专利名称：一种富硒海带及其培养生产方法和应用的制作方法 硒对人体的健康保健作用已经积累了大量的文献与临床研究资料，缺硒会导致人体生长发育停滞、免疫力降低、劳累后头晕、心悸、疲乏、气短、恶心外，缺硒或硒不足时还可引起老年性白内障，好发生近视眼。研究显示血液中硒明显低于正常人之疾病有慢性肝炎、类风湿性关节炎、克山病、肿瘤、孝喘、糖尿病、心血管疾病、红斑性狼疮、衰老等。低硒或缺硒人群通过适量补硒不但能预防各类肿瘤的发生，而且可以提高机体免疫能力，维持心、肝、肺、胃等重要器官的正常功能，预防多种老年性心、脑血管疾病的发生，也可以多种地方性疾病，硒对预防白内障、增加甲状腺功能等生物学活性也有较多的报道，参见Combes G F，Grey W P.1998.Chemopreventive AgentsSelenium.Pharmacological Therapy 79179-192.以及Ganther H E，Lawrence J R.1997.Chemical Transformations of Selenium in Living OrganismsImproved Forms of Seleniumfor Cancer Prevention.Tetrahedron 5312299-12310。同时硒对于动物，包括陆地动物如牛、羊、猪、鸡以及水产动物如鲍鱼等的生长发育也具有重要的调控功能。硒元素在地球的表面分布极不均匀，全世界约有72％的土壤缺硒，造成40多个国家缺硒，我国缺硒省份高达22个，有72％的土地面积处于严重缺硒和低硒地带，造成农产品硒含量极低，此外由于环境污染及其它原因也会导致人体″非地源性″的缺硒。大多数人群体内缺硒，免疫力低下，诱发多发种疾病的发病率升高。我国微量元素与健康学会理事长于若木指出″中国是一个缺硒大国，人体补硒是关系到亿万人民身体健康的大事，我们应当像补碘那样抓好补硒工作。特别要注意老年人的补硒工作。目前我国人均硒摄入量应为每日50--200微克，如人体每日硒摄入量长期低于50微克，将诱发癌症、肝病、心脑血管、糖尿病等多种疾病发病率升高，因此科学补硒与人体健康有直接的关系。目前富硒食品的研究主要集中在利用生物工程手段来定向地培育富硒生物，特别是植物。通过设计富硒的培养条件及吸收同化的生化调空手段，将硒在植物的生长过程中成功地导入其体内，形成生物体硒库。通过每天摄入一定量的富硒食品就能达到理想的补硒效果，从而实现强身健体、延长寿命的作用。国内外富硒食品主要是陆地植物(如西兰花、蘑菇、大蒜)、鸡蛋、酵母等，参见Finley J W，Ip C，Lisk D J，DavisC D，Hintze K J，Whanger P D，2001.Cancer-Protective Properties of High-SeleniumBroccoli.J Agric Food Chem 49(5)2679-2683；Spolar M R，Schaffer E M，Beelman R B，Milner J A.1999.Selenium enriched Agaricus bisporus mushrooms suppress 7，12-dimethlybenz(A)anthracence bioactivation in mammary tissue.Cancer Letters 138145-50；Ip C，Birringer M，Block E，Kotrebai M，Tyson J F，Uden P C，Lisk D J.Chemical 2000，Speciation Influences Comparative Activity of Selenium Enriched Garlic and Yeast inMammary Cancer Prevention.J Agric Food Chem 482062-2070。有关陆地动植物的富硒产品的发明专利已经有多项，例如，专利号为85108031，85107995，92105296，93110299的中国发明专利分别报道了高硒禽蛋肉、富硒麦芽、富硒鸡蛋、富硒大蒜芽等的生产方法。