，OD260/OD280的比值为1. 25。取5μ L DNA溶液于含溴化已锭染色的0. 8%琼脂糖凝胶中电泳检测，检测结果如图1所示，泳道1显示没有DNA条带，说明高盐低PH法不适用于蜂蜜DNA的提取。4、PCR反应检测DNA的提取质量，方法如下
PCR反应缓冲体系采用预混合液，含Taq酶1. 25U/25 μ L，dNTP各0. 4mmol/L，Mg2+含量为3mmol/L。PCR反应体系为25 μ L，引物浓度各3 μ mol/L,模板用量1 μ L，纯水补足体积。 反应参数94°C预变性5min后，按94°C变性30sec，56°C退火30sec，72°C延伸30sec程序进行40个循环，最后一个循环后72°C延伸lOmin，于4°C结束反 应。正向引物为P1，序列为CGAAATCGGTAGACGCTACG，反向引物为 P2，序列为TTCCATTGAGTCTCTGCACCT。取 PCR 产物 5 μ L于含溴化已锭染色的2%琼脂糖凝胶中电泳检测。PCR产物电泳图见图2，泳道1显示没有扩增条带，检测结果说明以高盐低ρΗ法提取的蜂蜜DNA进行PCR反应，不能获得目标PCR产物。实施例2苯酚法提取洋槐蜂蜜DNA 1、材料洋槐蜂蜜。2、方法
取IOmL蜂蜜，加入IOmL磷酸盐缓冲溶液，混勻。将离心管置于摇床上振荡2小时，12 000 rpm离心10 min。弃去上清液，加入3mL磷酸盐缓冲溶液溶解沉淀，12 000 rpm离心 10 min.弃去上清液，保留沉淀物，加入ImL裂解缓冲液溶解沉淀。然后加入10 μ L浓度为 20mg/mL的蛋白酶K溶液，混勻，65 °C水浴45 min, 12 000 rpm离心10 min。取上清液，力口入等体积的苯酚氯仿异戊醇体积比为25 24 1的混合溶液，混勻，12 000 rpm离心10 min。取上清液，加入等体积的氯仿异戊醇体积比为24:1的混合溶液，12 000 rpm离心10 min。取上清液，加入等体积的氯仿异戊醇体积比为24:1的混合溶液，12 000 rpm离心10 min。取上清液，加入十分之一体积的3 mol/L的醋酸钠溶液，混勻，然后加入与混合液等体积的异丙醇，混勻，-20 °C放置2小时。取出，12 000 rpm离心10 min，弃去上清液。取沉淀物用75%乙醇洗涤后室温下将乙醇吹干，DNA沉淀溶于TE溶液，获得DNA试剂。3、结果经核酸蛋白分析仪测定，样品经过苯酚及氯仿溶液的多次抽提后，所得蜂蜜DNA的浓度为llng/μ 1，0D26Q/0D28Q的比值为1. 43。取5μ L DNA溶液于含溴化已锭染色的0. 8%琼脂糖凝胶中电泳，检测结果如图1所示，泳道2显示没有DNA条带，说明苯酚法不适用于蜂蜜DNA的提取。4、PCR反应检测DNA的提取质量，方法同实施例1，
PCR产物电泳图见图2，泳道2显示没有扩增条带，检测结果说明以苯酚法提取的蜂蜜 DNA进行PCR反应，不能获得目标PCR产物。实施例3常规CTAB法提取洋槐蜂蜜DNA 1、材料洋槐蜂蜜。2、方法
