真菌漆酶的发酵生产方法及漆酶的应用的制作方法【技术领域】，特别是涉及一种工业用漆酶的制备方法，确切地说是一种白腐真菌在5L规模发酵罐中培养发酵生产漆酶的方法及所述方法制备的漆酶制剂在纸浆漂白中的应用。 [0002]漆酶(Laccase，EC.1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，与植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物血浆中的铜蓝蛋白同属于铜蓝氧化酶家族。近十几年来，真菌漆酶，尤其是白腐菌漆酶的功能和应用已经引起了越来越多的研究者的关注，由于它具有较高的氧化还原电势，作用底物范围非常广泛，能催化氧化多种酚和芳胺类化合物，在某些小分子氧化还原介体存在的条件下，还能够氧化木质素中的非酚型结构，因此白腐菌漆酶在制浆造纸工业中的纸浆漂白和废水处理等领域中具有巨大的研究价值和工业化应用潜力。但是白腐菌漆酶在上述领域中的成功应用，目前需要解决的一个关键性问题是如何在控制成本的前提下提高漆酶的产量。优化发酵条件以提高白腐菌产酶能力并降低生产和应用成本是一种最基本也是最常用的研究思路。Borras等学者研究了白腐菌Trametes versicolor在麦芽汁半合成培养基中，对酸性染料兰纳洒脱灰脱色过程中的成本控制问题，发现培养基原料的费用占脱色总成本的比例高达95%，而通过优化培养条件，选用低价的无麦芽汁合成培养基，能够将脱色成本降低96%,并且脱色效果不变(Borras E, Blanquez P, SarraM, et al.Trametes versicolor pellets production:low-cost medium and scale-up.Biochemical Engineering Journal, 2008,42:61-66)。白腐菌漆酶高效生产的另一种思路是寻找合适的载体进行漆酶基因的异源表达，但是由于白腐菌漆酶中糖基的存在能够促使漆酶蛋白的水解，因此相对于其它一些已实现工业化生产的氧化还原酶来说，如通过丝状真菌的基因重组生产的葡萄糖氧化酶，白腐菌漆酶在活性宿主上的异源高效表达还较为困难，总体上还处于探索阶段，难以满足漆酶工业化生产和应用的要求。因此目前关于漆酶生产的研究主要还是集中于优化白腐菌的发酵条件上。[0003]白腐菌Panus conchatus是一株分泌漆酶的担子真菌,其木质纤维素降解酶系具有较高的脱木素选择性，其中漆酶是其最主要的木质素降解酶，在摇瓶液体发酵中表现出较高的漆酶产量，具有较高的研究和应用潜力。该白腐菌漆酶在纸浆漂白和废水处理等领域中的成功应用，不仅要提高漆酶的产量，降低其生产成本，还要依赖于成熟的工业化发酵技术，而其中发酵罐规模生产是该白腐菌漆酶从实验室研究向工业化生产过渡的关键环节和必经之路。酵罐规模的微生物液体培养通常称为深层发酵(Submerged fermentation,SmF),机械搅拌式发酵罐(Stirred tank reactor, STR)是目前最常用的深层发酵设备，已经形成标准化的通用设备，适合于大多数微生物的培养发酵过程。它结构简单，不需要特殊设备，利用机械搅拌器的作用，使菌体、发酵液、空气和热量等充分混合，促进物料的均匀分布和氧气的溶解，以保证供给微生物生长繁殖和代谢所需的营养、温度和溶解氧等。但是这种发酵罐用于白腐菌的培养发酵时，还存在一些不利因素，主要表现在罐体中白腐菌菌体的生长不易控制，菌丝的无序扩张会提高发酵液的粘稠度，并且缠绕在搅拌叶轮上，堵塞管路，严重影响物料、热量和氧气的均匀传递。虽然可以通过提高搅拌转速改善上述问题，但是过高的转速会导致菌丝受到的剪切力增大，抑制细胞繁殖代谢和漆酶的分泌，甚至导致细胞破裂，进而导致漆酶产量低、酶活低。[0004]目前，关于白腐菌漆酶成熟的大规模发酵工艺的报道还很少，并且始终没有解决生产的成本问题，这主要是因为发酵罐中存在着与摇瓶发酵完全不同的动力、热量、物料以及氧气等的传递特性，白腐菌的生产不易控制。因此，开发适应漆酶大规模生产的白腐菌菌种，改良已有发酵罐生产工艺和开发新型发酵设备，简化发酵工艺，降低生产成本，以扩大化白腐菌漆酶的生产，已经成为漆酶生产领域活跃的研究热点。
