专利名称：用于靶向细胞和组织的光触发纳米颗粒的制作方法与药物治疗相关的主要阻碍是在将治疗剂运送至机体特定位点时必然产生非特异性毒性，或者治疗无效。随着纳米技术的进步，药物递送研究着重关注于开发利用靶向部分修饰纳米颗粒表面的技术，这种技术使得纳米颗粒特异性地识别并结合患病细胞和组织的独特属性并因而提高靶向效率。这样的靶向物通常包括抗体、肽或适配体，它们在细胞上的结合位点有特异性受体、通道分子或细胞膜上存在的另一些分子。最近的研究已成功地证实经改造之纳米颗粒选择性靶向至肿瘤，并且这种靶向系统的可行性已经临床证实。为改造这种靶向系统，如果纳米颗粒系统能够克服循环细胞与靶细胞之间通路上的两个主要障碍，则其将更加有效。第一个障碍是纳米载体不能有效地穿透构成血管的内皮细胞从而离开血管系统。在设计用于治疗癌症的靶向系统中，研究人员利用了患病区域中的渗漏血管，其使得纳米颗粒能够容易地穿透并渗透至患病细胞。第二个障碍是寻找患病细胞上独特表达的膜蛋白以及设计能够用作靶向物的特异性配体。由于许多疾病不会向研究人员提供具有纳米颗粒能够容易地离开循环系统之渗漏血管的有利条件，或者细胞不具有可用作靶标的已知独特生物标志物，因此迫切需要寻找并研究新方法以使得负载治疗剂的纳米颗粒靶向患病组织和器官。发明概要在一个方面中，本发明涉及发现用于将试剂/物质递送至靶位点的组合物，其中提供了包含与靶向部分连接之递送部分的组合物。相应地，本发明的一个方面涉及包含多个颗粒的组合物，每个颗粒包含待递送至个体的有效量的物质，其中通过利用光可去除之保护基团进行封闭(caging)而失活的靶向配体与颗粒表面相连，其中通过照射组合物使保护基团去除来活化无活性配体，并且其中活性配体能够与抗配体(anti-liand)结合。根据本发明的一些方面，提供了将物质靶向递送至个体中预定细胞或组织的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向有此需要的个体施用包含含有待递送至个体之有效量物质的颗粒的组合物，其中通过利用光可去除之保护基团进行封闭而失活的靶向配体与颗粒表面相连，以及选择性地照射个体中的预定细胞或组织从而通过去除保护基团而使经照射的预定细胞或组织中的无活性配体活化，其中活性配体能够与所连接的颗粒一起与预定细胞或组织上存在的抗配体相结合，从而将物质靶向递送至个体中。根据本发明的一些方面，提供了将物质靶向递送至个体中预定细胞或组织的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向有此需要的个体施用包含含有待递送至个体之有效量物质的颗粒的组合物，其中通过利用光可去除之保护基团进行封闭而失活的靶向肽与颗粒表面相连，以及选择性地照射个体中的预定细胞或组织从而通过去除保护基团而使经照射的预定细胞或组织中的无活性肽活化，其中活性肽能够与所连接的颗粒一起与预定细胞或组织上存在的整合素结合，从而将物质靶向递送至个体中。根据本发明的一些方面，提供了包含多个颗粒的组合物。在一些实施方案中，每个颗粒能够携带待递送至个体中的有效量的物质，其中通过利用光可去除之保护基团进行封闭而失活的靶向配体与颗粒表面相连，其中通过照射组合物以去除保护基团来活化无 活性配体，并且其中活性配体能够与抗配体结合。[10]除非另有指明，以下实施方案等同地应用于本文所述的本发明各方面中。[11]在一些实施方案中，所述配体包括肽、抗体和/或适配体。在一些实施方案中，所述肽包含RGD或HGSR (SEQ ID NO I)氨基酸基序。在一些实施方案中，光可去除的保护基团选自2-硝基节基、安息香酯(benzoin ester)、N-酰基-7_nitindoline、间苯酹(meta-phenol)、苯乙酮(phenacyl)及其衍生物。在一些实施方案中，所述光可去除的保护基团是4，5-二甲氧基-2-硝基苄基(DMNB)或其衍生物。在一些实施方案中，光可去除的保护基团与配体共价连接。在一些实施方案中，两种或更多种不同的靶向配体与颗粒表面相连。在一些实施方案中，至少一种祀向配体是组织特异性的。在一些实施方案中，祀向配体是细胞类型特异性的。在一些实施方案中，所述细胞类型选自HUVEC、MSC、成纤维细胞、心肌细胞和人胚胎干细胞(hESC)。[12]应当理解，本文中涉及颗粒时使用的“有效量”是当向对象施用包含多个颗粒的组合物时足以在对象中实现期望医疗效果的量。在一些实施方案中，如果单个颗粒中的量足以具备期望效果，则单个颗粒可以是有效的。然而，通常地，向对象施用多个颗粒，每种颗粒的有效量是基于本文详述的所施用颗粒数量和施用频率，提供足以在对象中实现期望结果之总累积剂量的量。[13]本发明的每种限定条件(limitation)均可涵盖本发明的多个实施方案。因此预期，涉及任一要素或要素组合的本发明之每种限定条件均可包括于本发明的每个方面中。本发明可包括另一些实施方案，并且能够以多种方式实践或实施。此外，本文中使用的短语和术语是出于描述性目的，不应将其看作是限制性的。本文中使用的“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变体意在包括下文中所列项目及其等同物以及另外的项目。[14]通过参考“发明详述”，本发明的这些和另一些方面以及多种优点和应用将是明显的。应理解，本发明的每个方面均可包括多个实施方案。[15]本申请中提及的所有文献均作为整体通过引用并入本文。

[16]附图不旨在按比例绘制。在附图中，不同附图中图示的每个相同或几乎相同的组分由同样的数字表示。出于清楚的目的，并非对每幅图中的每个组分均进行标记。[17]图I示意本发明的非限制性实施方案。纳米颗粒表面上的非特异性(靶向每种细胞类型)靶向物被封闭从而变为非功能性的。光照后，封闭基团被释放，靶向物被活化，并且纳米颗粒可以与光照处的任何组织结合。[18]图2示出包含HGSR(SEQ ID NO 1)基序的失活肽(A图)和活化肽(B图)的非限制性实施方案。使用4，5- 二甲氧基-2-硝基苄基(DMNB)封闭GGGGYIGSR-NH2 (SEQ
ID N02)肽。光照后，封闭基团被释放，靶向物变活化。[19]图3显示未经封闭之靶向物(A图)、未经光照之封闭靶向物(B图)和光照后10秒(C图)的HPLC柱中保留时间的非限制性实施方案。未经封闭之靶向物在HPLC柱中的保留时间为 20分钟(图3A)，而未经照射之封闭靶向物的保留时间为 30分钟(图3B)。光照后10秒，保留时间发生位移，靶向物在 20分钟后离开柱(图3C)。[20]图4显示封闭基团从与靶向物缀合之纳米颗粒中释放的非限制性实施方案。图4A跟踪通过FTIR评估的靶向物上醚键的消失，而图4B跟踪光照后释放到介质中的游离DMNB封闭基团。[21]图5A和5B是在经光照和未经光照的培养物中定量评估HUVEC靶向的非限制性实施方案。颗粒显示为白色。图5C和分别是被靶向之MSC和HUVEC的百分数。[22]图6显示某些经封闭纳米颗粒的非限制性图像。利用I-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)活化化学法将具有胺末端的经封闭肽/靶向物缀合至具有羧基末端的聚苯乙烯纳米颗粒(328±2nm)表面。[23]图7显示靶向HUVEC的非限制性实施方案。图7A是已在340nm下照射I分钟的小区域(箭头所示)中特异性粘附于细胞的荧光纳米颗粒在UV照射下的宏观视图。图7B是所照射区域中细胞的显微视图，而图7C是距离Icm处细胞的显微视图。使用β肌动蛋白的抗体对细胞质染色，使用Hoechst对细胞核染色。在图7Β中，纳米颗粒显示为白色斑点。发明详述[24]本发明的一些方面涉及用于将试剂/物质递送至靶位点的组合物，其中提供了包括与靶向部分连接之递送部分的组合物。递送部分可以是含有待递送之试剂/物质的颗粒。靶向部分可以是可通过如下机制可逆性失活的靶向配体，所述机制使得向个体施用
