一种低pH值胁迫提高ε-聚赖氨酸产量的方法 【技术领域】 [0001]本发明涉及一种低pH值胁迫提高ε -聚赖氨酸产量的方法，属于发酵工程【技术领域】。 [0002]ε -聚赖氨酸(ε -poly-L-lysine, ε -PL)是一种微生物合成分泌的L-赖氨酸同聚物，由25-35个L-赖氨酸残基通过α -羧基与ε -氨基的脱水缩合作用聚合而成。ε-PL具有水溶性好、热稳定性高、可食用、可降解以及对人和环境无毒害等优点。另外，ε-PL还具有广泛的抑菌谱，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌和霉菌等都具有良好的抑制作用。因此，ε-PL作为一种优良的生物食品防腐剂，已相继被日本、韩国以及美国和欧洲等国家和地区批准其在食品加工业中使用。2014年4月，我国食品安全国家标准也批准ε-PL作为食品防腐剂被允许使用。除此之外，作为一种多阳离子生物聚合物，ε-PL还被广泛应用于医药、环境和电子等工业领域。由此可见，ε-PL是一种具有多种用途的重要工业生物技术产品，具有巨大潜在商业价值。 [0003]当前，ε-PL生产仅限于利用链霉菌通过液态好氧发酵技术实现。因此，选育高产菌和优化发酵过程就成为提高ε-PL发酵水平的主要途径。基于菌体生长和产物合成需要不同最适PH原则，由Kahar et al.最早提出了两阶段pH值调控方法:发酵周期的前48h维持PH值> 5.0 (阶段I )，48h后维持pH值4.0左右(阶段II )，这种pH值先高后低控制方法结合碳氮源流加技术，实现Streptomyces albulus S410的ε -PL最高产量达到48.3g/Lo近年来，发明人以最高ε -PL比合成速率为调控目标，提出了新的两阶段pH值调控方法:发酵前36h维持pH值3.5 (阶段I )，36h后维持pH值3.8 (阶段II )，这种pH值先低后高的调控策略，最终实现Streptomyces sp.M-Z18的补料-分批发酵ε-PL产量达到30.Hg/L。对比两个pH值调控方法可以发现，它们之间存在明显差异:(I)出发点不同，前者为菌体生长和产物合成分别提供最适PH环境，后者是为了实现产物最大比合成速率；(2) pH值控制策略不同，前者阶段I控制的PH值较阶段II高，而后者阶段I控制的pH值较阶段II低。 [0004]尽管前面的研宄工作成功的通过采用pH调控的方法提高了 ε -PL的产量，但是却没有采用极端低PH环境胁迫的方法来提高ε-PL产量。本发明通过极端低pH值胁迫进一步促进ε-PL产量的提高。


[0005]本发明的目的是通过在ε -PL发酵前期引入极端的酸性pH值胁迫，以提高ε -PL产量。本发明在发酵前期人为或自发地使发酵液PH值从起始7.0下降至2.5—3.0，维持一段时间后，将PH上调至3.5-4.5，维持稳定直到发酵结束。
[0006]在本发明的一种实施方式中，在ε -PL发酵开始后，先让发酵液pH自发下降至5.0左右，并控制pH在5.0左右直至菌体量倍增，然后人为或自然地使pH降为2.5-3.0，并维持12-48h，随后将pH调为3.5-4.5并保持稳定直到发酵结束。
[0007]本发明的一种实施方式主要包括以下步骤:(1)将ε -PL产生菌链霉菌的种子液接种到以甘油和/或葡萄糖为碳源的发酵培养基中，通过发酵罐进行培养；(2)当pH从起始的7.0自发下降至5.0时，通过碱溶液将pH维持在5.0-6.0，直至菌体干重倍增；(3)在菌体量倍增后，人为或自然地使pH降至2.5-3.0，并维持12-48h，随后通过流加碱溶液将pH调为3.5-4.5并保持稳定，直到发酵结束。
[0008]本发明的另一种实施方式主要包括以下步骤:(I)将保藏的ε -PL产生菌链霉菌属孢子，接种到M3G培养基中，30°C培养24h作为种子液；⑵将种子液以8%的接种量接种到以甘油和/或葡萄糖为碳源的发酵培养基中，通过发酵罐进行培养；(3)当pH从起始7.0自发下降至5.0时，通过蠕动泵自动添加碱溶液将pH维持在5.0-6.0，直到菌体干重倍增；
