专利名称：一种提高灵芝漆酶产量的发酵方法漆酶(Iaccase)是一类含铜的多酚氧化酶(Eel. 10. 3. 2)，能够氧化多种酚和芳 胺类化合物，在废水处理、纸浆漂白、土壤净化、染料脱色、免疫检测等方面具有广泛的应用 [洪宇植等(2005)生物工程学报21 :547-552]，近年来成为国际酶工程学研究的一个热点。 漆酶广泛存在于植物、高等真菌、细菌和昆虫中，可从多种途径获得，但最有工业化生产前 景的是微生物发酵法。担子菌中的白腐菌是一类漆酶产量较高的微生物，其中灵芝 lucidum)作为一种重要的药用真菌，近年来人们对其漆酶生产开展了较为广泛的研究。但 目前包括灵芝在内的高等真菌漆酶的生产因其产量较低，通常需要芳香类化合物或等重金 属离子的诱导[Xiao YZ et al (2004) Mycologia 96:26-35]。这些诱导物一般都具有毒 性，且难于降解，添加后使发酵液处理成本增高，还易造成环境污染。近年来，人们一直在寻 求新的高效漆酶生产方法，并取得一定成果，如固态发酵和漆酶基因的异源表达。固态发酵 技术能够缓解漆酶生产的环境污染问题，但发酵周期太长，不适合工业化发酵生产需要；漆 酶基因的异源表达的产量往往也低于野生菌[Hong YZ et al (2006) FEMS Microbiol Lett 258:96-101]，这都限制了漆酶的工业化生产。真菌诱导子是来源于真菌的一种特定的化学信号物质，具有诱导植物细胞中防卫 基因表达、诱发植物过敏反应和促进植物细胞中特定次生代谢产物的合成等多种功能。利 用真菌诱导子激活植物细胞中的次生代谢途径已成为提高植物细胞培养物中目标产物产 量的有效手段之一[郭文娟等(2007)，中国药学杂志42 (5):321-324]。近年来，利用真菌 诱导子处理植物培养细胞以促使细胞快速、大量合成目的次生代谢物质已成为人们普遍重 视的新方法。然而，将真菌诱导子用于灵芝液体发酵培养以提高漆酶产量的研究目前尚未 见报道。
本发明的目的在于克服上述已有技术的不足而提供一种工艺简单、成本低廉、效 果显著，利用真菌诱导子提高灵芝漆酶产量的发酵方法，本方法可用于灵芝漆酶的工业化 生产。本发明的目的可以通过如下技术方案来实现一种提高灵芝漆酶产量的发酵方 法，包括以下步骤(1)真菌诱导子的制备将真菌诱导子菌种接种于PD液体培养基(用于丝状真菌的培养和保藏。去皮马铃薯 200g,葡萄糖20g，马铃薯切块后煮沸20-30分钟，过滤收集上清溶液，加入葡萄糖，加水补充体积到1L，121°C灭菌20分钟)，在25 30°C条件下、10(Tl80 r/min摇床中培养5 7天后， 过滤得到菌丝体，采用酸解法制备真菌诱导子，具体方法如下取菌体40g (湿重)，用0. 1 mol/L乙酸钠(pH5. 6)悬浮菌体，转至组织勻浆器中勻浆lOmin，再加入120mL乙酸乙酯搅拌 均勻后静置24h。混合物经减压抽虑后，菌体加入IOOmL去离子水，用盐酸调pH值至2. 0， 然后121°C灭菌Ih后，再进行减压抽虑，滤液用0. 5 mol/L的氢氧化钠调pH至5. 8，得到真 菌诱导子。(2)灵芝种子液制备将灵芝菌种接种到PD液体发酵培养基中进行发酵培养，培养条件为摇床转速10(Γ180 r/min，温度25 30°C，时间5、天，得到灵芝种子液。(3)真菌诱导子对灵芝细胞的诱导培养将上述获得的灵芝种子液转入到新鲜PD液体培养基中，继续振荡培养，在灵芝细胞液 体发酵培养第广5天，加入真菌诱导子，使真菌诱导子浓度达到4(Γ200 μ g/mL,然后继续培 养5、天，过滤得发酵液。(4)制备漆酶将所获得的灵芝发酵液多次过滤，取上清液，即得漆酶粗酶液。