新颖的适用于多种微生物发酵的补料调控工艺的制作方法[0002]众所周知，随着科学技术的迅猛发展，微生物发酵已被广泛地运用到生物制药工业、生物酶和蛋白质工业、轻工业(包括如味精、柠檬酸、山梨醇、氨基酸、酵素、多元醇、淀粉糖等等)、现代农业、现代生物能源产业、环保工业等等，并发挥着越来越大的作用，创造着巨大的经济效益和社会效益。[0003]由于我们毕业于沈阳药科大学制药系微生物制药专业，具有多年的微生物发酵知识和生产经验的沉淀与积累，并在加拿大、墨西哥、美国长期参加发酵项目的研修，进而拓宽了我们创新思路和成功实践。掌握了具有自己独立知识产权的完整的发酵补料技术。[0004]我们应用新颖的适用于多种微生物发酵的补料调控工艺，取得了以下成功案例:1.我们把这项新颖的适用于多种微生物发酵的补料调控工艺，运用到对葡萄糖具有抑制菌体生长和产物生成的(Wild-type and transconjugate F.heparinum for)肝素酶(heparinasesl, II&III)和硫酸软骨素酶(chondroitinases AC&B)发酵生产上，酶产量提高了 4倍。[0005]2.我们把自行设计、开发的新颖的PH调控、溶氧调控D0、呼吸商(RQ)补料调控工艺应用于13种微生物、40多个酶、蛋白质或疫苗从6升到190吨不同生产规模的实际运用，取得了在无纯氧补充的条件下，E.coli菌浓(0D600)达到180-220 0D, 10-15g/L,可溶性酶蛋白占总蛋白表达量的25% ;毕赤酵母(pichia pastoris)菌浓(0D600)达到600-900，酶蛋白表达 6-lOg/L; S.pombe350_550 0D,酶蛋白表达量 7_8g/L;F.beparinum, > 100 0D,酶蛋白表达量> 13倍；假单抱菌(pseudomonas fIuorescens)菌浓(0D575)高达250-3500D，酶蛋白表达15-17g/L ;在青霉素发酵生产上，产量比国内产量提高I倍，生产成本降低40%。[0006]3.我们运用新颖的呼吸商(RQ)补料调控工艺，应用到酵母菌(schizosaccharomyces pombe)发酵生产中，使生产成本降低60%,产量提高了 5倍。
[0007]4.到目前为止，我们已有40多个课题，超过13种微生物，累计有近万批次的不同规模的发酵，已应用过该补料工艺，积累了多次> 3000倍的放大成功经验，用自己编程的同一 Deltar-V自动化控制系统在发酵生产中成功运用。


[0008]新颖的适用于多种微生物发酵的补料调控工艺。其中包括新颖的溶氧调控(D0)、PH调控、呼吸商调控(RQ)以及混合调控等多种补料工艺。目前处于世界领先水平。
[0009]1.我们把这项新颖的适用于多种微生物发酵的补料调控工艺，运用到对葡萄糖具有抑制菌体生长和产物生成的(Wild-type and transconjugate F.heparinum for)肝素酶(heparinasesl, II&III)和硫酸软骨素酶(chondroitinases AC&B)发酵生产上,酶产量提高了 4倍。
[0010]2.我们把自行设计、开发的新颖的PH调控、溶氧调控D0、呼吸商(RQ)补料调控工艺应用于13种微生物、40多个酶、蛋白质或疫苗从6升到190吨不同生产规模的实际运用，取得了在无纯氧补充的条件下，E.coli菌浓(0D600)达到180-220 0D, 10-15g/L,可溶性酶蛋白占总蛋白表达量的25% ;毕赤酵母(pichia pastoris)菌浓(0D600)达到600-900，酶蛋白表达 6-lOg/L; S.pombe350_550 0D,酶蛋白表达量 7_8g/L;F.beparinum, > 100 0D,酶蛋白表达量> 13倍；假单抱菌(pseudomonas fIuorescens)菌浓(0D575)高达250-3500D，酶蛋白表达15-17g/L ;在青霉素发酵生产上，产量比国内产量提高I倍，生产成本降低40%。
[0011]3.我们运用新颖的呼吸商(RQ)补料调控工艺，应用到酵母菌(schizosaccharomyces pombe)发酵生产中，使生产成本降低60%,产量提高了 5倍。
[0012]4.到目前为止，我们已有40多个课题，超过13种微生物，累计有近万批次的不同规模的发酵，已应用过该补料工艺，积累了多次> 3000倍的放大成功经验，用自己编程的同一 Deltar-V自动化控制系统在发酵生产中成功运用。
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图1和图2等图片是我们在国外发酵生产现场，运用新颖的适用于多种微生物发酵的补料调控工艺所进行的典型发酵图谱和混合调控发酵图谱图片；图3、图4、图5是我们使用过的15L、93KL、190KL发酵罐图片。我们在此声明图片真实有效。
[0014]图1 典型的发酵图谱
图2 混合调控发酵图谱` 图3 15L发酵罐 图4 93KL发酵罐 图5 190KL发酵罐。