[0005]本发明主要解决的技术问题是提供一种真菌漆酶的发酵生方法及漆酶的应用，不仅发酵液后续处理简便、生产成本低廉，而且发酵获得的白腐菌漆酶活力在200IU/mL以上,与国内外其他发酵罐规模的漆酶生产方法相比,漆酶总产量和酶活力都达到了较高的水平，制得的漆酶制剂具有良好的纸浆漂白效果。[0006]为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是:提供一种真菌漆酶的发酵生产方法，所述方法包括以下步骤:
[0007]I)将真菌接种于种子培养基上培养2~4天，培养液经无菌纱布过滤后得到的菌丝体用无菌水洗净，再将菌丝体高速打散约10秒后收集于无菌水中制成菌种悬浮液，所述真菌为白腐菌Panus conchatus ；
[0008]2)将所述菌种悬浮液接种于含3~5L发酵培养基的发酵罐中培养10~15天后，得到发酵液；
[0009]3)将所述发酵液过滤或离心后获得漆酶制剂。
[0010]其中，所述种子培养基每升含20%~30%马铃薯浸出液、10~50g葡萄糖、I~IOg 蛋白胨、3gKH2P04、3gMgS04.7H20。
[0011]其中，所述发酵培养基为每升种子培养基中加入5~20g天然底物和I~5mmol诱导剂。
[0012]其中，所述天然底物为茶叶、稻草、麦草、花生壳、麦麸、豆柏、蔗渣、桔皮、玉米杆粉中的一种或两种以上。
[0013]优选地，所述天然底物为麦麸。
[0014]其中，所述诱导剂为黎芦醇、愈创木酚、二甲苯胺、阿魏酸、丁香醛、单宁酸、香草酸、香豆酸、硫酸铜中的一种或两种以上。
[0015]优选地，所述诱导剂为硫酸铜。
[0016]其中，所述步骤I)中的培养温度为28°C、转速为120~180rpm。
[0017]其中，所述步骤2)中的培养温度为28V~40°C，搅拌速度为150~300rpm。
[0018]本发明中，漆酶活力的测定以2，2-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸(ABTS)为底物(ε 42(| = 3.6X IO4IT1 ^cnT1)，用等体积的0.5mmol/LABTS溶液和粗酶液反应，测定反应前3min内420nm处吸光值的增加量，定义每分钟使I μ mo I ABTS转化所需要的酶量为I个漆酶活力单位(IU)。[0019]本发明还涉及通过所述方法获得的漆酶制剂在纸浆漂白中的应用。
[0020]本发明的有益效果是:区别于现有酵罐发酵生产的白腐菌漆酶产量低、酶活力低、生产成本高的情况，本发明将白腐菌漆酶的生产由摇瓶扩大到5L发酵罐，生产规模扩大约100倍，不仅发酵液后续处理简便、生产成本低廉，而且发酵获得的白腐菌漆酶活力在200IU/mL以上，与国内外其他发酵罐规模的漆酶生产方法相比，漆酶总产量和酶活力都达到了较高的水平。此外，制得的漆酶制剂用于纸浆漂白时具有良好的漂白效果。

[0021]下面结合实施例对本发明进行详细说明。
[0022]本发明中，白腐菌Panus conchatus由华南理工大学制衆造纸工程国家重点实验
室提供。
[0023]实施例1
[0024]马铃薯浸出液的制备:称取300g新鲜马铃薯，去皮切片后于1000mL去离子水中煮沸30min,冷却后用纱布过滤,滤液用去离子水定容至1000mL。
[0025]PDA培养基:每升马铃薯浸出液中加入无水葡萄糖20g，琼脂20g。