(4)在菌体量倍增后，人为或自然地使pH降为2.5-3.0，并维持12-48h，随后通过流加碱溶液将PH调为3.5-4.5并保持稳定，直到分批或补料-分批发酵结束。
[0009]在本发明的一种实施方式中，所述的ε-PL生产菌还可以是芽孢杆菌属ε-PL产生菌。
[0010]在本发明的一种实施方式中，ε -PL的其他发酵条件为:发酵温度30_37°C，通气量为0.5-2vvm，搅拌转速为200-800rpmo
[0011]在本发明的一种实施方式中，调节pH的所述的碱溶液为2-4mol/LNaOH或12.5% -25%氨水。
[0012]在本发明的一种实施方式中，所述的发酵罐为搅拌式或气升式发酵罐，并且发酵罐体积不限。
[0013]在本发明的一种实施方式中，所述发酵是分批发酵或补料-分批发酵。
[0014]在本发明的一种实施方式中，所述的补料-分批发酵包括流加甘油、葡萄糖或二者混合物以及硫酸铵溶液。
[0015]本发明与已有技术相比具有以下优点:
[0016](I)操作方式简单:仅依靠发酵过程中菌体自发或人为流加酸碱溶液进行pH值调节，便于工业推广和应用。(2)显著提高ε-PL产量:相比于普通的两阶段pH调控策略，ε -PL产量能够显著提高50%以上，且能够显著降低后提取成本，增加经济效益。


[0017]发酵培养基参见文献Culture medium containing glucose and glycerol asa mixed carbon source improves ε-poly-L-lysine product1n by Streptomycessp.M-Z18.B1process B1syst Eng 2012Mar，35(3):469 - 475。
[0018]实施例1两阶段pH控制策略
[0019]在5L发酵罐中装3.26L发酵培养基进行分批发酵，将0.24L培养24h的种子液接种到发酵培养基中，PH值调至6.8-7.5开始发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为200-800rpm，通气量控制为0.5_2vvm，溶氧控制在30%左右；在发酵过程中当pH自发降为5.0时，自动流加氨水或NaOH溶液将pH维持在5.0直到菌体量倍增，后使pH自发下降到
4.0，并通过自动流加氨水或NaOH溶液将pH维持在设定值，直到碳源消耗完毕，发酵结束。最终，实现ε -PL产量和菌体量分别为7.83和26.89g/L，ε -PL产率为6.12g/L/d。
[0020]若当发酵液中残留的甘油或葡萄糖浓度降为10g/L时，自动流加灭菌后的纯甘油或500g/L的葡萄糖溶液，使其在发酵液中的浓度控制在10g/L左右；当发酵液中NH/-N浓度降到lg/L时，自动流加灭菌后的600g/L的硫酸铵溶液，使其浓度维持在lg/L。发酵192h后，ε -PL产量和菌体量分别为35.87和64.02g/L，ε -PL产率为4.48g/L/d。。
[0021]实施例2先降后升两阶段pH控制策略
[0022]在5L发酵罐中装3.26L发酵培养基进行分批发酵，将0.24L培养24h的种子液接种到发酵培养基中，PH调到6.8-7.5开始发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为200-800rpm，通气量控制为0.5_2vvm，溶氧控制在30% ;当发酵pH值自发降为3.5时(约20h)，自动流加氨水或NaOH溶液将此pH维持稳定，直至36h，后将pH上调到3.8，并自动流加氨水或NaOH溶液将此pH维持稳定，直到碳源消耗完毕，发酵结束。最终，实现ε -PL产量和菌体量分别为8.59和27.21g/L，ε -PL产率为6.42g/L/d。