但是，陆地动植物在富硒技术方面也存在无法避免的弱点，即高浓度的无机硒会对土壤以及水源产生毒害作用。因此，开发研究富硒新技术始终是目前富硒食品的一个重要课题。形成更加完善的富硒新技术的一个关键问题是选择更加合适的生物材料，避免现有技术的弱点，发挥新材料富硒能力高的特点，特别是利用海洋生物的富硒产品研究很少，专利号为92112160的中国发明专利报道了螺旋藻的富硒技术，但是微型藻类的生物量较少，生产培养比较困难，生产成本较高，功能比较单一，主要是富集硒，限制了其推广应用。而大型海藻作为富硒技术的生物原料报道甚少。专利号为01115065.3的中国发明专利报道了富含有机硒的食用海藻养殖方法，但是对目标材料没有明确，只是一种与其他陆地植物雷同的富硒方法描述，获得的富硒海藻的硒含量偏低，同样存在上述的生物量较少、生产培养比较困难、生产成本较高等问题。相反在大型经济海藻中，海带由于养殖速度快、生物量是理想的生物材料。海带被称为″元素富集器″，许多陆地植物非常缺乏的微量元素都能够在海带中得到富集，它的高富集能力来自与海带独特的细胞壁组成以及海带快速的生长速度。海带的细胞壁多糖(褐藻胶)和间质多糖(褐藻多糖硫酸酯)使海带形成一种完全不同于陆地植物的细胞结构，可以实现更加快速、高效的元素交换和富集，并且在快速的生长过程中使吸收的微量元素得到有效的同化，形成有机态的元素复合体。
本发明所要解决的首要技术问题是提供一种富硒海带，它利用海带养殖速度快、高富集能力、成本低廉特点，将许多陆地植物非常缺乏的微量元素如碘、硒都能够在海带中得到富集，并且在快速的生长过程中使吸收的微量元素得到有效的同化，形成有机态的元素复合体，从而解决利用一般微型藻类进行富集硒元素存在一些如生物量较少，生产培养比较困难，生产成本较高的缺陷。本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种方法简单、容易实施、不会造成土壤无机硒过量累积的环境毒害、培养生产效率高、成本低廉的富硒海带的培养生产方法。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种上述富硒海带的应用。
本发明解决上述首要技术问题所采用的技术方案为一种富硒海带，其特征在于活体海带在无机硒溶液加富的海水培养基中培养后得到一种海带，其海带的硒含量明显增加，在优化的培养基与培养条件下，可以使硒含量增加50倍以上，同时有机硒的比例达到68-73％，其中有机硒主要是与蛋白质、碳水化合物、脂类相结合，以蛋白结合态为最多。
本发明解决上述再一个技术问题所采用的技术方案为一种生产上述的富硒海带培养生产方法，其特征在于将活体海带在无机硒溶液加富的海水培养基中培养1小时以上得到了富硒海带，其中无机硒溶液的使用浓度为30-1000mg/L。
较好地，上述的活体海带在海水培养基中培养3至56小时，最佳是培养3小时。
上述的无机硒溶液选用亚硒酸钠溶液，并可在亚硒酸钠溶液添加作为增加氮或/和磷的营养盐，它可选用增加氮肥的硝酸钠，其浓度控制在10-300mg/L，还可以选用增加磷肥的磷酸二氢钠，其浓度控制在5-150mg/L。
作为优化的实施方案，指选择亚硒酸钠溶液的最佳浓度，合适的培养时间及对营养元素的调整，使海带的硒含量相对其本底有明显的增加，合适条件下可以增加50倍以上，这里选择亚硒酸钠溶液的最佳浓度为200mg/L，培养时间为3-56小时，最佳处理时间为3小时，在亚硒酸钠溶液中适当添加氮磷可以使使海带的硒含量有明显的增加，同时有机硒的含量也增加，最佳的氮磷浓度为硝酸钠150mg/L，磷酸二氢钠25mg/L条件下，硒的富集被率可以增加50倍以上，同时有机硒的比例达到68-73％。
上述的活体海带是指养殖区现场采集的鲜活海带，采集季节可以是在每年的3月至5月期间，可以放入室内或室外的海水中暂养，仍然保持健康活体的状态。
本发明解决上述另一个技术问题所采用的技术方案为这种经过生物富集转化的富硒海带，可以作为补硒的天然生物原料，广泛应用于各种保健食品、饮料、以及动物饲料添加剂中，同时可以更好地应用于防治碘缺乏病、硒缺乏病等地方性疾病。