取IOmL蜂蜜，加入IOmL磷酸盐缓冲溶液，混勻。将离心管置于摇床上振荡2小时，12 000 rpm离心10 min。弃去上清液，加入3mL磷酸盐缓冲溶液溶解沉淀，12 000 rpm离心 10 min。弃去上清液，保留沉淀物，加入ImL裂解缓冲液溶解沉淀。然后加入10 μ L浓度为 20mg/mL的蛋白酶K溶液，混勻，65 °C水浴45 min, 12 000 rpm离心10 min。取上清液，力口入等体积的氯仿异戊醇体积比为24 1的混合溶液，12 000 rpm离心10 min。取上清液，加入十分之一体积的3 mol/L的醋酸钠溶液，混勻，然后加入与混合液等体积的异丙醇，混勻，-20 °C放置2小时。取出，12 000 rpm离心10 min，弃去上清液。取沉淀物用75%乙醇洗涤后室温下将乙醇吹干，DNA沉淀溶于TE溶液，获得DNA试剂。3、结果经核酸蛋白分析仪测定，常规CTAB法所提取的蜂蜜DNA的浓度为16ng/ μ l,OD260/OD280的比值为1. 39。取5 μ L DNA溶液于含溴化已锭染色的0. 8%琼脂糖凝胶中电泳，检测结果如图1所示，泳道3显示没有DNA条带，说明常规CTAB法不适用于蜂蜜DNA 的提取。4、PCR反应检测DNA的提取质量，方法同实施例 1，
PCR产物电泳图见图2，泳道3显示没有扩增条带，电泳结果说明以常规CTAB法提取的蜂蜜DNA进行PCR反应，不能获得目标PCR产物。实施例4本发明方法提取洋槐蜂蜜DNA 1、材料洋槐蜂蜜。2、方法 试剂的配制
ρΗ为7. (Γ8. 0的磷酸盐缓冲溶液磷酸盐缓冲溶液配制方法见文献《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克D.W.拉赛尔著，黄培堂等译，科学出版社，附录1，第1570页。具体操作称取8. 00克氯化钠，0. 20克氯化钾，1. 44克磷酸氢二钠，0. 24克磷酸二氢钾，用适量水溶解后，用盐酸调节溶液的PH值至7 8，定容至1L，分装后高压蒸汽灭菌，保存于室温。裂解缓冲液称取18. 20克十六烷基三甲基溴化铵，23. 38克氯化钠，1. 21克三羟甲基氨基甲烷，0. 60克乙二胺四乙酸，用适量水溶解后，用盐酸调节溶液的ρΗ值至8.0，定容至1L，分装后高压蒸汽灭菌，保存于室温。TE溶液称取1.21克三羟甲基氨基甲烷，0.30克乙二胺四乙酸，用适量水溶解后， 用盐酸调节溶液的PH值至8. 0，定容至1L，分装后高压蒸汽灭菌，保存于室温。DNA的提取(1)取10 mL蜂蜜，加入10 mL磷酸盐缓冲溶液，摇床上振荡2小时， 充分混勻，12 000 rpm离心10 min，弃去上清液，加入3 mL磷酸盐缓冲溶液溶解沉淀，离心， 弃去上清液，保留沉淀物；(2)加入1 mL裂解缓冲液于沉淀物中，充分悬浮，加入10 yL浓度为20 mg/mL的蛋白酶K溶液，混勻，置65 ！水浴加热45 min，不时摇动；(3)取出，加入 300 μ 1饱和氯化钠溶液，剧烈振荡2分钟，置于0 °C下放置5 min,离心；(4)取上清液，加入等体积的苯酚氯仿异戊醇体积比为25:24:1的混合溶液，混勻，离心；(5)取上清液， 加入等体积的氯仿异戊醇体积比为24:1的混合溶液，混勻，离心；(6)取上清液，加入十分之一体积的3 mol/L醋酸钠溶液，混勻，加入与混合液等体积的异丙醇，混勻，在-20 °C 放置2小时，离心，弃去上清液，保留沉淀物；(7)取沉淀物用75%乙醇洗涤后，室温下将乙醇吹干，将沉淀溶于PH8. 0的TE溶液中，获得蜂蜜DNA试剂。3、结果经核酸蛋白分析仪测定，本发明方法提取的洋槐蜂蜜DNA的浓度为 lOSng/μ l,OD260/OD280的比值为1. 82。取5μ L DNA溶液于含溴化已锭染色的0. 8%琼脂糖凝胶中电泳，结果如图1，泳道4显示样品DNA条带清晰，说明本发明方法提取的DNA质量较好。4、PCR反应检测DNA的提取质量，方法同实施例1，