[0026]种子培养基:每升马铃薯浸出液中加入无水葡萄糖20g，蛋白胨lg，KH2PO4 3g，MgSO4.7H20 3g。
[0027]发酵培养基:每升种子培养基中加入经粉碎的麦麸10g，发酵专用消泡剂0.2mL,硫酸铜3mmol。
[0028]1、菌种悬浮液的制备`
[0029]将白腐菌Panus conchatus由PDA斜面培养基转接入装有50mL种子培养基的300mL三角瓶中，在摇床中150rpm、28 °C震荡培养3d后，培养液经无菌纱布过滤，菌丝体用无菌水洗净并在高速打碎杯中打散约IOs,收集于无菌水中制成菌种悬浮液备用。
[0030]2、发酵罐产酶
[0031]将制备好的菌种悬浮液于无菌条件下接种入装有发酵培养基的发酵罐中，发酵罐装液量3L，接种量500mL。本发明采用的发酵罐为5L全自动机械搅拌式发酵罐，其各项运行参数可以通过与之相联的数字式控制器调节。接种后控制机械搅拌转速为150rpm，发酵一段时间后，由于菌丝体大量繁殖，发酵液粘稠度显著增大，因此将搅拌转速提高至300rpm以促进物料的均匀分布。培养液温度通过循环冷凝水维持在28°C，同时向发酵罐中通入空气以维持发酵液的溶氧度，通气量为l.0Lpm，总发酵时间为15天。发酵培养基中加入的生物发酵专用消泡剂可以避免菌体代谢和机械搅拌产生的泡沫对管路的堵塞。
[0032]发酵后测定酶活,漆酶活力高达200IU/mL以上。
[0033]3、漆酶制剂的获得
[0034]发酵液经纱布过滤除去菌丝体和麦麸残渣后，4°C下5000r/min冷冻离心15min，分离除去细小颗粒物质，收集上清液即得工业用漆酶制剂。
[0035]漆酶制剂用于纸浆漂白
[0036]1、漂白工艺条件:
[0037]漆酶处理(L):纸浆(浆浓10 % )在0.5MPa氧压下，在50°C和ρΗ5.0的缓冲溶液中，加入2.0IU/g本实施例获得的漆酶(对绝干楽；)及I %的硝基腐殖酸(nitrohumicacid, NHA)(介体)，在带电动搅拌的高压釜中处理2h，洗净。
[0038]氧脱木素(O):氧脱木素是在带电动搅拌的高压釜中进行。条件为:浆浓10%，MgSO4 用量 0.5%，NaOH 用量 2.0%，氧压为 0.7MPa，时间 60min。
[0039]螯合处理(Q):浆浓10%,1.0% EDTA, ρΗ3.0，温度 70。。，时间 60min。
[0040]过氧化氢漂白(P):浆浓10 %，H2O2 2.0%, Na0H2.0 %，MgSO40.05 %。，温度 90 °C，时间4h。
[0041]2、漂白效果:获苇浆经过用量1.0IU/g(对绝干浆)的漆酶处理(L)，Kappa值降低17.8%，白度下降3.4% IS0，粘度变化较小，再经QP漂白后，白度达72.5% IS0，较QP浆白度增加3.3% IS0，粘度1250ml/g，比荻苇QP浆粘度高113mL/g。荻苇OLQP浆，白度达83.2% IS0，比OQP浆白度升高8.2% ISO。Kappa值显著下降，而粘度下降不多。
[0042]实施例2
[0043]马铃薯浸出液的制备:称取300g新鲜马铃薯，去皮切片后于1000mL去离子水中煮沸30min,冷却后用纱布过滤,滤液用去离子水定容至1000mL。
[0044]PDA培养基:每升马铃薯浸出液中加入无水葡萄糖20g，琼脂20g。
[0045]种子培养基:每升马 铃薯浸出液中加入无水葡萄糖10g，蛋白胨10g，KH2PO4 3g，MgSO4.7H203g。
[0046]发酵培养基:每升种子培养基中加入经粉碎的花生壳20g，发酵专用消泡剂0.2mL,黎芦醇 5mmol。
[0047]1、菌种悬浮液的制备
[0048]将白腐菌Panus conchatus由PDA斜面培养基转接入装有50mL种子培养基的300mL三角瓶中，在摇床中150rpm、28 °C震荡培养3d后，培养液经无菌纱布过滤，菌丝体用无菌水洗净并在高速打碎杯中打散约IOs,收集于无菌水中制成菌种悬浮液备用。
