专利名称：一种虫草素的发酵生产方法虫草菌素(cordyc印in)，即3’ -脱氧腺苷。它有多种生物学活性，如抗肿瘤、抗增殖、抗转移、抗菌、抗病毒、免疫调节和抗炎等。在最近的十年间，以虫草菌素作为治疗药物的靶向研究取得重大进展。这些研究包括虫草菌素在各种癌症上的应用，特别是白血病(在美国已进入三期临床)，还有非洲锥虫病和血管成形术引起的再狭窄以及虫草菌素衍生物体内抗氧化的作用等。所以，虫草菌素的合成技术是人们比较关心的研究课题。在日韩等国家一直有研究单位专业从事高纯度虫草菌素的制备、分离纯化等工作，研究技术世界领先。日本学者Masuda等报道利用表面液体培养技术发酵C mi Ii tar is制备虫草菌素，浓度达到0. 640g/L,生产效率为0. 032g/L/d。一年后，通过加入与嘌呤生物合成相关的化合物促进虫草菌素的积累，浓度和生产效率分别提高至2. 5g/L和0. 19g/L/d。最近，他们又报道了一种通过离子束诱变获得虫草菌素高产菌的方法，虫草菌素的表面液体发酵浓度达到6. 84g/L，是目前世界上文献报道的最优结果。虽然近年来我国也进行了大量的同类研究，但仅停留在虫草菌丝体的人工培养及制剂的研究上，水平有限，技术含量不高，无法同国外同类产品竞争。2004年，钟建江等人利用两步溶氧控制液体深层发酵C mi Ii tar is制备虫草菌素，积累浓度达到0. 201g/L，生产效率达到0. 016g/L/d。接着他们又优化了碳源和碳氮比，积累浓度和生产效率分别提高到0. 345g/L和0. 019g/L/d。此后一年，他们又报道了铵离子对虫草菌素积累的效应，虫草菌素的浓度达到0. 421g/L，生产效率达到0. 025g/L/d。因此，加速虫草菌素制备、分离、纯化及产业化的研究不仅能够填补国内主流医药市场的空白，占据国内同类药品的较大市场份额，而且有可能较快在国际同类药品市场占有一席之地。目前虫草的工业发酵中，主要采用固态发酵和深层液体发酵两种。这两种发酵方式各有利弊。对于不同的菌株采用独特的发酵方式，才能获得最佳的效果。Mao XB 等人的间歇性发酵工艺[Mao XB, Zhong JJ. Significant effect ofNH4+ on cordycepin production by submerged cultivation of medicinal mushroomCordyceps militaris. Enzyme Microb Tech 2006; 38:343-350.]，在常规发酵 7 天后，加入40mmol/L硫酸铵，再继续发酵10天后，虫草菌素浓度达到最大，为420. 4mg/L,生产效率为0. 025g/L/d。该工艺菌株生长缓慢导致发酵时间长，发酵得率不高，发酵产物浓度低。中国专利CN 1923998A公开了一种静置发酵工艺，该工艺流程包括液体培养基配制，培养基的分装、灭菌、接菌，菌丝体的静置培养，菌丝体转色、原基分化，子实体生长、采收、干制。装有液体培养基的菌瓶接菌后，放入遮光、1纩20°C养菌室内静置培养，7 10天菌丝长满液面，即得蛹虫草菌；提高温度2(T22°C，加强光照，8 10天后菌丝由白色专为桔黄色，菌丝扭结形成瘤突起物，分化形成原基；在封口膜上开透气小孔，增大透气量，蛹虫草子实体逐渐伸长，顶部膨大，少量子囊孢子开始散出，开始采收；及时放入恒温箱中，烘干即可。本实验室对pH值的控制方式对虫草素产量的影响进行了深入的研究。本发明在此基础上进行补料分批发酵调控，即根据菌株生长和起始培养基的特点，在分批发酵的某阶段适当补加能源和虫草素前体，并同时维持PH值在最佳虫草素合成条件下，使得菌株保持一定的菌体生长密度，使其代谢流不断迁移，促进产物虫草素的生成，补料分批发酵是介于分批发酵与连续发酵之间，兼有两者的优点，又克服了两者的缺点，因此具有很好的发展前景。