组合物后靶向配体在原位被活化。可通过使用一种或更多种光敏性、热敏性、压力敏感性和/或pH敏感性的修饰、微波敏感性、X-射线敏感性修饰和/或对一种或更多种其它输入(例如一种或更多种其它形式的能量输入)敏感的一种或更多种修饰来实现靶向配体的可逆性失活。本发明的一些方面允许使用可用于选择性靶向目的区域的组织特异性和非特异性配体。在一些实施方案中，活化的靶向配体与(例如细胞表面上的)靶分子(抗配体)结合，从而使组合物连接和/或聚集于抗配体(和/或其上存在抗配体的细胞或组织)附近。[25]在一些实施方案中，本发明至少部分地基于如下新型颗粒系统，其可以在光照射后选择性地靶向并结合任何组织，并具有在任何期望位点释放诊断性和/或治疗性物质/试剂的潜力(图I)。第一种组分是能够携带诊断性和/或治疗性负载(例如，成像化合物、药物、生长因子、细胞因子等)的“颗粒/载体”。目前，通常使用天然和合成的聚合物和脂质作为药物递送载体。[26]该系统中的第二种组分包括“诊断性和/或治疗性物质/试剂”。颗粒可负载有一系列物质，包括药物、生长因子、趋化因子和成像分子。载体可用于通过携带药物于其内部以及当与靶标结合时将其聚集和/或控制释放从而增加局部药物浓度。[27]该系统中的第三种组分是“靶向配体”。在一些实施方案中，靶向配体通过用光可去除的保护基团封闭而失活。在一些实施方案中，失活的配体是经封闭的大分子(例如一种或更多种经封闭的肽、抗体、适配体、受体和/或抗原)。使用封闭技术目的在于可通过用光可去除的保护基团进行化学修饰而使得靶向配体暂时性地不具有生物功能(或“被封闭”)。可以利用照射使保护基团从配体表面释放，并恢复其与(例如目的细胞上的)抗配体连接的能力。在一些实施方案中，抗配体是配体的天然结合伴侣。例如，抗配体可以是细胞上的表面受体，靶向配体是受体的天然配体(或其一部分)。相应地，靶向配体可以是细胞表面分子(例如蛋白质或其它细胞表面分子)的天然结合伴侣(或其结合片段)。然 而，应当理解，在一些实施方案中，配体可以是与细胞表面分子(抗配体)结合的合成分子(例如合成的肽、核酸或其它合成分子)。应当理解，被靶向的抗配体可以是天然的分子。在一些实施方案中，被靶向的抗配体可以是细胞或组织特异性的(例如偏好性地或独特地存在于特定细胞或组织上)。在某些实施方案中，抗配体可以天然存在于两种或更多种细胞或组织类型上(例如，非细胞或组织特异性地)。在一些实施方案中，抗配体可以特异性针对特定情形(例如疾病状态，例如与疾病(例如癌症)相关的变体分子)。在一些实施方案中，抗配体可以是受体、通道蛋白、糖蛋白、蛋白聚糖、粘附分子或任何其它细胞表面分子。在一些实施方案中，抗配体可以是间隙连接蛋白(例如连接蛋白(connecin)43)、通道(例如离子通道和/或ATP通道)蛋白、粘附分子(例如⑶31 (VECAM)、N-钙粘素、VE钙粘素和/或E-钙粘素)、糖蛋白(例如CD44和/或CD133)、受体(例如VEGFR2和/或血管紧张素)以及蛋白聚糖(例如硫酸肝素和/或聚集蛋白聚糖)。[28]在一些实施方案中，本发明涉及包含多个颗粒的组合物，所述颗粒含有有效量的诊断性和/或治疗性物质。可以将通过封闭而失活的靶向配体与颗粒表面相连接。失活的配体可通过照射(例如，向对象(例如人对象)施用后原位照射)组合物使封闭基团去除而活化。在一些实施方案中，可使用其它形式的能量使已利用另一些技术进行封闭的配体活化。在一些实施方案中，颗粒不包含任何诊断性和/或治疗性物质。相应地，在一些实施方案中，可以提供与配体相连的颗粒以使其能够负载目的物质。在使颗粒负载前，可以对配体进行封闭或不进行封闭。[29]在一些实施方案中，本发明涉及利用上述组合物将物质靶向递送至预定细胞或组织的方法。在一些实施方案中，将两种或更多种靶向配体与颗粒表面相连。靶向配体可以是组织特异性或非特异性的。在一些实施方案中，靶向配体可以仅存在于特定细胞类型上。在一些实施方案中，抗配体可以是受体、通道蛋白、糖蛋白、蛋白聚糖、粘附分子或任何其它细胞表面分子。[30]本发明的一些方面可用于靶向递送药物，以及用于靶向不具有任何独特生物标志物的细胞。该技术赋予非特异性靶向配体以空间和时间特异性。本发明方法提供了目的分子向机体内任何组织的快速、定位释放。本发明的化合物和方法由于能利用聚焦光束(例如紫外光或红外光)或其它能量来源使经封闭之靶向配体活化将治疗性组合物递送至机体中分散的区域。例如，该方法可用于靶向递送至眼、皮肤和耳，还可用于在微创光纤技术或者能够穿透对象机体从而在目的区域(例如，邻近患病位点，例如肿瘤或其它癌性组织周围)中活化靶向配体的其它光学(例如近红外光)或其它活化技术的辅助下治疗其它内部器官。该方法还可用于与携带目的分子的经注射或经植入设备结合。后者具有多种潜在用途，例如解决向经植入药物递送系统再次负载药物成分、治疗受感染硬件(hardware)的问题等。[31]本发明的一些方面还可用于使药物运送穿过血脑屏障。本发明的组合物可以利用能够与血脑屏障处存在之特异性抗配体结合的靶向配体而产生。在一些实施方案中，靶向配体是转铁蛋白或胰岛素。在一些实施方案中，将组织非特异性靶向配体与组织特异性配体联合使用。[32]因此，本发明的一些方面可用于使治疗性、诊断性/成像和/或其它分子靶向至对象中的任何目的靶位点。例如，可以在对象体内任意位置的患病组织位点处选择性地使组合物活化。在一些实施方案中，靶标可以在患病(例如癌性)器官中或附近。在一些实施方案中，靶标可以是组织或器官的一部分。例如，组合物可以在肝、胰腺、肺、结肠、膀胱、 子宫颈、心脏、骨、肾、骨组织、肌肉组织或其一部分中或附近被活化。在一些实施方案中，可以靶向并活化(例如利用本文所述的光或其它能量来源)器官中或附近的血管组织或目的靶组织。应当理解，本发明的一些方面可用于多细胞生物体(例如脊椎动物、哺乳动物(例如人、畜牧或家养哺乳动物)或其它动物)的治疗或诊断(或者辅助治疗或诊断)。应当理解，本发明的组合物可以以任何合适的方式施用。在一些实施方案中，组合物可以通过注射、口服或另外的方式施用。在一些实施方案中，组合物可以通过静脉内、腹膜内或另外的方式施用。相应地，在一些实施方案中，组合物可以全身性提供。在一些实施方案中，组合物可以局部提供。应当理解，组合物可以在一个或更多个位置局部活化，或者在对象(例如需要诊断和/或治疗的患者)中更广泛地活化。[33]应当理解，可以向对象施用有效量的一种或更多种诊断剂和/或治疗剂。试剂的有效量是足以提供医疗理想结果的剂量，并且可以由本领域技术人员利用常规方法确定。在一些实施方案中，有效量是使接受治疗的病症得到任何程度之改善的量。在一些实施方案中，有效量可取决于接受治疗之疾病或病症的类型和程度和/或一种或更多种额外治疗剂的使用。然而，本领域技术人员能够确定要使用的治疗剂的合适剂量和范围，例如基于体外和/或体内测试和/或化合物剂量的其它知识来确定。类似地，诊断剂的有效量可以基于期望的诊断应用而确定。相应地，由于本文所述的试剂以颗粒形式施用，因此每种颗粒的有效量是在考虑了向对象施用之颗粒的数目和施用频率的情况下足以得到总有效量之试剂的量。[34]当向对象施用时，治疗剂的有效量将显然取决于接受治疗的特定疾病、疾病严重程度、个体患者的参数(包括年龄、身体状况、体型和体重)、同时进行的治疗、治疗频率以及施用模式。这些因素是本领域普通技术人员公知的，其仅需常规实验即可确定。在一些实施方案中，使用最大剂量，也就是根据合理医疗判断的最高安全剂量。类似地，诊断剂的有效量可取决于一个或更多个参数，包括对象的年龄、身体状况、体型、体重和其它医疗条件。[35]在一些实施方案中，针对一天或数天的一次或更多次给药施用(取决于施用模式的过程以及上述多种因素)，治疗剂或诊断剂的有效量通常为约O. OOlmg/kg至约1000mg/kg、约 O. 01mg/kg 至约 750mg/kg、约 O. lmg/kg 至约 500mg/kg、约 I. Omg/kg 至约250mg/kg、约10. Omg/kg至约150mg/kg。