专利名称：一种微生物絮凝剂及其制备与用途的制作方法水处理剂是环保产业中药剂研究的重点，在生活污水与工业废水处理过程的固液分离中占有重要地位的絮凝剂则更为突出。已知无机高分子类和以聚丙烯酰胺为代表的有机合成高分子絮凝剂具有二次污染特性，对环境及人类健康构成强大威胁；而生物絮凝剂是典型的环保水处理剂，安全、无毒、可生物降解，对生态无二次污染，并可增加土壤有机质含量，具有很好的环境效益，将带来显著的环保、社会及经济多重效益，因而日益受到人们的关注。众多研究者的工作已经表明，能够产生具有絮凝功能物质的微生物种类繁多，包括霉菌、细菌、放线菌和酵母，这些已经鉴定的絮凝微生物大量存在于土壤、活性污泥和沉积物中。由细菌产生的絮凝剂中芽孢杆菌属所占比例较大，如Suh H等报道从土壤中分离得到的芽孢杆菌Bacillus sp.DP-152可分泌很多絮凝物质；真菌产生的絮凝剂最具代表性的是由酱油曲霉产生的絮凝剂Aspergillus sojae AJ7002 ;另外H.Takagi等人1982年研究了拟青霉素(Paecilomycesl sp.)，精制得到PFlOl絮凝剂。诺卡氏菌(Nocardia sp.)是放线菌中研究较多的菌种，江南大学已于2001年将诺卡氏菌制备生物絮凝剂的方法申请了专利；北京市环科所和华中师范大学分别利用海藻类植物和无菌衣藻为原料制备生物絮凝剂，用于湖泊污水及工业废水的治理。目前已报道的微生物絮凝剂大多属于多糖类活性物质，絮凝后产生的沉淀粒度小，不易去除，并且多数需要与其他化学絮凝剂共同使用来达到显著的絮凝效果；然而化学絮凝剂的添加使用仍然会带来二次污染问题。
本发明致力于开发一种新的微生物絮凝剂，以解决现有微生物絮凝剂存在的絮凝后产生的沉淀粒度小、不易去除等问题。为了实现本发明的目的，发明人分别从土壤和纳豆中分离提取了巨大芽孢杆菌和能够产生Y-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌。利用这两种杆菌制备了一种新的液态微生物絮凝剂并将其用于水处理，取得了理想的使用效果。本发明的技术方案如下:一种微生物絮凝剂，含有两种芽孢杆菌，分别为巨大芽孢杆菌(Bacillusmagaterium) SY-Z5和具有生产Y -聚谷氨酸能力的枯草芽孢杆菌(Bacilius subtilis)SY-ND,巨大芽孢杆菌SY-Z5的菌种保藏号为CGMCC N0.5225，枯草芽孢杆菌SY-ND的菌种保藏号为 CGMCC N0.5224。本发明的具体实施步 骤为，首先获得生产絮凝剂菌种。生产絮凝剂菌株SY-Z5分离自渤海湾海边土壤，经16S rDNA基因测序法鉴定为巨大芽孢杆菌，已于2011年9月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCCN0.5225。初筛培养基组分(g/L)=NaNO3 3、FeSO4 0.01、MgSO4.7H20 0.5、K2HP04 1.0、KCl0.5、蔗糖30、琼脂粉18，pH自然。复筛培养基组分(g/L):葡萄糖20、(NH4)2SO40.2、尿素0.5,KH2PO4 2.(KK2HPO4 5.0、NaCl 0.1、酵母粉0.5，pH自然。用初筛培养基制作平板，将采集样品富集后稀释涂布，30°C培养2-4d后，挑取生长快、粘稠的菌落重新划线接种于初筛培养基进行纯化，4°C冰箱保存。挑取保存的菌株菌苔接种于复筛培养基中，于30°C，150rpm培养l-2d，测定各分离菌株发酵液的絮凝活性；从中挑选一株絮凝活性高、生长速度快、遗传稳定性好的菌株作为生产絮凝剂所用菌(命名为SY-Z5)，其菌落特征为圆形，白色，表面光滑，细胞大型杆状。另一株生产絮凝剂菌株为SY-ND，具有生产Y -聚谷氨酸能力，分离自纳豆，经16SrDNA基因测序法鉴定为枯草芽孢杆菌，已于2011年9月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.5224。