[0023]若当发酵液中残留的甘油或葡萄糖浓度降为10g/L时，自动流加灭菌后的纯甘油或500g/L的葡萄糖溶液，使其在发酵液中的浓度控制在10g/L左右；当发酵液中NH/-N浓度降到lg/L时，自动流加灭菌后的600g/L的硫酸铵溶液，使其浓度维持在lg/L。发酵176h后，ε-PL产量和菌体量分别为35.24和43.05g/L，ε-PL产率为4.81g/L/d。
[0024]实施例3
[0025]在5L发酵罐中装3.26L发酵培养基进行分批发酵，将0.24L培养24h的种子液接种到发酵培养基中，PH调到6.8-7.5开始发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为200-800rpm，通气量控制为0.5-2vvm，溶氧控制在30 % ;发酵进行到20h，人为将pH降为2.5并维持12h，随后将pH上调到3.5，并自动流加氨水将pH维持在设定值，直到葡萄糖消耗完毕，发酵结束。最终，实现ε -PL产量和菌体量分别为10.39和30.61g/L，ε -PL产率为 7.12g/L/do
[0026]实施例4
[0027]在5L发酵罐中装3.26L发酵培养基进行分批发酵，将0.24L培养24h的种子液接种到发酵培养基中，PH调到6.8-7.5开始发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为200-800rpm，通气量控制为0.5-2vvm，溶氧控制在30%;当发酵pH值自发降为5.0时，自动流加NaOH溶液将pH维持在5.0直到菌体量倍增，后人为将pH降为2.5并维持12h，随后将pH上调到3.5，并自动流加氨水将pH维持在设定值，直到葡萄糖消耗完毕，发酵结束。最终，实现ε -PL产量和菌体量分别为10.21和28.36g/L，ε -PL产率为8.63g/L/d。
[0028]实施例5
[0029]在5L发酵罐中装3.26L发酵培养基进行分批发酵，将0.24L培养24h的种子液接种到发酵培养基中，PH调到6.8-7.5开始发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为200-800rpm，通气量控制为0.5-2vvm，溶氧控制在30 % ;在发酵过程中当pH自发降为5.0时，自动流加氨水将pH维持在5.0直到菌体量倍增，后使pH自发下降到3.0，并维持48h，随后将PH上调到4.5，并自动流加NaOH溶液将pH维持在设定值，直到甘油消耗完毕，发酵结束。最终，实现ε -PL产量和菌体量分别为9.65和23.90g/L，ε -PL产率为7.94g/L/d。
[0030]实施例6
[0031]在5L发酵罐中装3.26L发酵培养基进行分批发酵，将0.24L培养24h的种子液接种到发酵培养基中，PH调到6.8-7.5开始发酵。在发酵过程中，搅拌转速控制为200-800rpm，通气量控制为0.5-2vvm，溶氧控制在30 % ;在发酵过程中当pH自发降为5.0时，自动流加氨水或NaOH溶液将pH维持在5.0直到菌体量倍增，人为将pH值降为3.0并维持24h，后将pH上调到4.5，并自动流加氨水或NaOH溶液将pH维持在设定值。当发酵液中残留的甘油或葡萄糖浓度降为10g/L时，自动流加灭菌后的纯甘油或500g/L的葡萄糖溶液，使其在发酵液中的浓度控制在10g/L左右；当发酵液中NH4+-N浓度降到lg/L时，自动流加灭菌后的600g/L的硫酸铵溶液，使其浓度维持在lg/L。发酵192h后，ε -PL产量达到54.70g/L，相比于两阶段pH控制策略分别提高52.50% (实施例1)和55.22% (实施例2) ； ε-PL产率为6.84g/L/d，相比于两阶段pH控制策略分别提高52.68% (实施例1)和42.20% (实施例 2) ο
[0032]虽然本发明以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。