相应地,本文所述的颗粒(例如祀向颗粒)中待负载之试剂的有效量将取决于向对象施用的颗粒数目和颗粒施用频率。应当理解，本领域技术人员能够基于每个颗粒所负载的试剂量、每次给药向对象施用的颗粒数目以及施用频率来确定合适的治疗和/或诊断方案。在一些实施方案中，可以对这些参数中的每一个进行改变，以将期望(例如有效)量的试剂递送至对象(例如人对象)中。在一些实施方案中，单次给药中施用的颗粒数目可以为100 102°。[36]可以改变诊断剂或治疗剂的实际剂量水平(例如通过改变每个颗粒的量、施用频率、所施用颗粒的数目，或其组合)，以获得有效实现针对特定患者、组合物和施用模式的期望治疗响应的量。所选择的剂量水平取决于特定试剂的活性、施用途径、接受治疗的组织以及接受治疗之患者先前的病史。然而，本领域常规地以低于实现期望治疗效果所需的水平开始给药(例如使用多个颗粒进行给药)，并逐渐增加剂量直至实现期望的效果。 A.颗粒/载体[37]在本发明的某些实施方案中，本发明的“颗粒”包含生物相容性聚合物，其优选是生物可降解的。合适的聚合物包括但不限于乳酸乙醇酸共聚物、聚酐、乙烯醋酸乙烯酯、聚乙醇酸、壳聚糖、聚原酯(polyorthoester)、聚醚、聚乳酸和聚(β氨基酯)。还可以使用肽、蛋白质(例如胶原蛋白)和树状聚合物(例如PAMAM树状聚合物)。在本发明的某些实施方案中，使用聚(β氨基酯)化合物或者其盐或衍生物作为载体。载体可采用微粒、纳米颗粒、固体药物递送制品(solid drug delivery article)的形式和/或作为与核酸形成的可溶性纳米级复合物。[38]在本发明的某些实施方案中，颗粒可以是包含填充有或包封有治疗剂之固体材料(例如聚合基质)的药物递送装置。将该装置植入机体内靶组织位置处或其附近或者远离靶组织的位置处。光照射后，治疗剂从聚合基质中释放。可通过聚合基质的扩散、降解或者细胞摄入使治疗剂释放。[39]包含本发明之颗粒的聚合基质可采用多种不同的形状。例如，可使用不同大小的微粒(也可称为“珠”、“微珠”、“微球”、“纳米颗粒”、“纳米珠”、“纳米球”等)。聚合微粒及其在药物递送中的应用是本领域公知的。这种颗粒通常大致是球状的，但也可以具有不规则形状。一般地，微粒将具有500微米或更小的直径，例如50 500微米、20 50微米、I 20微米、I 10微米，而纳米颗粒将具有小于I微米的直径。如果颗粒的形状是不规则的，则其体积通常与微球或纳米球的体积相对应。可以使聚合基质形成多种非颗粒形状，例如薄片、盘状、杆状等，其可以具有不同大小和体积。将治疗剂掺入聚合基质的方法是本领域已知的。[40]可利用本领域已知的方法来制备固体纳米颗粒或微粒，包括但不限于喷雾干燥、相分离、单和复乳化-溶剂蒸发、溶剂提取以及单和复凝聚。某些方法包括喷雾干燥和复乳化方法。含有固体试剂的聚合组合物还可以利用造粒、挤出和/或滚圆(spheronization)来制备。本发明使用的纳米颗粒是本领域公知的，其包括Mallidi, S.等人，Nano Letters 2009,9, (8)，2825-31 ;Bagalkot, V.等人，Nano Lett 2007,7, (10),3065-70 以及 Farokhzad，0. C.等人，Proc Natl Acad Sci USA 2006，103，(16)，6315-20 中详细描述的那些。在一些实施方案中，纳米颗粒是脂质体。在一些实施方案中，纳米颗粒是具有羧基末端的聚苯乙烯纳米颗粒。在一些实施方案中，具有羧基末端的聚苯乙烯纳米颗粒具有328±2nm的直径(图6)。[41]可以改变制备微粒中使用的条件，以得到具有期望大小或特性(例如疏水性、亲水性、外部形态、“粘性”、形状等)的颗粒。制备颗粒的方法和所使用的条件(例如溶齐U、温度、浓度、空气流动速度等)还可以取决于所包封的试剂和/或聚合基质的组成。如果通过上述任何方法制备的颗粒具有在期望范围之外的大小范围，则可以改变颗粒的大小，例如利用筛或其它大小分离技术来实现。开发用于制备递送经包封试剂的方法描述于文献中。[42]固体聚合物-试剂组合物(例如盘、薄片、管、片层、杆等)可以利用本领域公知的多种方法中的任何方法制备。例如，当聚合物的熔点低于递送组合物时的温度和/或聚合物降解或变为具有不期望之反应性时的温度时，可以将聚合物熔化，与待递送的试剂混合，然后通过冷却使之固化。可通过溶剂浇铸来制备固体制品，其中将聚合物溶解于溶剂中，并将试剂溶解或分散于聚合物溶液中。随着溶剂的蒸发，物质保留于聚合基质中。该 方法一般需要聚合物可溶于有机溶剂并且试剂可溶于或可分散于该溶剂中。在另一些方法中，将聚合物粉末与试剂混合，然后压制以形成植入物。[43]许多可用的聚合物同时含有可带电荷的氨基基团(以允许与带负电荷的DNA磷酸基发生离子相互作用)和可降解区(例如可水解的酯键)。这些的实例包括聚(α-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸)、网格状聚氨基酯(network poly (amino ester))和聚(β -氨基酯)。这些络合剂可保护DNA免受例如核酸酶、血清组分等降解，并产生有助于穿过细胞疏水性膜(例如质膜、溶酶体膜、内含体膜、核膜)的带较少负电荷的表面。某些络合剂利于细胞内运输事件，例如内含体逃逸、胞质运输和入核，并可以与核酸解离。已提出，这样的试剂可用作内含体内的“质子海绵(proton sponge)”。B.诊断剂/治疗剂[44]可以将不同种类的“诊断剂和/或治疗剂”掺入颗粒中。本文中使用的“治疗(性)”是指试剂对患者具有有益作用。本文中使用的术语“治疗剂”与术语“药物”同义。合适的治疗剂包括但不限于抗肿瘤剂、激素、细胞因子、细胞毒素、抗微生物剂(抗真菌剂、抗病毒剂、抗原生动物剂)、抗生素、维生素、抗结核剂(antituberculars)、抗风湿剂(antirheumatics)、抗变态反应剂、循环系统药物、抗心绞痛剂、抗凝血剂、麻醉剂、强心苷、神经肌肉阻滞剂、镇静剂(催眠剂)以及局部和全身麻醉剂。[45]抗肿瘤剂包括但不限于钼化合物(例如螺钼、顺钼和卡钼)、氨甲喋呤、阿霉素(adriamycin)、丝裂霉素、安丝菌素(ansamitocin)、博来霉素(bleomycin)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、阿糖腺苷(arabinosyl adenine)、巯基多聚赖氨酸(mercaptopolylysine)、长春新碱(vincristine)、白消安(busulfan)、苯丁酸氮芥、美法仑(melphalan)(例如 PAM> L-PAM 或苯丙氨酸氮芥(phenylalanine mustard))、疏基嘌呤(mercaptopurine)、米托坦(mitotane)、盐酸甲基节餅(procarbazinehydrochloride)、放线菌素 D、盐酸柔红霉素(daunorubicin hydrochloride)、盐酸阿霉素(doxorubicin hydrochloride)、紫杉醇、丝裂霉素、普卡霉素(plicamycin)(光辉霉素(mithramycin))、氨鲁米特(aminoglutethimide)、雌莫司汀(estramustine)憐酸钠、氟他米特(flutamide)、醋酸亮丙瑞林(Ieuprolideacetate)、醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、朽1 樣酸他莫昔芬(tamoxifen citrate)、睾内酯酮(testolactone)、曲洛司坦(triIostane)、安吖唳(m_AMSA)、天冬酰胺酶(L-天冬酰胺酶)欧氏菌属天冬酰胺酶(Erwina asparaginase)、依托泊苷(etoposide) (VP-16)、干扰素 ct_2a、干扰素 a_2b、替尼泊苷(teniposide) (VM-26)、硫酸长春碱(VLB)、硫酸长春新碱、博来霉素、硫酸博来霉素、氨甲喋呤、阿霉素和阿糖(arabinosyl)。