专利名称：3,4-二氯异香豆素在制备抗球虫病药物中的用途的制作方法球虫病一直是养鸡生产中主要控制和治疗的疾病之一，尤其是集约化养鸡方式的大面积推广及应用之后，更成为常见多发性疾病，其中以柔嫩艾美耳球虫最为严重。抗球虫药物可以说是饲料中必须添加的药物之一，但是近年来由于抗药性的问题，及药物残留等问题，使得抗球虫药物的研究进入了一个瓶颈的阶段。顶器门寄生性原虫生活史复杂，因此对其侵入机制的研究一直困扰着研究者。柔嫩艾美耳球虫的细胞膜内含有一种丝氨酸蛋白酶，即Rhomboid蛋白，它的酶活性的发挥是虫体侵入宿主细胞的关键。3，4- 二氯异香豆素是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，它是否能够抑制柔嫩艾美耳球虫Rhomboid蛋白活性，从而阻碍虫体侵入宿主细胞并未见有报道。
本发明提供了 3，4- 二氯异香豆素在制备抗球虫病药物中的用途，为一种新的医用用途，用于球虫疾病的预防和治疗。本发明的技术方案是这样实现的体外分离鸡肾细胞，对其进行原代细胞培养。同时将3，4-二氯异香豆素稀释成不同终浓度的培养液。然后提取柔嫩艾美耳球虫子孢子，将各浓度溶液平均分成两部分，一部分在加入细胞培养板前与子孢子作用，然后洗去药物后接入细胞；另一部分与子孢子一同接入细胞，培养一定时间后，用Hank’ s液洗去药物，甲醇固定染色，在显微镜下计数。观察不同浓度的3，4- 二氯异香豆素对子孢子的侵入、裂殖体和卵囊形成的影响。以下药理实验证明本发明的治疗效果体外进行鸡肾细胞的原代培养；然后提取柔嫩艾美耳球虫子孢子，将3，4- 二氯异香豆素通过DMSO (二甲基亚砜)溶解，配制成100 μ M的溶液，在向细胞培养板中加入3，4-二氯异香豆素时，分别稀释成终浓度为1 μΜ、10 μΜ、20 μΜ、30 μΜ、40 μΜ、50 μ M的培养液。将各浓度溶液平均分成两部分，一部分在加入细胞培养板前与子孢子作用，然后洗去药物后接入鸡肾细胞；另一部分与子孢子一同接入鸡肾细胞。培养一定时间后，在显微镜下对子孢子形成的第一代裂殖体、第二代裂殖体以及子代卵囊进行计数，具体的判定标准如下抑制剂对细胞的毒性，以细胞脱落为标准。采用兼顾第一代裂殖体数量、第二代裂殖体数量和卵囊数量的原则，即以第一代裂殖体数量为第一指标，判断3，4- 二氯异香豆素对子孢子侵入细胞的影响；以第二代裂殖体数量 为第二指标；判断3，4- 二氯异香豆素对五tenella的治疗效果 (第二代裂殖阶段是造成鸡只死亡的主要阶段)；以卵囊数量为第三指标，判断3，4-二氯异香豆素对病原控制的效果(随患鸡粪便排出的卵囊是健康鸡群的传染源)。第一代裂殖体数子孢子接种后48 h，在100倍倒置显微镜下观察并计算各组的第二代裂殖体数，每组计算20个视野；第二代裂殖体数子孢子接种后108 h，在100倍倒置显微镜下观察并计算各组的第二代裂殖体数，每组计算20个视野。卵囊形成数子孢子接种后8 d，同样方法统计子代卵囊数量。1、第一代裂殖体数量
将五tenella子孢子接种于鸡肾细胞48h后，通过倒置显微镜对第一代裂殖体数量进行统计，如图1所示，随着丝氨酸蛋白酶抑制剂3，4- 二氯异香豆素浓度的增加，共培养组的第一代裂殖体数量呈逐渐减少的趋势，而提前处理的这一组则变化幅度不大，趋势不明显。与空白空白对照组相比，共培养组在3，4- 二氯异香豆素浓度20 μ M和30 μ M时差异极显著(Ρ<0. 01)，40 μ M和50 μ M时差异显著(Ρ<0. 05)，而前处理组则与空白空白对照组无明显差异。当3，4- 二氯异香豆素浓度达到40 μ M和50 μ M时细胞出现一定的脱落现象，可见3，4- 二氯异香豆素在40 μ M时抑制了细胞的生长与代谢，从而导致了细胞的死亡。结果表明，20 μ M的3，4-二氯异香豆素浓度可以有效抑制体外球虫对鸡肾细胞的侵入。2、第二代裂殖体数量