PCR产物电泳图见图2，泳道4显示本发明方法提取的DNA可获得PCR产物，所得产物大小符合实验设计，扩增片段大小为180bp。实施例5本发明方法提取益母草蜂蜜DNA 1、材料益母草蜂蜜。2、方法同实施例4:
取15mL蜂蜜，加入15mL磷酸盐缓冲溶液，按实施例4的提取步骤进行处理，最后在室温下干燥得蜂蜜DNA干品。3、结果使用TE溶液溶解DNA干品，经核酸蛋白分析仪测定，本发明方法提取的益母草蜂蜜DNA的浓度为115ng/ μ 1，OD260/OD280的比值为1. 85。取5 μ L DNA溶液于含溴化已锭染色的0. 8%琼脂糖凝胶中电泳，结果如图1，泳道5显示样品DNA条带清晰，说明本发明方法提取的DNA质量较好。4、PCR反应检测DNA的提取质量，方法同实施例1
PCR产物电泳图见图2，泳道5显示本发明方法提取的DNA可获得PCR产物，所得产物大小符合实验设计，扩增片段大小为180bp。
实施例6本发明方法提取桂花蜂蜜DNA 1、材料桂花蜂蜜。2、方法同实施例4。3、结果经核酸蛋白分析仪测定，本发明方法提取的桂花蜂蜜DNA的浓度为 137ng/y l,OD260/OD280的比值为1. 78。取5μ L DNA溶液于含溴化已锭染色的0. 8%琼脂糖凝胶中电泳，结果如图1，泳道6显示样品DNA条带清晰，说明本发明方法提取的蜂蜜DNA质
量较好。4、PCR反应检测DNA的提取质量，方法同实施例1
PCR产物电泳图见图2，泳道6显示本发明方法提取的DNA可获得PCR产物，所得产物大小符合实验设计，扩增片段大小为180bp。实施例7本发明方法提取荔枝蜂蜜DNA 1、材料荔枝蜂蜜。2、方法同实施例4。3、结果经核酸蛋白分析仪测定，本发明方法提取的荔枝蜂蜜DNA的浓度为 106ng/y l,OD260/OD280的比值为1. 89。取5μ L DNA溶液于含溴化已锭染色的0. 8%琼脂糖凝胶中电泳，结果如图1，泳道7显示样品DNA条带清晰，说明本发明方法提取的DNA质量较好。4、PCR反应检测DNA的提取质量，方法同实施例1
PCR产物电泳图见图2，泳道7显示本发明方法提取的DNA可获得PCR产物，所得产物大小符合实验设计，扩增片段大小为180bp。7个实施例提取的蜂蜜DNA的浓度与纯度结果见下表1。表1不同方法提取的蜂蜜DNA的浓度与纯度


蜂蜜基因的提取方法，涉及生物化学领域。本发明方法采用了10毫升以上的蜂蜜进行提取，又采用磷酸盐缓冲溶液去除蜂蜜中的可溶性多糖，利用裂解缓冲液使蜂蜜中的植物成分细胞裂解，同时用高浓度的氯化钠溶液除去大部分糖蛋白，减少纯化时糖蛋白对DNA的干扰。用苯酚、氯仿、异戊醇混合溶液进一步除去蛋白，最后用异丙醇在低温条件下使DNA沉淀，获得纯化的蜂蜜DNA。本发明方法结果稳定，重现性好，且操作简单、费用低、无需特殊仪器和试剂，所得蜂蜜DNA质量较好，能满足聚合酶链式反应的要求，可实现蜂蜜品质的快速鉴定。本发明方法可开发蜂蜜基因提取试剂盒，提取获得的蜂蜜DNA可作为试剂应用于蜂蜜来源的快速鉴定中。