[46]激素的实例包括但不限于生长激素、黑色素细胞刺激激素、雌二醇、二丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate)、倍他米松(betamethasone)、醋酸倍他米松和倍他米松磷酸钠、维他米松磷酸氢二钠(vetamethasone disodium phosphate)、维他米松磷酸钠、醋酸可的松、地塞米松、醋酸地塞米松、地塞米松磷酸钠、氟尼缩松(fluni so I i de)、氢化可的松(hydrocortisone)、醋酸氢化可的松、环戊丙酸氢化可的松、氢化可的松磷酸钠、氢化可的松琥拍酸钠、甲泼尼龙(methylprednisolone)、醋酸甲泼尼龙、甲泼尼龙琥拍酸钠、醋酸帕拉米松(paramethasone acetate)、泼尼松龙(prednisolone)、醋酸泼尼松龙、 泼尼松龙磷酸钠、叔丁乙酸泼尼松龙、泼尼松(prednisone)、曲安西龙(triamcinolone)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、曲安西龙双醋酸酯、己曲安奈德(triamcinolonehexacetonide)以及醋酸氟氢可的松(fludrocortisone acetate)。[47]潜在可用的细胞因子包括但不限于淋巴因子、白介素、干扰素和趋化因子。[48]所涉及的细胞毒素的实例包括但不限于霍乱毒素、蓖麻毒素、LT-毒素、C3毒素、志贺毒素、百日咳毒素、破伤风毒素、皂苷、蒴莲根毒素(modeccin)、gelanin和肿瘤坏死因子。[49]抗微生物剂的非限制性实例包括抗病毒剂(例如阿昔洛韦(acyclovir)、叠氮胸苷金刚烧胺(AZT或齐多夫定(Zidovudine))、利巴韦林(ribavirin)和一水阿糖腺苷(阿糖腺苷，ara-A))、抗真菌剂(例如酮康唑(ketoconazole)、制霉菌素、灰黄霉素、氟胞喃唳(5-fc)、咪康唑(miconazole)、两性霉素B、蓖麻霉素和pMactam抗生素(例如磺胺泽辛(sulfazecin))、抗原生动物剂(例如氯喹、轻基氯喹、甲硝咕唑(metronidazole)、奎宁和铺酸葡胺(meglumine antimonate))以及生物应答修饰剂(例如胞壁酰二肽、胞壁酰三肽、微生物细胞壁组分)、淋巴因子(例如细菌内毒素，例如脂多糖、巨噬细胞活化因子)、细菌(例如分枝杆菌属(Mycobacteria)、棒状杆菌属(Corynebacteria))的亚基、合成的二肽N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺)。[50]抗生素包括但不限于二氨二苯砜(dapsone)、氯霉素、新霉素、氯氨苄青霉素(cefaclor)、头孢轻氨节(cefadroxil)、头孢氨节(cephalexin)、头孢拉定(cephradine)、红霉素、氯洁霉素(clindamycin)、洁霉素(Iincomycin)、轻氨节青霉素、氨节青霉素、氨节青霉素碳酯(bacampicillin)、羧节青霉素、双氯青霉素、环青霉素(cyclacillin)、picloxacillin、海他西林(hetacillin)、甲氧苯青霉素(methicillin)、乙氧萘胺青霉素(nafcillin)、苯甲异B惡唑青霉素(oxacillin)、青霉素G、青霉素V、替卡西林(ticarcillin)、利福平(rifampin)和四环素。[51]抗炎剂的实例包括但不限于二氟尼柳(diflunisal)、布洛芬(ibuprofen)、口引哚美辛(indomethacin)、甲氯灭酸盐(meclofenamate)、甲灭酸、萘普生(naproxen)、轻基保泰松(oxyphenbutazone)、苯基丁氮酮(phenylbutazone)、卩比罗昔康(piroxicam)、舒林酸(sulindac)、托美汀(tolmetin)、阿司匹林和水杨酸盐。[52]维生素的实例包括但不限于氰钴维生素(cyanocobalamin)neinoic acid、类维生素A及其衍生物(例如维生素A棕榈酸酯(retinol palmitate))以及α -生育酚。[53]抗结核剂的实例包括但不限于对氨基水杨酸、异烟肼(isoniazid)、硫酸卷曲霉素环丝氨酸、盐酸乙胺丁醇(ethambutol hydrochloride)乙硫异烟胺(ethionamide)、批嗪酰胺(pyrazinamide)、利福平和硫酸链霉素。[54]抗风湿剂的实例包括但不限于青霉胺。[55]抗变态反应剂的实例包括但不限于amelexanox ;抗凝血剂例如苯丙香豆醇(phenprocoumon)和月干素。[56]循环系统药物的实例包括但不限于心得安(propranolol)、代谢增效剂(例如谷胱甘肽)。 [57]抗心绞痛剂的实例包括但不限于地尔硫卓(diltiazem)、利心平(nifedipine)、异搏定(verapamil)、赤藓醇四硝酸酯(erythritol tetranitrate)、异山梨酸硝酸酯(isosorbide dinitrate)、硝化甘油(三硝酸甘油)和季戍四醇四硝酸酯(pentaerythritol tetranitrate)。[58]抗凝血剂的实例包括但不限于苯丙香豆醇、肝素。[59]麻醉剂的实例包括但不限于止痛剂、阿片类物质(例如可待因、海洛因、美沙酮、吗啡和鸦片)。[60]强心苷的实例包括但不限于去乙酰毛花苷(deslanoside)、毛地黄毒苷、地高辛、毛地黄苷和毛地黄。[61]神经肌肉阻滞剂的实例包括但不限于甲磺酸阿曲库胺(atracuriummesylate)、戈拉碘铵(gal lamine triethiodide)、己荷溴铵(hexaf luorenium bromide)、碘二甲箭毒(metocurine iodide)、泮库溴铵(pancuronium bromide)、琥拍酰胆碱氯化物(succinylcholine chloride)(氯化玻拍胆喊(suxamethonium chloride))、氯化管箭毒喊(tubocurarine chloride)和维库溴铵(vecuronium bromide)。[62]镇静剂(催眠剂)的实例包括但不限于异戍巴比妥(amobarbital)、异戍巴比妥钠、阿普比妥(aprobarbital)、仲丁比妥钠(butabarbital sodium)、水合氯醒(chloral hydrate)、氯乙基戍烯块醇(ethchlorvynol)、块己蚁胺(ethinamate)、盐酸氟安定(flurazepam hydrochloride)、苯乙哌唳酮(glutethimide)、盐酸甲氧异丁嗪(methotrimeprazine hydrochloride)、甲普里隆(methyprylon)、盐酸咪达唑仑(midazolam hydrochloride)、三聚乙醒(paraldehyde)、戍巴比妥(pentobarbital)、戍巴比妥钠、苯巴比妥钠(phenobartital sodium)、司可巴比妥钠(secobarbital sodium)、他布酮(talbutal)、替马西泮(temazepam)和三唑仑(triazolam)。[63]局部麻醉剂的实例包括但不限于盐酸布比卡因(bupivacainehydrochloride)、盐酸氣普鲁卡因(chloroprocaine hydrochloride)、盐酸依替卡因(etidocaine hydrochloride)、盐酸利多卡因(lidocaine hydrochloride)、盐酸马比佛卡因(mepivacaine hydrochloride)、盐酸普鲁卡因(procaine hydrochloride)和盐酸丁卡因(tetracaine hydrochloride)。