一种胸苷酸合成酶基因5’-非编码区串联重复多态性检测试剂盒的制作方法 试剂盒[0002]胸苷酸合成酶(Thymidylate synthase, TS)是由两个相同亚单位组成的二聚体蛋白，相对分子质量为72kDa，是DNA合成的关键酶，它催化脱氧尿苷酸甲基化，使之转变为脱氧胸苷酸。TS在DNA合成与修复、细胞增殖与分化中有十分重要的作用，是肿瘤化疗药5-Fu和甲氨蝶呤等重要靶酶。[0003]氟类药物包括5-氟尿嘧啶(5-FU)、替加氟、卡莫氟、氟尿苷、脱氧氟尿苷以及卡培他滨等。该类药物为尿嘧啶的氟代衍生物，在体内转化为5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸(5F-dUMP)后，可抑制胸苷酸合成酶(TS)，阻止脱氧尿苷酸(dUMP)甲基化为脱氧胸苷酸(dTMP)，从而抑制DNA合成。研究显示TS的高表达与这些药物的抗药性以及乳腺癌、胃癌和结直肠癌等肿瘤的预后差相关[0004]TS基因具有多态性，TS基因的多态性有可能导致酶活性或功能的改变，从而改变个体对癌症的易感性以及癌症患者对化疗药物的敏感性。TS基因的5’ -非编码区(5-untranslated region, 5，-_ 增强子区域(TSER)存在一段长 28bp 的 2 次(2R)、3 次(3R)串联重复多态和一个杂合子基因型。体外研究显示:重复序列数量增多可导致TS表达增加及活性增强。而3次串联重复序列的存在相比2次重复序列可使TYMS基因的表达上调2.6倍。有研究表明该序列重复次数与5-FU的3-4级毒副作用相关，2R/2R型患者产生毒副作用的风险较高。结直肠癌体内研究也显示:纯合子3R/3R基因型的患者体内的TS水平是纯合子2R/2R基因型患者的3.6倍，是杂合子3R/2R基因型患者的1.7倍。纯合子2R/2R基因型者对5-FU敏感性较高，疗效较好。[0005]因此，TS基因5’ -UTR串联重复多态性的检测对于指导临床肿瘤病人的个体化用药至关重要。但目前临床检测该基因多态性的检测试剂原料需多方配备，实验过程分步进行，耗时较长，容易污染，本方法简单快速可靠。实用新型内容[0006]本实用新型要解决的技术问题是提供一种胸苷酸合成酶基因5’ -非编码区串联重复多态性检测试剂盒，该试剂盒结构简单、设计合理、使用方便、制造容易、检测过程不易受污染；该试剂盒在检测胸苷酸合成酶基因5’ -非编码区串联重复多态性时具有敏感性高、特异性强、耗时短等优点，并且该试剂盒在运输过程中，其内部的试剂容器不易左右晃动，试剂盒不易被压扁，保证了试剂容器的安全。
[0007]为了解决上述技术问题，本实用新型一种胸苷酸合成酶基因5’ -非编码区串联重复多态性检测试剂盒，包括盒体、固定座、装引物的试剂瓶、装酶混合物的试剂瓶、离心管和加样器吸头，所述固定座上设置有第一孔和第二孔，所述装引物的试剂瓶、装酶混合物的试剂瓶和加样器吸头放置在第一孔内，所述第一孔包括折痕线和沿径向设置的切口，所述第一孔的开口小于放置在其内部容器的直径，所述第二孔的侧壁上设置有螺纹状的凹槽，所述离心管的外侧包裹有一橡胶套，所述橡胶套的外侧面设有与所述第二孔上的凹槽相对应的突起，所述固定座上设有支撑板，所述支撑板的两端与盒体的内侧壁固定连接，所述支撑板的高度等于固定座上表面到盒盖内侧面的距离。
[0008]其中，扩增引物为特异性扩增TSE的引物，上游引物序列为gtggctcctgcgtttcccccc ;下游引物序列为:gctccgagccggccacaggcatggcgcgg,引物浓度为 100pmol/L。
[0009]所述酶混合物包括浓度为0.4mmo1 /I,的 dNTPs,4mmol/L 的 Mg2+,2x Buffer,1U/25 μ I 的 rTaq。
[0010]本实用新型与现有产品相比，具有如下积极有益的效果:
[0011]本试剂盒结构简单、设计合理、使用方便、制造容易、检测过程不易受污染；本试剂盒在检测胸苷酸合成酶基因5’ -非编码区串联重复多态性时具有敏感性高、特异性强、耗时短等优点。并且本试剂盒在运输过程中，其内部的试剂容器不易左右晃动，试剂盒不易被压扁，保证了试剂容器的安全。



[0012]图1为本实用新型的整体结构示意图。
[0013]图2为本实用新型的固定座的俯视图。
[0014]图3为本实用新型的橡胶套的主视图。

[0015]下面结合附图和实施例对本实用新型进行进一步说明。
[0016]表I为本实用新型PCR反应体系。
[0017]如图1?3所示，本实用新型的一个实施例为胸苷酸合成酶基因5’ -非编码区串联重复多态性检测试剂盒，包括盒体1、固定座2、支撑板3、装引物的试剂瓶4、装酶混合物的试剂瓶5、离心管6和加样器吸头7，在固定座2上设有第一孔8和第二孔9，装引物的试剂瓶4、装酶混合物的试剂瓶5和加样器吸头7放置在第一孔8内，第一孔8包括折痕线81和沿径向设置的切口 82，第一孔8的开口要小于其内部放置的容器的直径。这样当容器放入第一孔8时，第一孔8沿切口 82打开，并沿着折痕线81弯折，从而第一孔8将容器夹紧。第二孔9的侧壁上设置有螺纹状的凹槽91，离心管6的外侧包裹有一橡胶套10，橡胶套10的外侧面设有与所述第二孔9上的凹槽91相对应的突起11。橡胶套10依靠自身材料的弹力将离心管6包裹紧，使其不易脱落。然后将橡胶套10沿凹槽91插入进第二孔9，这样橡胶套10通过突起11与凹槽91的配合固定在第二孔9内。
[0018]其中，扩增引物为特异性扩增TSE的引物，上游引物序列为gtggctcctgcgtttcccccc ;下游引物序列为:gctccgagccggccacaggcatggcgcgg,引物浓度为 100pmol/L。
[0019]所述酶混合物包括浓度为0.4mmo1 /I,的 dNTPs,4mmol/L 的 Mg2+,2x Buffer,1U/25 μ I 的 rTaq。
[0020]操作方法:
[0021]I)取模板 DNA
[0022]取病人全血1ml，常规提取DNA，取IulDNA作为模板。
[0023]2)反应体系
[0024]将各反应物质按照如下表1中反应体系进行配比:
[0025]表1