专利名称：一种连续提取天然α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法桑叶为桑科植物桑(Morus alba L.)的干燥叶，我国大部分地区均有生产，资源极其丰富。桑叶除用作养蚕外，自古以来就是一种优良的中药材，在我国多部医药典籍，如《神农本草经》和《本草纲目》均有记载，有着悠久的临床药用历史，现代药理学研究表明桑叶具有降血糖、抗氧化、抗衰老、降血脂等功效。桑葚系桑科植物桑的成熟果实，《本草经疏》中提到“桑葚，甘寒益血除热，为凉血补血益阴之药”。而《本草纲目》记载“捣汁饮，解酒中毒，酿酒服，利水气，消肿”。因桑树特殊的生长环境使桑椹含多种活性成分，具有抗氧化、保护神经、抗大脑缺血、降糖、降脂、降血压、抗癌等作用。近年来桑树资源的降血糖活性备受关注，关于桑树资源降血糖的研究主要集中在多糖、黄酮和生物碱等活性物质上。多糖是桑叶和桑葚中的重要活性成分，其含量丰富，具有较高的药食用价值；桑叶和桑葚中黄酮类化合物是其中最主要的活性成分之一，具有较好的降血糖、抗氧化等作用； 桑叶和桑葚内含有生物碱类物质，其中1-脱氧野尻霉素(DNJ)，因植物中唯桑树中含有而最引人关注，生物碱含量虽然比较低，但其对α -葡萄糖苷酶具有极好的抑制活性，降血糖功效非常显著。桑叶和桑葚同时含有多糖、黄酮和生物碱三种活性物质，只提取其中一种或两种活性物质没有实现高效利用资源，造成资源的浪费。从桑叶、桑葚混合物中连续提取分离多糖、黄酮和生物碱不仅利于糖尿病药物开发和利用，而且对于蚕桑资源的综合利用具有十分重要的意义。申请号为200710060127. 2的专利申请公开了一种从桑叶中提取生物碱、黄酮和多糖活性成分的方法用乙醇或丙酮回流提取，得到滤液和滤渣；滤液通过大孔树脂和离子交换树脂分离黄酮类和生物碱类化合物；桑叶滤渣水煎脱色醇沉，酸性多糖类化合物。该专利不足之处在于分离桑叶黄酮类和生物碱类化合物就需要大孔树脂和离子交换树脂两种树脂，而且提取桑叶多糖时需要进行单独脱色，使得提取程序复杂，操作繁琐，工作量大。申请号为200810236144. 1的专利申请公开了一种联产桑叶黄酮、多糖和生物碱的复合提取工艺桑叶经过水提得到水提液，通过大孔树脂分离得到桑叶粗黄酮和粗多糖； 桑叶残渣经过酸液提取后，调节ρΗ值，再用氯仿提取等得到桑叶粗生物碱。该专利不足之处在于提取桑叶生物碱用到氯仿萃取法，而氯仿是一种有毒试剂，极易遇光反应生产剧毒的光气，危害生命安全。所以，该方法不宜用于规模化生产。申请号为200810062099. 2的专利申请公开了一种从桑葚中提取生物类总黄酮的方法，通过石油醚脱脂，乙醇回流提取，滤液减压浓缩、调ΡΗ、加入无机盐等，然后采用树脂吸附、洗脱，淋洗液真空干燥得到生物类总黄酮。该方法有效提取了桑葚总黄酮，但是没有涉及其他活性物质的提取，没有充分利用资源。
本发明的目的在于提供一种连续提取天然α -葡萄糖苷酶抑制剂的方法，该方法操作简单、安全性高，成本低。本发明的上述目的是通过如下步骤来实现的一种连续提取天然α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，包括以下步骤(1)选取桑叶和桑葚，用热水反复浸提，合并提取液并减压浓缩得多糖以及黄酮的浓缩液，桑叶和桑葚残渣备用，将多糖以及黄酮的混合浓缩液通过大孔树脂吸附，先用蒸馏水洗脱，得到多糖洗脱液，再用乙醇洗脱，得到黄酮洗脱液，多糖洗脱液经醇沉、离心和干燥得天然α-葡萄糖苷酶抑制剂多糖粉末，黄酮洗脱液经减压浓缩和干燥得天然α-葡萄糖苷酶抑制剂黄酮粉末；(2)将步骤(1)中获得的桑叶和桑葚残渣用乙醇-盐酸溶液反复提取，合并提取液并减压浓缩得桑叶和桑葚生物碱浓缩液，将生物碱浓缩液经阳离子交换树脂吸附，用氨水洗脱，将氨水洗脱液经减压浓缩和干燥后，获得天然α -葡萄糖苷酶抑制剂生物碱粉末。本发明步骤(1)中桑叶与桑葚的质量比优选为1-5: 1，桑叶和桑葚与热水的质量比优选为1 10-25，热水的温度优选为60-80°C，每次提取时间优选为60-120min，提取次数优选为3-5次。