分离培养基组分(g/L):蛋白胨10、葡萄糖20、酵母膏8、谷氨酸钠20、KH2PO4 2、K2HPO4 2,MgSO4 0.5,CaCl2 0.25、琼脂粉18。将纳豆样品在无菌条件下稀释系列梯度浓度，稀释液在分离培养基平板上涂布，37°C培养2-3d后，挑取分泌粘液的菌落，接种于LB固体培养基上划线纯化，4°C冰箱保存。获得SY-ND菌株，经接种至大豆试验证明为Y-聚谷氨酸产生菌，其在分离培养基上的菌落形态为圆形或不规则形，边缘锯齿状，中间明显隆起，透明。本发明的另一个技术方案为:利用上述两种芽孢杆菌制备微生物絮凝剂。将巨大芽孢杆菌SY-Z5接种于种子培养基中(组成与复筛培养基相同)，于30°C、150rpm摇床过夜培养作为种子液，取种子液以5%接种量(种子液接种体积占扩大发酵培养基的体积比)接入扩大发酵培养基(组成与复筛培养基相同)，相同条件下培养3d，获得菌株发酵液，使菌体浓度达108-101(lCFU/mL。种子培养基和扩大发酵培养基均与前述的复筛培养基组分相同(g/L):葡萄糖 20、(NH4)2SO4 0.2、尿素 0.5、KH2PO4 2.0、K2HPO4 5.0、NaCl0.1、酵母粉0.5，pH自然。同样将一环枯草芽孢杆菌SY-ND接种至种子培养基中，于37°C、150rpm摇床过夜培养种子液，种子培养基组分(g/L):蛋白胨10、葡萄糖5、酵母膏3、NaCl 5、pH 7.0。取种子液以5%接种量(种子液接种体积占扩大发酵培养基的体积比)接入扩大发酵培养基中，相同条件下培养3d，获得菌株发酵液。扩大发酵培养基组分(g/L):蛋白胨10、葡萄糖20、酵母膏 8、谷氨酸钠 20、KH2PO4 2、K2HPO4 2、MgSO4 0.5、CaCl2 0.25，pH 7.0。上述两种芽孢杆菌所构成的微生物絮凝剂能够有效去除水体中悬浮物，实现绿色、无二次污染的废水絮凝过程，可广泛应用于各种污水处理，因此本发明的技术方案还包括本发明的微生物絮凝剂用于处理工业废水的用途。当使用本发明的微生物絮凝剂处理工业废水时，具体使用方法如下:将按照上述方法制备的SY-Z5菌株发酵液与SY-ND菌株发酵液依次投加入待处理的工业废水中，加入量分别为0.3-1.5%和0.3-1.0% (体积比)，并与钙离子溶液共同使用(加入量0.01 % )，调pH值7 .5-9.0,充分搅拌，絮凝悬浮物质。由于SY-Z5菌株发酵液的活性物质为多糖，可通过网捕、吸附架桥等作用将一定粒径范围的悬浮物聚集在一起，形成细小絮状物；而枯草芽孢杆菌SY-ND代谢产物Y-聚谷氨酸是一种胞外高分子聚合物，分子量大、助凝作用强，其分子结构侧链有大量侧链羧基，可将形成的细小絮状物利用吸附架桥作用结合成大块沉淀；因此沉淀速度加快，且沉淀体积大，易于过滤去除。本发明提供的由两种芽孢杆菌制备的微生物絮凝剂具有如下优点:絮凝效率高，使用后产生沉淀颗粒大，易沉淀及去除，无需添加化学絮凝剂。由于具有上述优点，本发明提供的新型絮凝剂可安全用于各种工业污水处理及食品、医药行业，对于加强环境保护和关注人类健康具有重要意义。

pH自然。初筛方法:将采集的土壤样品5g于装有50mL蒸懼水的150mL三角瓶中，补加少量葡萄糖和硫酸铵，30°C摇床振荡培养3d，然后将培养液系列稀释至10_5、10_6、10_7，用玻璃棒涂布到初筛培养基上，30°C培养2-4d，挑取生长快、粘稠菌株进行划线纯化，将纯菌株接种到斜面培养基(组分与初筛培养基相同)，4°C保存，备用。复筛培养基组分(g/L):葡萄糖20、(NH4)2SO4 0.2、尿素 0.5、KH2PO4 2.0、K2HPO4 5.0、NaCl 0.1、酵母粉