所述的真菌诱导子菌种为枝顶孢属真菌顶头孢UcreMwi s trie turn),菌种编 号CGMCC No. 3. 2058 ；或木霉属真菌木素木霉(viride),菌种编号为CGMCC No. 3. 2196 ；或木霉属真菌木素木霉(Trichoderma viride)，菌种编号为CGMCC No. 3. 4423，购自中国微生物菌种保藏管理委员会，普通微生物中心。所述的发酵用灵芝菌种可选用泰山赤灵芝A/ciifo )，菌种编号为 CGMCC No. 5. 644 ；或京大灵芝(fe/ oi/e’/7 a Λ/cii/腫)菌种编号为 CGMCC No. 5. 533 ；或信 州灵芝Λ/cii/腫)菌种编号为CGMCC No. 5.534。灵芝菌种均购自中国微生物 菌种保藏管理委员会，普通微生物中心。灵芝细胞生长阶段包括细胞生长延迟期、对数生长期、平稳期和衰亡期，所述的真 菌诱导子对灵芝诱导培养步骤中，在对数生长后期加入真菌诱导子。所述的步骤(3)中真菌诱导子于灵芝发酵培养的第1天加入，然后继续培养。所述的步骤(3)中真菌诱导子于灵芝发酵培养的第3天加入，然后继续培养。所述的步骤(3)中真菌诱导子于灵芝发酵培养的第5天加入，然后继续培养。本发明同已有技术相比有如下积极效果
1.本发明将真菌诱导子用于灵芝漆酶的液体发酵生产，大幅度提高灵芝漆酶产量，使 产量达到1068. 4 U/L，具有很好的工业化应用前景。2.本发明所述真菌诱导子菌株来源广泛，大多食用菌病原真菌制备的诱导子，均 具有很好的诱导效果，诱导子制备方法简便，重复性好。3.本发明所采用的灵芝液体发酵工艺简单，环保无毒，原材料成本低廉，更为重要 的是整个发酵过程可控，不受外部环境条件限制，非常适合工业化生产。

下面对本发明的
作详细说明 实施例1 菌种真菌诱导子菌种为枝顶孢属真菌顶头孢siricto )，由中国微生物 菌种保藏管理委员会，普通微生物中心购买，菌种编号为CGMCC No. 3.2058。灵芝菌种为泰山赤灵芝A/ciifo )，由中国微生物菌种保藏管理委员 会，普通微生物中心购买，菌种编号为CGMCC No. 5. 644。一种提高灵芝漆酶产量的发酵方法，具体步骤为 (1)真菌诱导子的制备
将真菌诱导子菌种接种于PD液体培养基(用于丝状真菌的培养和保藏。去皮马铃薯 200g,葡萄糖20g，马铃薯切块后煮沸20-30分钟，过滤收集上清溶液，加入葡萄糖，加水补 充体积到1L，121°C灭菌20分钟)中，接种量为5%，于25°C、100r/min摇床中培养7天后，过 滤得到菌丝体，采用酸解法制备真菌诱导子，具体方法如下取菌体40g(湿重)，用0. 1 mol/ L乙酸钠(pH5. 6)悬浮菌体，转至组织勻浆器中勻浆lOmin，再加入120mL乙酸乙酯搅拌均 勻后静置24h。混合物经减压抽虑后，菌体加入IOOmL去离子水，用盐酸调pH值至2. 0，然 后121°C灭菌Ih后，再进行减压抽虑，滤液用0. 5 mol/L的氢氧化钠调pH至5. 8，得到真菌 诱导子。(2)灵芝种子液制备
将所获得的灵芝发酵液多次过滤，取上清液，即得漆酶粗酶液。将灵芝菌种接种于PD 液体发酵培养基中进行发酵培养，接种量为2%，摇床转速100 r/min，温度25°C，时间8天。(3)真菌诱导子对灵芝细胞的诱导培养
将上述获得的灵芝种子液转入到新鲜PD液体培养基中，继续振荡培养，在灵芝细胞液 体发酵培养第1天，加入真菌诱导子，使真菌诱导子浓度达到40 μ g/mL，然后继续培养7天， 过滤得发酵液。(4)灵芝漆酶的提取和检测