全身麻醉剂的实例包括但不限于氟哌利多(droperidol)、依托咪酯(etomidate)、含氟哌利多的朽1檬酸芬太尼(fentanyl citratewith droperidol)、盐酸氯胺酮(ketamine hydrochloride)、美索比妥钠(methohexitalsodium)和戍硫代巴比妥钠(thiopental sodium)以及放射性粒子或离子(例如银、碘、铼和钇)。[64]另一些治疗剂包括遗传物质，例如天然或合成来源的核酸、RNA和DNA，包括重组RNA和DNA、反义RNA和DNA以及siRNA或其它小RNA。可使用的遗传物质类型包括例如表达载体(例如质粒、噬菌粒、粘粒、酵母人工染色体(YAC)以及缺陷型或“辅助”病毒)上携带的基因、抗基因(antigene)核酸、单链和双链RNA和DNA及其类似物(例如硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸)。此外，遗传物质可以例如与蛋白质或其它聚合物联合使用。[65]需要时,可以利用微球施加多于一种治疗剂。例如,单个微球可包含多于一种治疗剂，或者可以共施用含有不同治疗剂的多个微球。[66]本文中使用的“诊断剂”包括可用于诊断个体中疾病的任何试剂。非限制性 实例包括成像剂，例如放射性同位素、染料、色素和荧光分子(例如萤光素酶和荧光素)和重金属(例如钆)。[67]因此，应当理解，诊断剂或治疗剂可以是肽、蛋白质、核酸(DNA或RNA)、小分子或其任意组合。C.靶向配体[68]本文中使用的“靶向配体”包括如下任何类型的分子，即，对于该分子来说存在由于配体和抗配体之间接触时自由能的有利(即负向)变化而与该配体结合的另一种分子(例如“抗配体”)。配体和抗配体之间的结合可以是特异性的，其结合亲和力为微摩尔至皮摩尔范围。配体/抗配体对可以是抗原/抗体、酶/底物、DNA/DNA、DNA/RNA、RNA/RNA、核酸错配、互补性核酸以及核酸/蛋白质。应理解，任何分子均可作为配体或抗配体。在一些实施方案中，配体包括肽、抗体、适配体、受体或抗原。靶向配体可通过利用光可去除的保护基团、热敏性基团、压力敏感性基团、微波敏感性基团、PH敏感性基团或者在暴露于合适能量来源后能够被去除的任何其它基团封闭而失活。配体可以是组织特异性或非特异性的。在一些实施方案中，配体是组织非特异性的。[69]在一些实施方案中，靶向配体可以通过利用光可去除的保护基团封闭而失活。一般地，利用任何合适技术(例如利用光可去除的基团或任何其它合适基团)进行的封闭抑制或遮蔽了(例如通过破坏通常稳定与靶分子之间相互作用的键来实现，通过对配体的特定侧链的疏水性或离子特征进行修饰来实现，或者通过位阻来实现)对于生物学活性必需的重要属性(例如活性位点、折叠模式或其任意组合)。在一些实施方案中，靶向配体上封闭基团的存在将改变其构象，并因而将阻止细胞表面上的其抗配体对配体的识别。去除封闭基团使配体活化。靶向配体与颗粒表面共价连接。[70]在一些实施方案中，配体包括肽、抗体、适配体、受体或抗原。在一些实施方案中，配体是包含含有已知对于整合素-受体介导之细胞附着关键的基序的氨基酸序列的肽。因而，可以通过利用光可去除的保护基团(或其它可去除的基团)封闭而使肽相对于对应肽来说暂时性地无生物学功能。“失活肽”即上述的“肽”，其通过与光可去除的保护基团(或其它可去除的基团)连接而进行共价修饰(例如封闭)从而不具有生物学活性。“失活肽/颗粒加合物”包括与包含目的物质之颗粒的表面共价连接的“失活肽”。
[71]应当理解，在一些实施方案中，配体可以是与细胞表面分子(抗配体)结合的任何合适分子(例如肽)。细胞表面分子可以是蛋白受体或能够与特定配体(天然或合成的配体)结合的其它细胞表面蛋白。[72]在一些实施方案中，靶向配体可以特异性针对内皮细胞上存在的抗配体(例如内皮细胞上的表面抗原)。因此，靶向配体一经活化，所连接的颗粒便可与内皮细胞结合。在一些实施方案中，这使得血管中待活化的颗粒与血管壁中的内皮细胞结合。在一些实施方案中，与血管壁区域结合的颗粒可以穿过内皮层，并将试剂或其它物质递送至邻近血管区域的组织或器官。应当理解，内皮细胞上的抗配体可以是内皮特异性分子。然而，在一些实施方案中，其可以是存在于内皮细胞及其它细胞上的分子。根据本发明，可以通过在靶区域附近使配体活化，从而实现与血管壁上的靶区域结合。应当理解，在一些实施方案中，可以在靶区域上游的血管中使本发明组合物的靶向配体活化(例如通过光)(例如，由于血流将活化的组合物从活化区域运送至靶区域，因此，即使活化发生于靶区域上游，配体活化和结合的动力学也会使其在靶区域内结合)。[73]在一些实施方案中，抗配体可以是受体、通道蛋白、糖蛋白、蛋白聚糖、粘附分 子或任何其它细胞表面分子。在一些实施方案中，抗配体可以是间隙连接蛋白(例如连接蛋白43)、通道(例如离子通道和/或ATP通道)蛋白、粘附分子(例如⑶31 (VECAM)、N-钙粘素、VE钙粘素和/或E钙粘素)、糖蛋白(例如⑶44和/或⑶133)、受体(例如VEGFR2和/或血管紧张素)以及蛋白聚糖(例如硫酸肝素和/或聚集蛋白聚糖)。[74]在一些实施方案中，失活肽/颗粒加合物如下制备首先利用光可去除的保护基团对肽进行封闭，随后将经封闭的肽与颗粒共价连接。在另一些实施方案中，通过在第一步骤中使颗粒与肽共价连接、随后利用光可去除的保护基团对肽/颗粒加合物的肽部分进行封闭来制备失活肽/颗粒加合物。在又一些实施方案中，通过“一锅法(one-pot)”对肽、纳米颗粒与光可去除的保护基团进行单步反应，以制备失活肽/颗粒加合物。[75]在一些实施方案中，肽包含纤连蛋白的RGD基序。在另一些实施方案中，肽包含层粘连蛋白的YIGSR(SEQ ID NO 1)基序。在一些实施方案中，肽包含含有YIGSR的合成肽，例如CDPGYIGSR(SEQ ID NO 3)和/或HGSR-NH2 (SEQ ID NO :1)。本发明中使用的光可去除的保护基团是本领域公知的(Pillai, Organic Photochemistry,第9卷，A Padwa编，Marcel Dekker, Inc. ,New York, 1987, 225-323页)。合适的光可去除的保护基团的实例包括但不限于2-硝基苄基、安息香酯、N-酰基-7-nitindoline、间苯酚、苯乙酮及其衍生物。在一些实施方案中，光可去除的保护基团是2-硝基苄基衍生物，例如4，5- 二甲氧基-2-硝基苄基(DMNB)衍生物。[76]在一些实施方案中，肽的羟基(-0H)取代基与光可去除的保护基团发生反应。在另一些实施方案中，肽的氨基(-NH2 或-NH-)取代基与光可去除的保护基团发生反应。在一些实施方案中，肽的巯基(-SH)取代基与光可去除的保护基团发生反应。在另一些实施方案中，肽的羧酸(-CO2H)取代基或其衍生物(例如酯(-CO2-脂族)取代基)与光可去除的保护基团发生反应。[77]在一些实施方案中，与光可去除的保护基团发生反应的肽之羟基(-0H)取代基来自丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或羟脯氨酸的侧链。在另一些实施方案中，与光可去除的保护基团发生反应的肽之氨基(-NH2 或-NH-)取代基来自色氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸或鸟氨酸的侧链。在一些实施方案中，与光可去除的保护基团发生反应的肽之巯基(-SH)取代基来自半胱氨酸的侧链。在另一些实施方案中，与光可去除的保护基团发生反应的肽之羧酸(-CO2H)取代基或其衍生物(例如酯(-CO2-脂族)取代基)来自天冬氨酸或谷氨酸的侧链。