[0015]1.应用原理
我们是运用葡萄糖或其它碳源对菌体生长以及产物生成的调控原理，经实践上的不断总结和完善，研制开发出的新颖的适用于多种微生物发酵的补料调控工艺，包括PH调控、溶解氧调控(DQ)、呼吸商调控(RQ)以及混合调控，借助于特有的计算机软件，对发酵过程进行全程实时调控，可解除或部分解除发酵副产物对菌体生长和产物生成的抑制，从而达到了降低成本，提高产量之目的。
[0016]2.补料工艺是控制发酵中间代谢，提高产量的一个灵活有效的手段。当然，应视其具体菌种或培养条件，来确定最适的补料时间、补料种类、补料方式和补料量。我们选择具有控制准确、重复性好的反馈控制、混合调控、FBC等补料方法，利用计算机特有软件，可以实现在线检测溶氧、PH、温度、呼吸商等各种参数，实时自动进行科学补料。
[0017]3.PH 调控
发酵过程是个极其复杂的微生物生物化学反应过程，而PH也是一个不断变化的重要指标。发酵液中的PH值对微生物生长及生成物合成影响很大，必须进行有效控制。在发酵过程中，由于复杂的生化反应过程,往往会使PH值降低，此时需要加入铵来调整，使PH值发生改变，从而启动控制开关，开始补料，使PH值恢复至恒定值。比如，我们通过反馈控制补加葡萄糖，维持大肠杆菌发酵液的恒定。结果推迟了比生长速率下降的时间，细胞密度是间歇发酵的8倍。又比如我们还根据营养物摄取或需求量来控制补料，也收到很好的效果。[0018]4.溶解氧调控(DO)
溶解氧浓度与发酵液营养物利用程度直接相关，以溶解氧浓度作为补料开关则是根据培养基中的碳源的消耗，会导致溶解氧浓度迅速改变。一般而言，PH与溶解氧是紧密联系在一起的。我们在发酵培养中通过保持适当的溶解氧45%，以溶氧值在线反馈控制搅拌速度及流加补料培养基，使细菌保持适当的比生长速率，成功的进行了工程菌高密度培养。其中难点在于发酵过程中溶氧和搅拌转速出现类似波浪起伏(Cyeling)现象如何解决。
[0019]5.呼吸商调控(RQ)
发酵过程中菌的耗氧速率our可以通过质谱仪测量进气和排气中的氧含量计算而得，并最终计算出呼吸商RQ。
[0020]RQ，作为菌的生长代谢重要指标，非常重要。一般而言:酵母发酵RQ=1，糖有氧代谢，仅生成菌体，无产物生成；RQ > 1.1，糖经EMP生成乙醇。不同基质，菌的RQ不同。EC0.LI = 1.11，以延胡索酸为基质，RQ=L 44 ;以丙酮酸为基质，RQ=L 26;以琥珀酸为基质RQ=L 12 ;以乳酸、葡萄糖为基质，RQ=L 02和1.00。
[0021]在抗生素发酵生产中，由于存在菌体生长、维持及产物形成的不同阶段，其RQ值也不一样。就青霉素发酵的理论呼吸商而言:菌体生长为0.909，菌体维持为1，青霉素合成为4。从上述情况来讲，发酵早期，主要是菌生长，RQ < I ;过渡期菌体维持其生命活动，产物逐步形成，基质葡萄糖代谢不仅仅用于菌体生长，RQ比生长期略有增加。产物形成对RQ的影响较为明显，如产物还原性比基质大，RQ增加；产物氧化性比基质大，RQ减少。其偏离程度取决于每单位菌体利用基质所形成的产物量。
[0022]RQ是碳-能源代谢情况的指示值。在碳-能源限制及供氧充分的情况下，碳-能源趋向完全氧化，RQ应达到完全氧化的理论值，请见表1。如果碳-能源过量或供氧不足，可能会出现碳-能源不能完全氧化的情况，从而导致RQ异常。
表1 一些碳-能源基质的理论呼吸商
讓能.Iffftii mt&& iififtiifi
If萄* 1.0 乳酸1.0
Ii 糖 1.0 Ullil0.86
I Ii貌 0.5植物_ 0.7
Ψ 醇 0,67
然而，由于发酵过程中经常使用消沫剂，因它具有不饱和性和还原性，使RQ值低于葡萄糖为唯一碳源时的RQ值。在实际青霉素发酵时，RQ 一般在0.5-0.7，并随葡萄糖和消沫剂的加入量之比而波动。
[0023]6.在实际生产中，我们采取FBC(fed-batchculture，简称FBC法)补料法，它具有以下优势:1)可以解除底物抑制、产物反馈抑制和分解代谢物的阻遏。2)可以避免在分批发酵中因一次投料过多造成细胞大量生长所产生的一切影响，改变发酵流变学的性质。3)作为控制细胞质量的手段，以提高孢子发芽的比例。4)可使发酵过程最佳化。
[0024]7.我们使用自行编程的Delta-V自动化控制系统，它是借助由电子化仪表和电子计算机组成的控制器，操纵其中一些关键变量，使发酵过程向着预定目标发展。它包括以下三方面内容:第一和过程的未来状态或者目标相联系(如要求控制的各种参数)；第二和一组可供选择的控制动作(如阀门的开、关，泵的开、停等)相联系；第三是一种能够预测控制动作对过程状态影响的模型(如用加入基质的浓度和速率来控制细胞生长速率时所能表达它们相关之间的数学式)。这三者关系是相互联系、相互制约的，组成具有特定功能的自控系统。其作用是:1)从发酵过程中采集和存储数据；2)用图形和列表的方式显示存储的数据；3)对存储数据进行各种处理和分析；4)与检测仪表和其它计算机系统进行通讯；5)对模型和其参数进行识别；6) 实施复杂控制算法；7)下达控制操作指令。