子孢子接种鸡肾细胞108h后，通过倒置显微镜对第二代裂殖体数量进行统计，如图 2所示，共培养组的第二代裂殖体数量随着丝氨酸蛋白酶抑制剂3，4- 二氯异香豆素浓度的增加而逐渐减少，而提前处理的这一组无明显变化。与空白对照组相比，共培养组在 3，4-二氯异香豆素浓度20 μ M时差异显著(Ρ<0. 05)，30μΜ、40μΜ、5μΜ时差异极显著 (Ρ<0. 01)，而前处理组则与空白空白对照组数量相似。当细胞培养4天后，3，4-二氯异香豆素浓度在40 μ M和50 μ M时，细胞脱落现象明显，细胞死亡的数量明显增多。结果表明，30 μ M的3，4-二氯异香豆素浓度可以明显控制球虫的第二代裂殖生殖，对鸡球虫病有一定潜在的治疗作用。3、卵囊数量
子孢子接种鸡肾细胞8d后，通过倒置显微镜对子代卵囊数进行统计，如图3所示，共培养组的子代卵囊数随着丝氨酸蛋白酶抑制剂3，4- 二氯异香豆素浓度的增加呈现逐渐减少趋势，而提前处理的这一组无明显变化。与空白对照组相比，共培养组在3，4-二氯异香豆素浓度20 μ M时差异显著(Ρ<0. 05)，30 μ M时差异不显著(Ρ>0. 05)，40 μ Μ、50 μ M时差异极显著(Ρ<0. 01)，而前处理组则与空白对照组数量无明显差异。当细胞培养8天后，3，4-二氯异香豆素浓度在40 μ M和50 μ M时，细胞已出现大片脱落现象，可见一定浓度3，4- 二氯异香豆素对于细胞有慢性抑制生长分裂的作用。结果表明，柔嫩艾美耳球 虫子孢子在体外培养的鸡肾细胞中完成了整个的生活史 (如图4)，20μΜ的3，4-二氯异香豆素浓度就可以有效控制球虫子代卵囊产出量，对于病原的传播有潜在控制作用。综合上述实验结果，通过3，4- 二氯异香豆素体外对球虫子孢子侵染细胞的抑制实验说明20 μ M的3，4- 二氯异香豆素即可有效抑制子孢子体外对鸡肾细胞的侵入，同时能够控制球虫子代卵囊的产出量，对球虫病有一定的治疗作用，可以成为抗球虫药物的主要成分。本发明的 积极效果在于利用3，4- 二氯异香豆素对子孢子侵入细胞的抑制作用， 将3，4-二氯异香豆素应用到寄生虫病领域，控制球虫子代卵囊的产出量，制备治疗抗球虫病的药物，用于球虫疾病的预防和治疗。


图1、柔嫩艾美耳球虫第一代裂殖体的数量变化； 图2、柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖体的数量变化；
图3、柔嫩艾美耳球虫子代未孢子化卵囊数量变化； 图4、柔嫩艾美耳球虫体外培养的镜检观察图片；
图中带*号者，表示与对照相比差异显著，带**表示与对照相比差异极显著。

以3，4- 二氯异香豆素作为有效成分可制成药物学上的任何药物剂型，包括颗粒齐U、散剂、片剂；也可以通过二甲基亚砜溶解，配制成100 μ M的溶液，使用时将溶液稀释成 20 μ M即可。


本发明公开了3,4-二氯异香豆素在制备抗球虫病药物中的用途，利用3,4-二氯异香豆素对子孢子侵入细胞的抑制作用，将3,4-二氯异香豆素应用到寄生虫病领域，控制球虫子代卵囊的产出量，制备治疗抗球虫病的药物，用于球虫疾病的预防和治疗。