本发明所要解决的技术问题是提供一种恒PH流加补料策略发酵生产虫草素的方法，使菌种保持一定的菌体生长密度，又促使代谢流迁移，有利于虫草素的生成。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种虫草素的发酵生产方法，将活化后的菌株蛹虫草Cbr办⑶/ZS mi Ii tar is CICCNo. 14014 (中国工业微生物菌种保藏管理中心)以;Γ5%(ν/ν)的接种量接入到装有发酵培养基的发酵罐中，发酵温度为2548°C，搅拌转速为150-180rpm，流加氢氧化钠溶液和盐酸控制发酵液PH值保持在5. 5-6. 0 ；当碳源消耗完毕时，搅拌转速降为60-80rpm，利用间歇流加的方式向发酵罐中补加含葡萄糖和腺苷的水溶液，整个发酵时间为200480h。其中，所述的菌株需先经过活化，即将菌株转入种子培养基活化两次，每次25°C培养5天，其中，所述的种子培养基配方按如下方法制得取去皮的马铃薯200克，切成Icm见方小块，加水1000毫升煮沸30分钟，4层纱布滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，加葡萄糖20克，KH2PO4 3克，MgS04_7H20 1.5克，维生素Bl 0. 2g，琼脂15克，溶化后分装，121 °C灭菌30分钟。其中，所述的发酵培养基配方如下葡萄糖42g/L、酵母膏6g/L、蛋白胨10g/L、KH2PO4 0. 5g/L、K2HPO4 · 3H20 0. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，溶剂为水，ρΗ6· 0，121°C灭菌 20分钟。其中，所述的氢氧化钠溶液浓度为10%(w/w)，所述的盐酸浓度为10%(w/w)。其中，所述间歇流加，流速为0. 6mL/h。其中，所述的含葡萄糖和腺苷的水溶液，其中葡萄糖的浓度为500g/L，腺苷的浓度为 3g/L。本发明的有益效果通过控制发酵过程的PH值并及时补加能源和虫草素前体，使得发酵过程能够得以保持在最佳环境下，有利于菌体的生长，且有利于代谢流的迁移，所以最终虫草素产量可以达到10. Og/L(是现有工艺产量的M倍)，生产效率达到0. 25g/L/d(是现有工艺生产效率的34倍)，工艺简单、环境污染小、操作方便、虫草素的产量高。采用岛津LC-9A色谱工作站，色谱柱采用Ultimate AQ-C18柱，柱型(粒径5 μ m，250X 4. 6 mm)。流动相为10 mmol/L KH2PO4溶液和甲醇，体积比为85 15。流速lml/min，柱温30°C，检测波长为260nm。实施例1 菌种-.Cordyceps mi Ii tar is CICC No. 14014 (中国工业微生物菌种保藏管理中心)。保藏培养基和种子培养基按如下方法制备取去皮的马铃薯200克，切成Icm见方小块，加水1000毫升煮沸30分钟，4层纱布滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，加葡萄糖20克，KH2PO4 3克，MgSO4 7H20 1. 5克，维生素Bl 0. 2g，琼脂15克，溶化后分装，121 °C灭菌30分钟。发酵培养基配方如下葡萄糖42g/L、酵母膏6g/L、蛋白胨10g/L、KH2PO4 0. 5g/L、K2HPO4 · 3H20 0. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，溶剂为水，ρΗ6· 0，121°C灭菌 20 分钟。菌种保藏所用菌种保藏在保藏培养基斜面上，4°C保存，两月转接一次。种子培养从保藏培养基上转入种子培养基需活化两次，每次25°C培养5天。液体培养菌株以3%(v/v)的接种量接入5L的发酵罐中，装液量为3L，25°C发酵，搅拌转速为150rpm，流加10%(w/w)氢氧化钠溶液和10%(w/w)盐酸，控制pH在5. 5 ；当葡萄糖消耗完毕时(可利用3，5- 二硝基水杨酸法测定发酵液中葡萄糖的含量，大约90h消耗完毕)，搅拌转速降为80rpm，向发酵罐中补加含500g/L葡萄糖和3g/L腺苷的水溶液，流速0. 6mL/h,培养至^Oh后结束发酵，虫草素产量为10. Og/L,生产效率达到0. 86g/L/d。实施例2