0.5，pH自然。复筛方法:从斜面上挑取初筛分离获得的各菌株接种于复筛培养基中，30°C，150rpm摇床培养l_2d，将各菌株发酵液作絮凝活性测定，比较各菌株的絮凝性能。絮凝活性测定方法如下:将各菌株发酵液在8000rpm下离心15min，吸取上清液lmL，加入50mL 4%高岭土配水中，快搅(250rpm)2min,慢搅(IOOrpm) 3min,静止4min后吸取距液面5mm处的液体,使用分光光度计在550nm下测定吸光度值，计算絮凝率。结果为SY-Z5菌株的絮凝率较高达95.4%，且生长速度快，遗传稳定性好，培养基成分无特殊要求，因此作为本发明生产微生物絮凝剂菌株。 扩增SY-Z5菌株的16S rDNA基因，测出其16S rDNA基因序列，登陆http: //www.ncb1.nlm.nih.gov网站，在GenBank中进行核苷酸比对，与登录号为CP001983.1的Bacillus meqaterium QM B1551 (巨大芽孢杆菌)菌株的同源性达100%,并通过生理生化特征判断SY-Z5菌株为巨大芽孢杆菌，最佳生长温度为30°C，pH 7.5。枯草芽孢杆菌SY-ND，由纳豆(购自超市食品部)中分离获得。分离培养基组分(g/L):蛋白胨10、葡萄糖 20、酵母膏 8、谷氨酸钠 20、KH2PO4 2、K2HPO4 2、MgSO4 0.5、CaCl20.25、琼脂粉18。分离方法:取样品2g于灭菌的研钵中，加入IOmL无菌水进行研磨，将稀释液进行系列梯度稀释至10_4、10_5、10_6，涂布于分离培养基平板上，37°C培养2-3d。挑取粘稠，可拉丝菌落进行分离 纯化，经接种至大豆验证能产生Y -聚谷氨酸后，确定具有生产Y -聚谷氨酸能力的SY-ND菌作为目的菌株，转接入斜面培养基(成分与分离培养基相同)，4°C保存备用。采用与SY-Z5菌株相同的鉴定方法确定SY-ND菌株为枯草芽孢杆菌。实施例2微生物絮凝剂的制备将斜面上的SY-Z5菌株接种至IOOmL种子培养基中(组成与实施例1中复筛培养基相同)，30°C、150rpm下振荡培养过夜，以5%接种量接入扩大发酵培养基(组成与复筛培养基相同)，相同条件下继续扩大培养3d，稀释平板法检测菌体浓度达108-101(lCFU/mL。同样将一环SY-ND菌株接种至IOOmL种子培养基中，37°C，150rpm下振荡培养过夜。取种子液以5%接种量接入扩大发酵培养基中，相同条件下培养3d。种子培养基组分(g/L):蛋白胨10、葡萄糖5、酵母膏3、NaCl 5, pH 7.00扩大发酵培养基组分(g/L):蛋白胨10、葡萄糖20、酵母膏8、谷氨酸钠20、KH2PO4
2、K2HPO4 2、MgSO4 0.5、CaCl2 0.25，pH 7.0。 实施例3微生物絮凝剂应用试验分别配制2g/L白炭土、膨润土、硅藻土配水，依次加入微生物絮凝剂SY-Z5菌株发酵液I %，SY-ND菌株发酵液I %，CaCl2加入量0.01%,1% NaOH调节pH为8.0，搅拌处理，快搅(250rpm) lmin,慢搅(80rpm) 3min后静置5min,大部分悬浮物被絮凝出来,形成的絮状体沉降速度快。测试结果表明，本发明微生物絮凝剂对白炭土、膨润土、硅藻土悬浮液的絮凝率分别为 87.7%,91.7%,95.4%。实施例4微生物絮凝剂处理焦化废水试验将SY-Z5菌株发酵液与SY-ND菌株发酵液复合处理鞍钢焦化废水，加入SY-Z5菌发酵液1%，CaCl20.01%,以1% NaOH调节pH为8.0，快搅Imin后，加入SY-ND菌发酵液1%，继续快搅lmin，然后慢搅拌lOmin，静止5min后吸取上层液测定色度、絮凝率、悬浮物的变化。结果为悬浮体被迅速絮凝沉淀下来，形成大块结实沉淀物，处理前后色度分别为100倍和30倍。悬浮物(SS)处理前后分别为110mg/L和38mg/L，可见本发明微生物絮凝剂对悬浮物的去除具有显著 作用。


本发明提供两种芽孢杆菌制备的微生物絮凝剂，所述芽孢杆菌分别为一种巨大芽孢杆菌(Bacillus magaterium)和一种枯草芽孢杆菌(Bacillus magaterium)，其中枯草芽孢杆菌可产生高分子生物基材料γ-聚谷氨酸，将以上两种菌的发酵液混合投加处理悬浮物质，可将悬浮物质絮凝出来，产生结实絮凝体。本发明的微生物絮凝剂可替代化学絮凝剂的使用，可安全用于各种工业污水处理及食品、医药行业，具有推广前景。