[78]在一些实施方案中，肽或经封闭肽的氨基(-NH2或_NH_)取代基与纳米颗粒发生反应。在另一些实施方案中，肽或经封闭肽的羧酸(-CO2H)取代基或被保护的羧酸衍生性(-CO2-脂族)取代基与纳米颗粒发生反应。[79]在一些实施方案中，纳米颗粒的氨基(-NH2或_NH_)取代基与肽或经封闭肽发生反应。在另一些实施方案中，纳米颗粒的羧酸(-CO2H)取代基或被保护的羧酸衍生物(-CO2-脂族)取代基与肽或经封闭肽发生反应。[80]在一些实施方案中，本发明的肽、光可去除的保护基团和纳米颗粒根据本领域公知的合成方法共价连接，所述方法包括详细描述于Protecting Groups in OrganicSynthesis, T. ff. Greene 和 P.G.M.Wuts,第 3 版，John Wiley & Sons, 1999 ；Chemistry of Peptide Syntheis, N. N. Leo Benoiton, CRC Press, 2005 ；Smith 和 March March，sAdvanced Organic Chemistry,第 5 版，John Wiley & Sons, Inc. , New York, 2001 以及Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers,Inc. ,New York,1989中的那些，上述文献的全部内容通过弓I用并入本文。[81]在一些实施方案中，肽的侧链杂原子(0、N或S)与光可去除的保护基团的苄基位置共价连接。在一些实施方案中，肽的侧链杂原子(0、N或S)与硝基苄卤化衍生物(例如4，5- 二甲氧基-2-硝基苄氯或4，5- 二甲氧基-2-硝基苄溴)发生反应。[82]在一些实施方案中，本发明的肽或经封闭的肽通过酰胺键与纳米颗粒共价连接。在一些实施方案中，酰胺键由本发明之肽或经封闭肽的氨基基团与纳米颗粒的羧酸取代基形成。在一些实施方案中，酰胺键由N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)和/或I-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)形成。[83]应当理解，可以对其它类型的配体(例如非肽配体)进行同样或等同的化学修饰，以对其进行封闭。还应当理解，可以利用相同或相似的化学修饰对作为光可去除基团之替代或补充的任何合适可去除基团进行连接。[84]可通过暴露于光、热、压力、微波、pH值变化、一种或更多种代谢物水平变化和/或其它能量来源使失活的靶向配体活化。在一些实施方案中，配体上的保护基团通过暴露于任何合适的常规光源而被去除。这种光源的实例包括但不限于在光谱的紫外部分发射能量的激光器(例如受激准分子激光器(excimer laser))或在光谱的红外部分发出福射的激光器(例如二极管激光器、钛蓝宝石激光器(Ti:sapphire laser)、钦激光器(和其它稀土金属激光器)、钕(Nd)YAG、Nd YAG激光器)，以及产生短暂、高通量密度发射的激光器。如果需要，可通过本领域已知的标准光学调制技术(例如，通过利用锁模(mode-locked)激光器(例如使用电子或声光设备))来制备可用于产生双光子激发的脉冲辐射。在红外、可见和近红外光谱中以脉冲模式运行的激光器包括Nd: YAG激光器、Nd: YLF激光器、C02激光器、受激准分子激光器、染料激光器、钛蓝宝石激光器、二极管激光器、钦(和其它稀土材料)激光器以及金属蒸汽激光器。这些光源的脉冲宽度是可调的，并且可以为几十飞秒至几百微秒。
[85] 一般地，激光器是优选的照射源，因为其提供明确定义的空间上相干的照射波长，特别适于在限定区域使光敏感的封闭基团去封闭。此外，这样的光源可通过光纤传送，并且可用于以可控方式照射特定的区域。光纤传送系统特别容易操作，其可用于照射机体的某一区域(例如组织)，从而对难以到达的位置进行照射。当与激光器光学耦合时，这些类型的传送系统是可用的，因为其能够整合到导管和相关的柔性装置中，并用于照射机体(例如人体)中几乎任何器官或区域。此外，可容易地调整光源的波长，以在特定细胞或组织类型中产生适当吸收，这使得能够利用本发明的化合物和方法有效地对多种不同的细胞或组织进行治疗。在一些实施方案中，所使用的光波长为350 400nm。在一些实施方案中，使用近红外照射。[86]光敏感之经封闭肽的光解提供了在空间和时间上控制生物学活性肽或其它分子释放的方法。特别地，利用用聚焦照射(例如紫外或红外照射)束活化经封闭产物的能力，可以将本发明之经封闭分子(例如肽)的光解精确定位至机体中分散区域的细胞或组织。在后一情形中，可以使用高通量密度以利于进行双光子激发(Denk等人，Science 248 73-76，1990)，这对于使用本发明之经封闭分子(例如肽)进行的光动力学治疗特别有利，因为机体的组织对于紫外照射几乎是不透明的，但是对于红外照射是透明的。该方法使得光束在体内聚焦，从而控制在特定位点反应。双光子激发方法的另一优势是化合物光活化的可能性是光照强度分布之平方的函数，导致对精确限定的区域进行活化。此外，双光子激发利用光谱红外部分中的光的能力是有利的，因为其提供了利用在机体内传导之宽范围波长的机会。[87]本发明由以下实施例进一步举例说明，所述实施例不应视为以任何方式进一步限定本发明。本申请中引用的所有参考文献(包括文献、授权专利、已公开的专利申请以及共同未决的专利申请)的全部内容通过引用明确地并入本文中。
实施例材料和方法[88]评估靶向物的去封闭潜力。利用HP 1100 HPLC系统进行HPLC测定。将50 μ I体积的样品注入C18柱上。用含水溶液以Iml/分钟对柱进行洗脱。利用UV检测仪在所设230nm的吸收波长下对肽进行检测。[89]经封闭颗粒的合成。将I毫克的荧光聚苯乙烯羧化纳米颗粒悬液(328±2nm，Merck Chimie S. A. S, Pithiviers, FR)与 IOOmg 的 I-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC，Sigma)以及200mg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS，Sigma)于室温孵育2. 5小时，其间轻柔搅拌。所得经NHS活化的颗粒与5mg NH2-GGGGY(DMNB) IGSR-NH2(SEQID NO:2)肽(根据 HPLC 纯度 > 96 由 Peptech Corp. Burlington, MA 定制合成)于室温共价连接过夜，其间轻柔搅拌。順2-6666￥1631 -順2和乱序肽(scrambled peptide)NH2-GGGGFHPDYRVI-NH2 (SEQ ID NO :4) (GenScript Corp. Piscataway，NJ)用作对照靶向物。[90]傅立叶变换(Fourier transform) IR。在6孔板中对纳米颗粒溶液(200 μ g/mL)光照0、1和5秒(365nm Entela, Upland, CA)。收集溶液，离心，并弃去培养基。接着将纳米颗粒冻干24小时，并利用FTIR光谱仪(Bruker Alpha-E, Billerica MA)收集其光谱。未经封闭的颗粒用作对照。