菌种-.Cordyceps mi Ii tar is CICC No. 14014 (中国工业微生物菌种保藏管理中心)。保藏培养基和种子培养基按如下方法制备取去皮的马铃薯200克，切成Icm见方小块，加水1000毫升煮沸30分钟，4层纱布滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，加葡萄糖20克，KH2PO4 3克，MgSO4 7H20 1. 5克，维生素Bl 0. 2g，琼脂15克，溶化后分装，121 °C灭菌30分钟。发酵培养基配方如下葡萄糖42g/L、酵母膏6g/L、蛋白胨10g/L、KH2PO4 0. 5g/L、K2HPO4 · 3H20 0. 5g/L、MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，溶剂为水，ρΗ6· 0，121°C灭菌 20 分钟。菌种保藏所用菌种保藏在保藏培养基斜面上，4°C保存，两月转接一次。种子培养从保藏培养基上转入种子培养基需活化两次，每次25°C培养5天。液体培养菌株以5%(v/v)的接种量接入5L的发酵罐中，装液量为3. 5LJ8°C发酵，搅拌转速为180rpm，流加10%(w/w)氢氧化钠溶液和10%(w/w)盐酸，控制pH在6. 0 ；当葡萄糖消耗完毕时(可利用3，5- 二硝基水杨酸法测定发酵液中葡萄糖的含量，大约90h消耗完毕)，搅拌转速降为60rpm，向发酵罐中补加含500g/L葡萄糖和3g/L腺苷的水溶液，流速0. 6mL/h,培养至200h后结束发酵，虫草素产量为7. 2g/L，生产效率达到0. 86g/L/d。对比例1
与实施例1相同，所不同的是液体培养。液体培养菌株以5%(v/v)的接种量接入5L的发酵罐中，装液量为3. 5L，25°C发酵，搅拌转速为180rpm，发酵至200h后结束发酵，虫草素产量为2. lg/L，生产效率达到0.21g/L/d。对比例2:
与实施例1相同，所不同的是液体培养。液体培养菌株以5%(v/v)的接种量接入5L的发酵罐中，装液量为3. 5L，25°C发酵，搅拌转速为180rpm，流加10%(w/w)氢氧化钠溶液和10%(w/w)盐酸，控制pH在6. 0发酵至200h后结束发酵，虫草素产量为4. 2g/L，生产效率达到0. 42g/L/d。对比例3:
与实施例1相同，所不同的是液体培养。液体培养菌株以5%(v/v)的接种量接入5L的发酵罐中，装液量为3. 5L，25°C发酵，搅拌转速为ISOrpm ；当葡萄糖消耗完毕时(约90h)，搅拌转速降为60rpm，向发酵罐中补加含500g/L葡萄糖和3g/L腺苷的水溶液，流速0. 6mL/h,培养至200h后结束发酵，虫草素产量为4. lg/L，生产效率达到0. 41g/L/d。


本发明公开了一种虫草素的发酵生产方法，将活化后的菌株蛹虫草接入到装有发酵培养基的发酵罐中，发酵温度为25-28℃，搅拌转速为150-180rpm，流加氢氧化钠溶液和盐酸控制发酵液pH值保持在5.5-6.0；当碳源消耗完毕时，搅拌转速降为60-80rpm，利用间歇流加的方式向发酵罐中补加含葡萄糖和腺苷的水溶液，整个发酵时间为200-280h。本发明通过控制发酵过程的pH值并及时补加能源和虫草素前体，使得发酵过程能够得以保持在最佳环境下，有利于菌体的生长，且有利于代谢流的迁移，所以最终虫草素产量可以达到10.0g/L，生产效率达到0.25g/L/d，工艺简单、环境污染小、操作方便、虫草素的产量高。