本发明步骤(1)中合并提取液并减压浓缩至原体积的1/5-1/3，得多糖以及黄酮的浓缩液。本发明步骤(1)中所述的大孔树脂的型号优选为AB-8、D101或X-5。本发明步骤(1)中先用蒸馏水洗脱桑叶和桑葚多糖至洗脱液无苯酚-硫酸反应，得到的多糖洗脱液经醇沉、离心和干燥得多糖粉末，醇沉时的乙醇的体积浓度优选为 70-80%，醇沉的时间优选为20-24h ；用乙醇洗脱桑叶和桑葚黄酮时，乙醇的体积浓度优选为 60-80%ο本发明步骤O)中桑叶和桑葚残渣与乙醇-盐酸溶液的质量比优选为1 :10_30， 其中乙醇的体积浓度优选为10-30%，盐酸的浓度优选为0.03-0. 10 mol/L，提取的次数优选为3-5次。本发明步骤O)中合并提取液并减压浓缩至原体积的1/5-1/3，得生物碱浓缩液。本发明步骤O)中所述的阳离子交换树脂的型号优选为001X7或001X8。本发明步骤O)中氨水洗脱时的氨水浓度优选为0. 1-0. 5 mol/L。本发明步骤(1)-步骤O)中干燥的方式为冷冻干燥、喷雾干燥或真空干燥。与现有技术相比，本发明具有如下优点(1)本发明提取方法操作简单，设备没有特殊要求；(2)本发明提取方法采用树脂进行活性物质的分离，所采用的树脂可以再生重复使用， 有利于减少生产成本；(3)本发明提取方法采用大孔树脂分离桑叶和桑葚多糖，可达到脱色和脱蛋白的效果， 减少了额外的对桑叶和桑葚多糖的脱色操作；
(4 )本发明提取方法所用的试剂安全无毒，绿色环保，可用于工业化生产。

下面将结合
进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不仅局限于此
实施例1
取晒干粉碎的桑叶、桑椹混合物(质量比为8:2)lkg，加入10重量倍的蒸馏水于60°C下提取120min，提取三次，合并水提取液并减压浓缩至提取液原体积的1/3，得桑叶和桑葚的多糖以及桑叶和桑葚的黄酮的混合浓缩液。将上述浓缩液加入大孔树脂AB-8吸附，用蒸馏水洗脱树脂至洗出液无色，并且使洗脱液无苯酚-硫酸反应，采用蒸馏水洗涤还可以同时达到脱去蛋白和脱色的作用，收集水洗脱液，得到桑叶和桑葚多糖洗脱液，在桑叶和桑葚多糖洗脱液中加入无水乙醇至乙醇体积浓度为80%，醇沉Mh，离心得到沉淀，沉淀冷冻干燥得到天然α -葡萄糖苷酶抑制剂桑叶和桑葚多糖粉末45. Sg,收率4. 58% ；然后用体积浓度为60%的乙醇洗脱树脂至洗脱液无色，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至浸膏，冷冻干燥浸膏得到天然α -葡萄糖苷酶抑制剂桑叶和桑葚黄酮粉末18. 9g，收率1. 89%。蒸馏水提取后的残渣用其10重量倍的乙醇体积浓度为10%的乙醇-盐酸溶液(盐酸的浓度为0. 05 mol/L)提取90min，提取三次，合并乙醇-盐酸提取液并减压浓缩至提取液总体积的1/3。将浓缩液加入阳离子交换树脂001 X 7，用浓度为0. 3mol/L的氨水溶液洗脱树脂至洗脱液无色，收集氨水洗脱液，减压浓缩至浸膏，冷冻干燥浸膏得到天然α -葡萄糖苷酶抑制剂桑叶和桑葚的生物碱粉末3. 2g，收率0. 32%。实施例2
取晒干粉碎的桑叶、桑椹混合物(质量比为7 3)lkg，加入15倍重量的蒸馏水于80°C下提取90min，提取4次，合并水提取液并减压浓缩至提取液总体积的1/4。将浓缩液加入大孔树脂DlOl吸附，用蒸馏水洗脱树脂至洗出液无色，并且使洗脱液无苯酚-硫酸反应，采用蒸馏水洗涤还可以同时达到脱去蛋白和脱色的作用，收集水洗脱液，加入无水乙醇至乙醇的体积浓度为70%，醇沉Mh，离心得到沉淀，沉淀冷冻干燥得到天然α -葡萄糖苷酶抑制剂桑叶和桑葚多糖粉末48. 3g，收率4. 83% ；然后用体积浓度为70%的乙醇洗脱树脂至洗脱液无色，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至浸膏，冷冻干燥浸膏得到天然α-葡萄糖苷酶抑制剂桑叶和桑葚黄酮粉末17. 5g，收率1. 75%。蒸馏水提取后的桑叶和桑葚残渣用其20倍重量的乙醇体积浓度为20%的乙醇-盐酸溶液(盐酸的浓度为0. 08mol/L)提取120min，提取4次，合并乙醇-盐酸提取液并减压浓缩至提取液总体积的1/4。将浓缩液加入阳离子交换树脂001 X 7，用浓度为0. 4mol/ L的氨水溶液洗脱树脂至洗脱液无色，收集氨水洗脱液，减压浓缩至浸膏，冷冻干燥浸膏得到天然α -葡萄糖苷酶抑制剂桑叶和桑葚生物碱粉末3. 0，收率为0. 30%。实施例3