[91]细胞分离。如 Barbash 等人，Circulation2003,108, (7),863-8 中所述地分离间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC) 简单地讲,在无菌条件下切下2_3月龄Sprague-Dawley大鼠(Charles River, Wilmington, MA)的股骨和胚骨。通过用培养基冲洗骨髓腔从骨中提取骨髓栓(bone marrow plug)。获得均质细胞悬液后,将细胞离心(600g，5分钟)，重悬于DMEM中并铺板(每个75cm2培养瓶中50 X IO6个细胞)。3天后，更换培养基，贴壁细胞被认为是MSC。所 有实验中均使用二次传代的BM-MSC。如前(Dvir等人，Tissue Eng2006，12，(10)，2843-52)所述地分离心脏细胞。简单地讲，将所分离的心室置于冰冷的基于Dulbecco’ s modified Eagle’ s medium(DMEM)的缓冲液(二水合氯化钙，I. 8mM ;氯化钾，5. 36mM ;七水合硫酸镁，0. 8ImM ;氯化钠，0. IM ;碳酸氢钠，0. 44mM ;磷酸二氢钠，0. 9mM ；pH7. 4)中，切割成约Imm3的小块，并在缓冲液中与II型胶原酶(95U/mL ；Worthington, Lakewood, NJ)和膜液素(pancreatin) (0. 6mg/mL ；Sigma)重复(6 7 次)孵育(37°C，30分钟)。每轮消化后，将混合物离心^00g，5分钟，25°C )，并将细胞沉淀重悬于冰冷的M-199培养基中。[92]细胞培养和细胞结合。HUVEC(Lonza Walkersville, Inc. Walkersville,MD)和MSC分别培养于8腔室玻片中的EGM-2和DMEM中，DMEM中添加有100单位/mL的青霉素水溶液、100g/mL链霉素和10%胎牛血清。细胞聚集生长以实现 90%的汇合度。实验当天，用预先温热的PBS清洗细胞,并与加入了 20 μ g/mL经封闭之纳米颗粒的预温热培养基孵育。光照培养物10秒，于37°C孵育30分钟，然后用PBS清洗3次，用β肌动蛋白的抗体(Sigma)染色，并利用荧光显微镜观察。利用荧光显微镜在20Χ放大倍数下确定被靶向细胞的数目，并除以细胞总数。对于经封闭纳米颗粒靶向的定性评估和空间实验，将含有200 μ g/mL经封闭纳米颗粒的培养基加入到细胞培养物中，并对培养皿/瓶进行I分钟光照(对于定性祀向评估和空间祀向而言，分别使用UV灯或倒置Zeiss显微镜，Axiovert200M)或不进行光照，然后小心地进行清洗，用UV光透照台(TFX-35M，Life Technologies,Paisley, UK)观察,并照相记录图像(Kodak数字科技电泳记录和分析系统120)。[93]免疫荧光染色。如前所述进行免疫荧光染色。简单地讲，将样品固定，并在冰冷的甲醇中进行浸透，在含有5% FBS的基于DMEM之缓冲液中于室温封闭I小时。用缓冲液清洗3次后，使样品与抗β肌动蛋白抗体(缀合有FITC，Sigma)或β I整合素抗体(R&DSystem)(分别为I : 500和I : 50)孵育I小时。孵育后，对经抗β I整合素抗体染色的样品进行清洗，并与缀合有Alexa 488的山羊抗小鼠抗体(I 150)再孵育I小时。对于细胞核检测，使细胞与Hoechst 33258 (Sigma)孵育3分钟并清洗。用倒置Zeiss荧光显微型模式Axiovert 200Μ进行成像,并利用AxioVision 4. 5进行分析。结果[94]先前已显示含YIGSR的合成肽(例如CDPGYIGSR(SEQ ID NO 3)和YIGSR-NH2 (SEQ ID NO :1))促进细胞粘附和迁移。此外，已显示细胞通过与细胞膜上的β I整合素结合而粘附于层粘连蛋白。发现所提出的靶标(β I整合素)存在于几种细胞类型(包括HUVEC、MSC、成纤维细胞、心肌细胞和人胚胎干细胞(hESC))上。这些细胞代表了纳米颗粒系统所适用的较宽范围的靶细胞。[95]先前已显示YIGSR肽(SEQ ID NO : I)中酪氨酸的突变或缺失导致肽活性显著缺失。因此，在本研究中，用4，5-二甲氧基-2-硝基苄基(DMNB)(图2)对HGSR肽上的该氨基酸进行封闭，从而使其暂时性失活，直至其接受光照。本研究中使用的封闭基团选择DMNB是因为其在文献中已有明确记载并且已显示其以毫秒的速度从生物物质中释放。就去封闭性质而言，这并不是最佳的生色团，在本研究中，其仅用于证明本发明的实施方案。广泛使用的经封闭化合物的重要实例、其设计特征、合成以及应用先前已由Ellis-Davis描述。[96]为了确定靶向物(例如肽GGGGY(DMNB) IGSR-NH2 (SEQ ID NO :2))的去封闭能力(导致其转化为活性状态)，通过HPLC-UV对未经封闭之肽(GGGGYIGSR-NH2) (SEQ ID NO 2)或者接受或未接受I分钟光照之经封闭肽的溶液进行评估。未经封闭之靶向物的柱中的保留时间为 20分钟(图3A)，而由于存在使肽的疏水性增加的封闭基团，未经光照之经封闭靶向物的保留时间更长( 30分钟，图3B)。光照后10秒，保留时间出现位移，肽在 20分钟后从柱中离开(图3C)。这些结果表明，封闭基团从肽中迅速释放，使其快速活化，为有效的细胞结合做准备。[97]然后，利用I-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥 珀酰亚胺(NHS)活化化学法将具有胺末端的经封闭肽/靶向物缀合至具有羧基末端的聚苯乙烯纳米颗粒(328±2nm)的表面。[98]利用FTIR测得经封闭纳米颗粒在 llOOcnT1处具有一个宽峰(与醚基的延伸一致)。为了表明DMNB迅速去封闭的时间，光照I秒(C)和5秒⑶后，对缀合有经封闭靶向物的纳米颗粒进行分析。未经封闭靶向物的IR谱用作对照(A)。结果显示，5秒后，与靶向物缀合之纳米颗粒上的醚键消失(图4A)，这表明靶向物迅速活化。为了进一步评估从经缀合之纳米颗粒上释放到介质中的封闭基团的量，对颗粒光照1、2和5秒后，利用分光光度计测定DMNB的吸光值(图4B)。然后将所释放的DMNB与游离DMNB的校准曲线进行比较，所得数值与颗粒上已知可利用的羧酸数目的比值表明 85%的DMNB被释放。由于每个纳米颗粒缀合有 5000个靶向物分子，因此，从统计学上来讲，已活化的靶向物的量将足以使接受光照的每个颗粒活化并足以与细胞结合。此外，由于靶向物的活化在体内是浓度依赖性的(例如，较高的颗粒密度可以阻碍光到达所有颗粒)，因此颗粒将是更充足的，并且光将能够促进循环经过光束的颗粒较快活化。[99]在确保纳米颗粒经光照活化后，对经封闭颗粒在暴露于光时与细胞粘附的能力进行评估。第一步，将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种于60mm培养皿中。24小时后，用含有经封闭之纳米颗粒的介质更换培养基，并对皿光照I分钟。孵育15分钟后，小心清洗皿，并置于UV光透视台上以观察细胞靶向。未经光照的培养物用作对照。接受光照的皿中的纳米颗粒(显示为白色)粘附于细胞并且明显地覆盖培养皿大部分区域(图5A)，而未经光照的培养物大多不具有纳米颗粒，只有一些纳米颗粒粘附于边缘(图5B)。[100]定性证实了颗粒与HUVEC粘附的可行性之后，对光照促进细胞靶向的潜力进行定量评估。由于本发明靶向系统并非设计为选择性地区分不同细胞类型，而是在光存在下靶向任何细胞或组织，因此利用HUVEC和间充质干细胞(MSC)进行靶向实验，这两种细胞类型代表了表达β I整合素的较广泛的细胞群。选择这两种细胞类型是因为HUVEC代表构成血管的细胞，MSC代表结缔组织中存在的基质细胞。共同地和分别地，这些细胞种类在体内每种组织和器官中均能发现。因此，纳米颗粒靶向并结合体内特异性区域、组织和器官的潜力仅仅是光依赖性的。