[0049]2、发酵罐产酶
[0050]将制备好的菌种悬浮液于无菌条件下接种入装有发酵培养基的发酵罐中，发酵罐装液量3L，接种量500mL。本发明采用的发酵罐为5L全自动机械搅拌式发酵罐，其各项运行参数可以通过与之相联的数字式控制器调节。接种后控制机械搅拌转速为150rpm，发酵一段时间后，由于菌丝体大量繁殖，发酵液粘稠度显著增大，因此将搅拌转速提高至300rpm以促进物料的均匀分布。培养液温度通过循环冷凝水维持在28°C，同时向发酵罐中通入空气以维持发酵液的溶氧度，通气量为l.0Lpm，总发酵时间为10天。发酵培养基中加入的生物发酵专用消泡剂可以避免菌体代谢和机械搅拌产生的泡沫对管路的堵塞。
[0051]发酵后测定酶活,漆酶活力高达200IU/mL以上。
[0052]3、漆酶制剂的获得
[0053]发酵液经纱布过滤除去菌丝体和花生壳残渣后，4 °C下5000r/min冷冻离心15min,分离除去细小颗粒物质，收集上清液即得工业用漆酶制剂。
[0054]漆酶制剂用于纸浆漂白
[0055]1、漂白工艺条件:
[0056]漆酶处理(L):纸浆(浆浓10 % )在0.5MPa氧压下，在50°C和ρΗ5.0的缓冲溶液中，加入2.0IU/g本实施例获得的漆酶(对绝干楽；)及I %的硝基腐殖酸(nitrohumicacid, NHA)(介体)，在带电动搅拌的高压釜中处理2h，洗净。[0057]氧脱木素(O):氧脱木素是在带电动搅拌的高压釜中进行。条件为:浆浓10%，MgSO4 用量 0.5%，NaOH 用量 2.0%，氧压为 0.7MPa，时间 60min。
[0058]螯合处理(Q):浆浓10%,1.0% EDTA, ρΗ3.0，温度 70。。，时间 60min。
[0059]过氧化氢漂白(P):浆浓10%，H2O2 2.0%,NaOH 2.0%,MgSO40.05%。，温度 90°C，时间4h。
[0060]2、漂白效果:麦草浆经过用量2.0IU/g的漆酶处理(L) ,Kappa值降低8.7%，白度下降1% IS0，粘度变化较小，再经QP漂白后，白度74.6% IS0，较QP浆白度增加1.9% ISO,粘度比QP浆下降一点。氧脱木素麦草浆经过用量2.0IU/g的漆酶处理，Kappa值、粘度下降。OLQP浆，白度达81.8% ISO,比OQP浆白度升高2.0% ISO。
[0061]实施例3
[0062]马铃著浸出液的制备:称取200g新鲜马铃薯，去皮切片后于1000mL去离子水中煮沸30min,冷却后用纱布过滤,滤液用去离子水定容至1000mL。
[0063]PDA培养基:每升马铃薯浸出液中加入无水葡萄糖20g，琼脂20g。
[0064]种子培养基:每升马铃薯浸出液中加入无水葡萄糖50g，蛋白胨lg，KH2P043g,MgSO4.7H203g。
[0065]发酵培养基:每升种子培养基中加入经粉碎的豆柏5g，发酵专用消泡剂0.2mL，愈创木酌.Immol ο
[0066]1、菌种悬浮液的制备
[0067]将白腐菌Panus conchatus由PDA斜面培养基转接入装有50mL种子培养基的300mL三角瓶中，在摇床中180rpm、28°C震荡培养2d后，培养液经无菌纱布过滤，菌丝体用无菌水洗净并在高速打碎杯中打散约IOs,收集于无菌水中制成菌种悬浮液备用。
[0068]2、发酵罐产酶
[0069]将制备好的菌种悬浮液于无菌条件下接种入装有发酵培养基的发酵罐中，发酵罐装液量4L，接种量500mL。本发明采用的发酵罐为5L全自动机械搅拌式发酵罐，其各项运行参数可以通过与之相联的数字式控制器调节。接种后控制机械搅拌转速为150rpm，发酵一段时间后，由于菌丝体大量繁殖，发酵液粘稠度显著增大，因此将搅拌转速提高至250rpm以促进物料的均匀分布。培养液温度通过循环冷凝水维持在30°C，同时向发酵罐中通入空气以维持发酵液的溶氧度，通气量为l.0Lpm，总发酵时间为11天。发酵培养基中加入的生物发酵专用消泡剂可以避免菌体代谢和机械搅拌产生的泡沫对管路的堵塞。