取晒干粉碎的桑叶、桑椹混合物(质量比为6 4)lkg，加入其25倍重量的蒸馏水于70°C 下提取80min，提取5次，合并水提取液并减压浓缩至提取液总体积的1/5。将浓缩液加入大孔树脂X-5吸附，用蒸馏水洗脱树脂至洗出液无色，并且使洗脱液无苯酚-硫酸反应，采用蒸馏水洗涤还可以同时达到脱去蛋白和脱色的作用，收集水洗脱液，加入无水乙醇至乙醇的体积浓度为75%，醇沉Mh，离心得到沉淀，沉淀冷冻干燥得到天然α -葡萄糖苷酶抑制剂多糖粉末50. 3g，收率5. 03% ；然后用体积浓度为80%的乙醇洗脱树脂至洗脱液无色，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至浸膏，冷冻干燥浸膏得到天然α-葡萄糖苷酶抑制剂黄酮粉末
518. 5g，收率 1. 85%。蒸馏水提取后的桑叶和桑葚残渣用其30倍重量的乙醇体积浓度为30%的乙醇-盐酸溶液(盐酸的浓度为0. 10 mol/L)提取150min，提取2次，合并乙醇-盐酸提取液并减压浓缩提取液总原体积的1/5。将浓缩液加入阳离子交换树脂001X8，用浓度为0. 5mol/ L的氨水溶液洗脱树脂至洗脱液无色，收集氨水洗脱液，减压浓缩至浸膏，冷冻干燥浸膏得到天然α -葡萄糖苷酶抑制剂生物碱粉末3. Ig,收率0. 31%。以下通过试验来验证桑叶和桑葚活性物质的α -葡萄糖苷酶抑制活性 1、实验方法
1)溶液的配制
缓冲液称取IM磷酸二氢钾38. 5mL与IM磷酸氢二钾61. 5mL，加水溶解成lOOOmL，pH 计测得其值为7.0 (20°C)，4°C保存；
底物0. Imol. Γ1磷酸盐缓冲液中加0. 05mmo L PNPG (化学名称是对硝基苯基-D-葡萄糖苷)，精密称量后缓冲液定容到lOOmL，溶解，4°C保存；
阳性对照取拜糖平片，溶于蒸馏水过滤，终浓度50mg/mL置小三角瓶中，现用现配； 样品溶液配制取各组样品配制成终浓度lOmg/mL的溶液； 酶溶液0. lmol/L磷酸盐缓冲液中加α -葡萄糖苷酶至1 U/mL ；
2)检测流程
1.酶标板冰浴加样，取20PL缓冲液，酶液，底物溶液气浴恒温37 °C，5 min，加入阳性对照(拜糖平)20 μ L，反应5 min ；
II.酶标板冰浴加样，取20μ L缓冲液，酶液，底物溶液气浴恒温37 °C，5min，加入样品液20 μ L，反应5 min ；
III.以酶标板第一列为空白，与上同步加入60μ L缓冲液，20 μ L酶液。第二列作为阴性对照，与上同步加入40 μ L缓冲液，20 μ L酶液和20 μ L底物溶液。IV.在反应时间达到后立即将酶标板置于405 nm下检测各组吸光度值。3)抑制率计算
抑制率=[1 一(样品OD —样品对照OD)/ (阴性对照OD-空白0D) ] X 100%
2、实验结果
实验所用样品为实施例1中提取获得。实验分组为多糖组，黄酮组，生物碱组，多糖黄酮组，多糖生物碱组，黄酮生物碱组，混合组(1:1:1)，实验结果见下表1。表1桑叶和桑葚降血糖活性物质的α -葡萄糖苷酶抑制活性


一种连续提取天然α-葡萄糖苷酶抑制剂的方法，含以下步骤(1)取桑叶和桑葚，用热水反复浸提，合并提取液并减压浓缩得多糖及黄酮的浓缩液，将混合浓缩液经大孔树脂吸附，先用蒸馏水洗脱，得到多糖洗脱液，再用乙醇洗脱，得黄酮洗脱液，多糖洗脱液经醇沉、离心和干燥得天然α-葡萄糖苷酶抑制剂多糖粉末，黄酮洗脱液经减压浓缩和干燥得天然α-葡萄糖苷酶抑制剂黄酮粉末；(2)将桑叶和桑葚残渣用乙醇-盐酸溶液反复提取，合并提取液并减压浓缩得桑叶和桑葚生物碱浓缩液，将生物碱浓缩液经阳离子交换树脂吸附，用氨水洗脱，将氨水洗脱液经减压浓缩和干燥后，获得天然α-葡萄糖苷酶抑制剂生物碱粉末。该方法操作简单、安全性高，成本低。