[101]将细胞(HUVEC和MSC)接种于培养玻片中并使其复原。接种后24小时，用含有10 μ g经封闭之荧光颗粒的介质更换培养基，光照I分钟，孵育30分钟，然后立即清洗，固定并染色。利用显微镜对被纳米颗粒靶向的细胞数目进行计数，并除以细胞总数。用不暴露于光的经封闭纳米颗粒、经光照的缀合有乱序肽(作为靶向物)的纳米颗粒或者缀合有未经封闭之YIGSR-NH2的纳米颗粒(阳性对照)作为对照。[102]在HUVEC和MSC两种细胞类型的培养物中，与未经光照的培养物相比，光照后颗粒粘附的百分比显著更高(对于HUVEC，P = O. 03(图5C);对于MSC，p < O. 0001 (图5D))。此外，暴露于光的经封闭纳米颗粒与细胞的结合与阳性对照(缀合有未经封闭之靶向物的颗粒)(在MSC中P = O. 53)处于相同水平，这表明封闭基团的有效释放以及纳米颗粒的有效活化。[103]最后，对经封闭颗粒的空间靶向能力进行评估。HUVEC在25cm2的T培养瓶中与经封闭的纳米颗粒一起培养。培养瓶用遮盖物覆盖，使光仅能从其中心(d= Imm)透过，并置于倒置显微镜下的黑暗中。由于颗粒活化后培养瓶的每次移动都会导致纳米颗粒发生位移并附着于未接受光照的区域，因此先将培养瓶于黑暗中固定10分钟，然后暴露于 显微镜聚焦光束下I分钟。为了尽可能减小颗粒扩散的距离，在所述短时间内使培养物与高浓度的经封闭颗粒(200 μ g/mL)孵育。在施加光的位置，纳米颗粒被活化，并与细胞发生粘附。与遮蔽物的形状相对应，颗粒以圆形排列。尽管遮蔽物裂缝的直径仅为1mm，然而被靶向细胞位于 6mm的直径内，这可能是由于活化后纳米颗粒的扩散或者光束的散射所致。光束中心处超过94%的细胞被颗粒靶向(图7B)，而未暴露于光的区域处几乎观察不到细胞靶向(图7C)。[104]综上所述，本文描述了一种能够在光照后选择性地与细胞结合的靶向系统。由于这些细胞存在于体内每种组织中，因此该靶向系统可以可行地用于靶向患病组织，而无需考虑特定标志物的表达。参考文献I. Peer, D. ;Karp，J. M. ;Hong，S. ；Farokhzad, 0. C. ;Margalit，R. ;Langer，R. Nature Nanotechnology 2007，2，(12)，751-60.2. Duncan，R. Nat Rev Drug Discov 2003，2，(5)，347-60.3. Mallidi, S. ；Larson, T. ;Tam，J. ;Joshi，P. P. ;Karpiouk，A. ；Sokolov, K.；Emelianov，S. Nano Letters 2009，9，(8)，2825-31.4. Bagalkot，V. ；Zhang, L. ；Levy-Nissenbaum, E. ；Jon, S. ;Kantoff，P. W.；Langer, R. ；Farokhzad, 0. C. Nano Lett 2007，7，(10)，3065-70.5. Farokhzad, 0. C. ;Cheng，J. ;Teply，B.A. ；Sherifi, I. ； Jon, S. ；Kantoff, P. W.；Richie，J. P. ；Langer, R. Proc Natl Acad Sci USA 2006,103，(16)，6315-20.6. von Mehren, M. ；Adams, G. P. ；Weiner, L. M. Annu Rev Med 2003，54，343-69.7. Dvorak, H. F. ；Nagy, J. A. ；Dvorak, A. M. Cancer Cells 1991，3，(3)，77-85.8. BisbyiR. H. ;Mead，C. ；Morgan, C. G. FEBS Lett 1999,463，(1-2)，165-8.9. Manyak，M. J. ；Russo, A. ；Smith, P. D. ;Glatstein，E. J Clin Oncol 1988，6，
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1.一种组合物，其包含 多个颗粒，每个颗粒包含一定量的待递送至个体的物质，其中通过利用光可去除之保护基团进行封闭而失活的靶向配体与所述颗粒表面相连，其中通过照射所述组合物使保护基团去除来活化无活性的配体，并且其中活性配体能够与抗配体结合。
2.权利要求I的组合物，其中所述配体包括肽、抗体或适配体。
3.权利要求2的组合物，其中所述肽包含RGD或HGSR(SEQID NO 1)基序。
4.权利要求I的组合物，其中所述光可去除的保护基团选自2-硝基苄基、安息香酯、N-酰基-7-nitindoline、间苯酌·、苯乙酮和其衍生物。
5.权利要求4的组合物，其中所述光可去除的保护基团是4，5-二甲氧基-2-硝基苄基(DMNB)或其衍生物。
6.权利要求I的组合物，其中所述光可去除的保护基团与所述配体共价连接。
7.权利要求I的组合物，其中两种或更多种不同的靶向配体与所述颗粒的表面相连。
8.权利要求7的组合物，其中所述靶向配体中至少一种是组织特异性的。
9.权利要求I的组合物，其中所述靶向配体是细胞类型特异性的。
10.权利要求9的组合物，其中所述细胞类型选自HUVEC、MSC、成纤维细胞、心肌细胞和人胚胎干细胞(hESC)。
11.一种将物质靶向递送至个体中预定细胞或组织的方法，其包括 (a)向有此需要的个体施用组合物，所述组合物包含含有一定量之待递送至个体的物质的颗粒，其中通过利用光可去除之保护基团进行封闭而失活的靶向配体与所述颗粒的表面相连； (b)选择性地照射所述个体中的预定细胞或组织从而通过去除保护基团而使经照射的预定细胞或组织中的无活性配体活化，其中活性配体能够与所连接的颗粒一起与该预定细胞或组织上存在的抗配体相结合，从而将物质靶向递送至个体中。
12.权利要求11的方法，其中所述配体包括肽、抗体、适配体。
13.权利要求12的方法，其中所述肽包含RGD或HGSR(SEQ ID NO I)基序。
14.权利要求11的方法，其中所述光可去除的保护基团选自2-硝基苄基、安息香酯、N-酰基-7-nitindoline、间苯酌·、苯乙酮和其衍生物。
15.权利要求14的方法，其中所述光可去除的保护基团是4，5-二甲氧基-2-硝基苄基(DMNB)或其衍生物。
16.权利要求11的方法，其中所述光可去除的保护基团与所述配体共价连接。
17.权利要求11的方法，其中两种或更多种不同的靶向配体与所述颗粒的表面相连。
18.权利要求17的方法，其中所述靶向配体中至少一种是组织特异性的。
19.权利要求11的方法，其中所述靶向配体是细胞类型特异性的。
20.权利要求19的方法，其中所述细胞类型选自HUVEC、MSC、成纤维细胞、心肌细胞和人胚胎干细胞(hESC)。
21.一种将物质靶向递送至个体中预定细胞或组织的方法，其包括 (a)向有此需要的个体施用组合物，所述组合物包含含有一定量之待递送至所述个体的物质的颗粒，其中通过利用光可去除之保护基团进行封闭而失活的靶向肽与颗粒表面相连；(b)选择性地照射个体中的预定细胞或组织从而通过去除保护基团而使经照射的预定细胞或组织中的无活性肽活化，其中活性肽能够与所连接的颗粒一起与预定细胞或组织上存在的整合素结合，从而将物质靶向递送至个体中。
22.权利要求21的方法，其中所述肽包含RGD或HGSR(SEQ ID NO I)基序。
23.权利要求21的方法，其中第二靶向配体与所述颗粒的表面相连。
24.权利要求23的方法，其中所述第二靶向配体是组织特异性的。
25.一种组合物，其包含 多个颗粒，其中每个颗粒能够携带一定量的待递送至个体中的物质，其中通过利用光可去除之保护基团进行封闭而失活的靶向配体与颗粒表面相连，其中通过照射组合物以去除保护基团来活化无活性配体，并且其中活性配体能够与抗配体结合。
26.权利要求25的组合物，其中所述配体包括肽、抗体、适配体。
27.权利要求26的组合物，其中所述肽包含RGD或HGSR(SEQ ID NO I)基序。
28.权利要求25的组合物，其中所述光可去除的保护基团选自2-硝基苄基、安息香酯、N-酰基-7-nitindoline、间苯酌·、苯乙酮和其衍生物。