[0070]发酵后测定酶活,漆酶活力高达200IU/mL以上。
[0071]3、漆酶制剂的获得
[0072]发酵液经纱布过滤除去菌丝体和豆柏残渣后，4°C下5000r/min冷冻离心15min，分离除去细小颗粒物质，收集上清液即得工业用漆酶制剂。
[0073]漆酶制剂用于纸浆漂白
[0074]1、漂白工艺条件:
[0075]漆酶处理(L):纸浆(浆浓10 % )在0.5MPa氧压下，在50°C和ρΗ5.0的缓冲溶液中，加入2.0IU/g本实施例获得的漆酶(对绝干楽；)及I %的硝基腐殖酸(nitrohumicacid, NHA)(介体)，在带电动搅拌的高压釜中处理2h，洗净。
[0076]氧脱木素(0):氧脱木素是在带电动搅拌的高压釜中进行。条件为:浆浓10%，MgSO4 用量 0.5%，NaOH 用量 2.0%，氧压为 0.7MPa，时间 60min。
[0077]螯合处理(Q):浆浓10%,1.0% EDTA, ρΗ3.0，温度 70。。，时间 60min。
[0078]过氧化氢漂白(P):浆浓10 %，H2O2 2.0%, Na0H2.0 %，MgSO40.05 %。，温度 90 °C，时间4h。
[0079]2、漂白效果:芦苇浆经过用量1.0IU/g的漆酶处理，Kappa值降低17.8%，白度下降2.2% IS0，粘度变化不大，再经QP漂白后，白度达74.7% IS0，较QP浆白度增加3.4%ISO,粘度1250ml/g，比QP浆高。氧脱木素芦苇浆经过用量2.0IU/g的漆酶处理，Kappa值、粘度下降。OLQP浆，白度达84.1 % IS0，比OQP漂白浆的白度高6.8% IS0，而粘度仅下降65mL/g。
[0080]实施例4
[0081]马铃薯浸出液的制备:称取280g新鲜马铃薯，去皮切片后于1000mL去离子水中煮沸30min,冷却后用纱布过滤,滤液用去离子水定容至1000mL。
[0082]PDA培养基:每升马铃薯浸出液中加入无水葡萄糖20g，琼脂20g。
[0083]种子培养基:每升马铃薯浸出液中加入无水葡萄糖20g，蛋白胨8g，KH2PO4 3g，MgSO4.7H203g。
[0084]发酵培养基:每升种子培养基中加入经粉碎的稻草15g，发酵专用消泡剂0.2mL,阿魏酸2mmol。
[0085]1、菌种悬浮液的制备
·[0086]将白腐菌Panus conchatus由PDA斜面培养基转接入装有50mL种子培养基的300mL三角瓶中，在摇床中120rpm、28 °C震荡培养4d后，培养液经无菌纱布过滤，菌丝体用无菌水洗净并在高速打碎杯中打散约IOs,收集于无菌水中制成菌种悬浮液备用。
[0087]2、发酵罐产酶
[0088]将制备好的菌种悬浮液于无菌条件下接种入装有发酵培养基的发酵罐中，发酵罐装液量5L，接种量500mL。本发明采用的发酵罐为5L全自动机械搅拌式发酵罐，其各项运行参数可以通过与之相联的数字式控制器调节。接种后控制机械搅拌转速为150rpm，发酵一段时间后，由于菌丝体大量繁殖，发酵液粘稠度显著增大，因此将搅拌转速提高至200rpm以促进物料的均匀分布。培养液温度通过循环冷凝水维持在35°C，同时向发酵罐中通入空气以维持发酵液的溶氧度，通气量为l.0Lpm，总发酵时间为12天。发酵培养基中加入的生物发酵专用消泡剂可以避免菌体代谢和机械搅拌产生的泡沫对管路的堵塞。
[0089]发酵后测定酶活,漆酶活力高达200IU/mL以上。
[0090]3、漆酶制剂的获得