将发酵液经多层纱布过滤，4000 r/min离心15 min，取上清液，即得漆酶粗酶液，漆酶 活力测定采用愈创木酚法进行，具体方法如下制备反应混合液(含50 mmol/L琥珀酸钠缓 冲液(pH 4. 5)，4 mmol/L愈创木酚和0. 5 mL粗酶液)，然后30°C反应30 min后，用紫外可 见分光光度计于465 nm处测定吸光值，以酶液事先灭活后的反应混合液(含50 mmol/L琥 珀酸钠缓冲液(pH 4. 5)，4 mmol/L愈创木酚和0. 5 mL粗酶液)为对照。酶活力单位定义 每分钟使0D465值改变0. 01为一个酶活单位(U/mL)。测得漆酶产量为783. 4 U/L (如表1 所示)。表1.不同处理条件下灵芝漆酶产量
处理接种量诱导子浓度(μ g/mL)酶活(U/L)实验组2%40783. 42对照组2%0363. 42
实施例2 菌种同实施例1。一种提高灵芝漆酶产量的发酵方法，具体步骤为 (1)真菌诱导子的制备
将真菌诱导子菌种接种于PD液体培养基中，接种量为5%，于25°C、150r/min摇床中培 养7天后，过滤得到菌丝体，采用酸解法(同实施例1)制备真菌诱导子。(2)灵芝种子液制备
5将所获得的灵芝发酵液多次过滤，取上清液，即得漆酶粗酶液。将灵芝菌种接种于PD 液体发酵培养基中进行发酵培养，接种量为3%，摇床转速150 r/min，温度25°C，时间8天。(3)真菌诱导子对灵芝细胞的诱导培养
将上述获得的灵芝种子液转入到新鲜PD液体培养基中，继续振荡培养，在灵芝细胞液 体发酵培养第3天，加入真菌诱导子，使真菌诱导子浓度达到80 μ g/mL，然后继续培养5天， 过滤得发酵液。(4)灵芝漆酶的提取和检测
将发酵液经多层纱布过滤，4000 r/min离心15 min，取上清液，即得漆酶粗酶液，漆酶 活力测定采用愈创木酚法进行(同实施例1)，测得漆酶产量为878. 2 U/L (如表2所示)。
表2.不同处理条件下灵芝漆酶产量
实施例3 菌种同实施例1。一种提高灵芝漆酶产量的发酵方法，具体步骤为 (1)真菌诱导子的制备
将真菌诱导子菌种接种于PD液体培养基中，接种量为5%，于25°c、150r/min摇床中培 养7天后，过滤得到菌丝体，采用酸解法(同实施例1)制备真菌诱导子。(2)灵芝种子液制备
将所获得的灵芝发酵液多次过滤，取上清液，即得漆酶粗酶液。将灵芝菌种接种于PD 液体发酵培养基中进行发酵培养，接种量为5%，摇床转速150 r/min，温度25°C，时间8天。(3)真菌诱导子对灵芝细胞的诱导培养
将上述获得的灵芝种子液转入到新鲜PD液体培养基中，继续振荡培养，在灵芝细胞液 体发酵培养第5天，加入真菌诱导子，使真菌诱导子浓度达到120 μ g/mL,然后继续培养3 天，过滤得发酵液。(4)灵芝漆酶的提取和检测
将发酵液经多层纱布过滤，4000 r/min离心15 min，取上清液，即得漆酶粗酶液，漆酶 活力测定采用愈创木酚法(同实施例1)进行，测得漆酶产量为1068.4 U/L (如表3所示)。
表3.不同处理条件下灵芝漆酶产量
本发明真菌诱导子菌种还可采用其他同类菌种，灵芝菌种也可采用其他普通栽培品种。


本发明涉及了一种提高灵芝漆酶产量的发酵方法。该技术是利用灵芝细胞的液体培养，通过在细胞生长的适宜阶段，加入真菌诱导子，诱导一定时间后，可显著提高灵芝漆酶产量，真菌诱导子诱导5-8天后，可使灵芝漆酶酶活最高达到1068.4U/L，是对照组的2.2倍。本发明可以快速、大规模地利用灵芝发酵方法生产漆酶，所生产的漆酶可用于废水处理、纸浆漂白、土壤净化、染料脱色、免疫检测等方面，本方法工艺简单、成本低、效果显著，灵芝漆酶产量高，是一种极具工业化前景的生产方法。