[0091]发酵液经纱布过滤除去菌丝体和稻草残渣后，4°C下5000r/min冷冻离心15min，分离除去细小颗粒物质，收集上清液即得工业用漆酶制剂。
[0092]漆酶制剂用于纸浆漂白
[0093]1、漂白工艺条件:
[0094]漆酶处理(L):纸浆(浆浓10 % )在0.5MPa氧压下，在50°C和ρΗ5.0的缓冲溶液中，加入2.0IU/g本实施例获得的漆酶(对绝干楽；)及I %的硝基腐殖酸(nitrohumicacid, NHA)(介体)，在带电动搅拌的高压釜中处理2h，洗净。
[0095]氧脱木素(0):氧脱木素是在带电动搅拌的高压釜中进行。条件为:浆浓10%，MgSO4 用量 0.5%，NaOH 用量 2.0%，氧压为 0.7MPa，时间 60min。
[0096]螯合处理(Q):浆浓10%,1.0% EDTA, ρΗ3.0，温度 70。。，时间 60min。
[0097]过氧化氢漂白(P):浆浓10%，Η2022.0%，NaOH 2.0%，MgSO40.05%。，温度 90°C，时间4h。
[0098]2、漂白效果:桉木硫酸盐浆经过氧脱木素(O)，然后用量2.0IU/g(对绝干浆)的漆酶处理(L)，再经QP漂白，纸浆白度可以达到85% IS0，纸浆的黏度下降很少。
[0099]实施例5
[0100]马铃薯浸出液的制备:称取250g新鲜马铃薯，去皮切片后于1000mL去离子水中煮沸30min,冷却后用纱布过滤,滤液用去离子水定容至1000mL。
[0101]PDA培养基:每升马铃薯浸出液中加入无水葡萄糖20g，琼脂20g。
[0102]种子培养基:每升马铃薯浸出液中加入无水葡萄糖30g，蛋白胨6g，KH2PO4 3g，MgSO4.7H203g。
[0103]发酵培养基:每升种子培养基中加入经粉碎的蔗渣10g，发酵专用消泡剂0.2mL,丁香醒 3mmol0 [0104]1、菌种悬浮液的制备
[0105]将白腐菌Panus conchatus由PDA斜面培养基转接入装有50mL种子培养基的300mL三角瓶中，在摇床中140rpm、28°C震荡培养3d后，培养液经无菌纱布过滤，菌丝体用无菌水洗净并在高速打碎杯中打散约IOs,收集于无菌水中制成菌种悬浮液备用。
[0106]2、发酵罐产酶
[0107]将制备好的菌种悬浮液于无菌条件下接种入装有发酵培养基的发酵罐中，发酵罐装液量3L，接种量500mL。本发明采用的发酵罐为5L全自动机械搅拌式发酵罐，其各项运行参数可以通过与之相联的数字式控制器调节。接种后控制机械搅拌转速为150rpm，发酵一段时间后，由于菌丝体大量繁殖，发酵液粘稠度显著增大，因此将搅拌转速提高至300rpm以促进物料的均匀分布。培养液温度通过循环冷凝水维持在40°C，同时向发酵罐中通入空气以维持发酵液的溶氧度，通气量为l.0Lpm，总发酵时间为13天。发酵培养基中加入的生物发酵专用消泡剂可以避免菌体代谢和机械搅拌产生的泡沫对管路的堵塞。
[0108]发酵后测定酶活,漆酶活力高达200IU/mL以上。
[0109]3、漆酶制剂的获得
[0110]发酵液经纱布过滤除去菌丝体和蔗渣后，4°C下5000r/min冷冻离心15min，分离除去细小颗粒物质，收集上清液即得工业用漆酶制剂。
[0111]漆酶制剂用于纸浆漂白
[0112]1、漂白工艺条件:
[0113]漆酶处理(L):纸浆(浆浓10% )在0.5MPa氧压下，在50°C和ρΗ5.0的缓冲溶液中，加入2.0IU/g本实施例获得的漆酶(对绝干楽；)及I %的硝基腐殖酸(nitrohumicacid, NHA)(介体)，在带电动搅拌的高压釜中处理2h，洗净。
[0114]氧脱木素(0):氧脱木素是在带电动搅拌的高压釜中进行。条件为:浆浓10%，MgSO4 用量 0.5%，NaOH 用量 2.0%，氧压为 0.7MPa，时间 60min。
[0115]螯合处理(Q):浆浓10%，l.0%EDTA，pH3.0，温度7(rC，时间60min。
[0116]过氧化氢漂白(P):浆浓10 %，H2O2 2.0%, Na0H2.0 %，MgSO40.05 %。，温度 90 °C，时间4h。
[0117]2、漂白效果:马尾松浆经过氧脱木素(0)，然后用量2.0IU/g(对绝干浆)的漆酶处理(L)，再经QP漂白，纸浆白度可以达到83% IS0，纸浆的黏度下降很少。
[0118]实施例6[0119]马铃薯浸出液的制备:称取220g新鲜马铃薯，去皮切片后于1000mL去离子水中煮沸30min,冷却后用纱布过滤,滤液用去离子水定容至1000mL。
[0120]PDA培养基:每升马铃薯浸出液中加入无水葡萄糖20g，琼脂20g。
[0121]种子培养基:每升马铃薯浸出液中加入无水葡萄糖40g，蛋白胨4g，KH2PO4 3g，MgSO4.7H203g。
[0122]发酵培养基:每升种子培养基中加入经粉碎的玉米杆18g，发酵专用消泡剂
0.2mL,香草酸 4mmol。
[0123]1、菌种悬浮液的制备
[0124]将白腐菌Panus conchatus由PDA斜面培养基转接入装有50mL种子培养基的300mL三角瓶中，在摇床中160rpm、28°C震荡培养3d后，培养液经无菌纱布过滤，菌丝体用无菌水洗净并在高速打碎杯中打散约IOs,收集于无菌水中制成菌种悬浮液备用。
[0125]2、发酵罐产酶
[0126]将制备好的菌种悬浮液于无菌条件下接种入装有发酵培养基的发酵罐中，发酵罐装液量3L，接种量500mL。本发明采用的发酵罐为5L全自动机械搅拌式发酵罐，其各项运行参数可以通过与之相联的数字式控制器调节。接种后控制机械搅拌转速为150rpm，发酵一段时间后，由于菌丝体大量繁殖，发酵液粘稠度显著增大，因此将搅拌转速提高至280rpm以促进物料的均匀分布。培养液温度通过循环冷凝水维持在37°C，同时向发酵罐中通入空气以维持发酵液的溶氧度，通气量为l.0Lpm，总发酵时间为14天。发酵培养基中加入的生物发酵专用消泡剂可以避免菌体代谢和机械搅拌产生的泡沫对管路的堵塞。
[0127]发酵后测定酶活,漆酶活力高达200IU/mL以上。
[0128]3、漆酶制剂的获得
[0129]发酵液经纱布过滤除去菌丝体和玉米杆残渣后，4 °C下5000r/min冷冻离心15min,分离除去细小颗粒物质，收集上清液即得工业用漆酶制剂。
[0130]漆酶制剂用于纸浆漂白
[0131]1、漂白工艺条件:
[0132]漆酶处理(L):纸浆(浆浓10% )在0.5MPa氧压下，在50°C和ρΗ5.0的缓冲溶液中，加入2.0IU/g本实施例获得的漆酶(对绝干楽；)及I %的硝基腐殖酸(nitrohumicacid, NHA)(介体)，在带电动搅拌的高压釜中处理2h，洗净。
[0133]氧脱木素(0):氧脱木素是在带电动搅拌的高压釜中进行。条件为:浆浓10%，MgSO4 用量 0.5%，NaOH 用量 2.0%，氧压为 0.7MPa，时间 60min。
[0134]螯合处理(Q):浆浓10%,1.0% EDTA, ρΗ3.0，温度 70。。，时间 60min。
[0135]过氧化氢漂白(P):浆浓10 %，H2O2 2.0%, Na0H2.0 %，MgSO40.05 %。，温度 90 °C，时间4h。
[0136]2、漂白效果:竹浆经过氧脱木素(0)，然后用量2.0IU/g(对绝干浆)的漆酶处理(L)，再经QP漂白，纸浆白度可以达到82 % ISO,纸浆的黏度下降。[0137]本领域技术人员不脱离本发明的实质和精神， 可以有多种变形方案实现本发明，以上所述仅为本发明较佳可行的实施例而已，并非因此局限本发明的权利范围。此外，应当理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。