与现有技术相比，发明的优点在于1、本发明采用中国产量最大的经济海藻海带为原料，可以发挥藻类吸收微量元素速度快、效率高的特点。2、本发明的富硒海带由于本身含有丰富的碘元素，可以发挥这两种微量元素的综合生物活性效果，更有效地用于防治碘缺乏病、硒缺乏病等地方性疾病。3、本发明所采用的技术只需要在海水中暂养3-56个小时，不会造成其他陆地生物在土壤中施用过量无机硒所造成的环境毒害，产品安全无毒。4、本发明所获得的富硒海带中有机硒的含量达到68-73％，可以广泛应用于保健食品、饮料、以及动物饲料添加剂中。

以下结合附图
实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例一1.海带在不同亚硒酸钠浓度下的富集实验将活体海带(Laminaria japonica)在含有不同浓度Na2SeO3的海水中进行活体培养，处理56小时后，采集样品进行硒含量测定。
2.海带中硒含量的测定采用石墨炉原子吸收光度计测定硒含量。具体操作如下精确称取同一部位样品0.5克，置于具有聚四氟乙烯内筒的高压消解罐中，加入1.0毫升硝酸，4.0毫升过氧化氢(优级纯)，使用美国CEM公司2000型微波消解仪进行消化，消化完成后使用美国瓦里安Varian-220E型石墨炉原子吸收光度计测定硒含量，以钯(Pb100μg/ml)作为基体改进剂。
3.实验结果表明海带在不同的亚硒酸钠浓度下具有很大的吸收差异，随着亚硒酸钠浓度从0增加至200mg/L，海带对于硒的富集呈显著增加的趋势，当亚硒酸钠浓度超过200mg/L后，海带对硒的吸收不仅没有继续增加，而且有少量下降，这可能与高浓度亚硒酸钠对海带有潜在的生理毒性有关。据此确定亚硒酸钠的最佳实施浓度为200mg/L左右。在本实施例后所进行的其他实验中，基本以200mg/L亚硒酸钠为作用浓度。
表1海带在不同浓度亚硒酸钠条件下对硒的富集总量(μgg-1wet wt)

实施例二1.海带在不同浸泡时间的富集实验将活体海带浸泡在含200mg/L Na2SeO3的海水中，于浸泡第3，6，12，20，32，48，56小时剪取茎部5克进行总硒测定。
2.海带中硒含量的测定同实施例一。
3.实验结果表明海带在200mg/L Na2SeO3的海水中，经过3小时左右的浸泡就可以达到硒的富集平衡点。以后直至56小时，海带对硒的吸收仍然有少量增加。考虑到实施效率，以3小时为最佳吸收时间，富硒倍率达到50倍。
表2不同时间海带对硒的富集总量(μgg-1wet wt)

实施例三1.在海水介质中增加营养盐对海带富硒的影响海带浸泡在添加N-P营养盐(NaNO3+NaH2PO4)的含硒(200mg/L Na2SeO3)海水中，于56小时后从横向剪取茎部5克进行总硒测定。
2.海带中硒含量的测定同实施例一。
3.实验结果表明海带在不同的氮磷营养盐加富条件有较大的吸收变化。N-P营养盐浓度影响海带对硒的富集，随着NaNO3浓度的增加，NaH2PO4浓度的降低，海带富集的总硒量增加。在NaNO3浓度为150mg/L，NaH2PO4浓度为25mg/L时，总硒含量最大，为33μgg-1wet wt，当NaNO3的浓度继续增加，NaH2PO4浓度继续降低，海带总硒含量又有所下降。这说明提高海带生长代谢能提高对硒的富集，而且N的影响作用要高于P，P浓度过大也可能限制海带对硒的富集，而当N浓度继续增加，海带富硒能力下降，表明N浓度过大也会限制海带对硒的富集。最佳实施值为NaNO3150mg/L，NaH2PO425mg/L，可以使硒的吸收倍率提高160％。
表3.不同N-P营养盐条件下海带对硒的富集总量(μgg-1wet wt)

实施例四1.海带不同部位富硒的影响海带浸泡在含200mg/L Na2SeO3的海水中，56小时后取出，从横向剪取底部、中部和顶部各5克，测定总硒含量。
2.海带中硒含量的测定同实施例一。
3.实验结果表明海带虽然没有真正的根、茎、叶的差异，但是，对于海带叶状体来说，可以很方便地将叶状体区分为顶部、中部与底部。试验测定了海带的三个不同部位的总硒含量，结果表明富硒前后，不同部位之间的总硒含量相差不大，未富硒的海带总硒含量在0.45～0.60μgg-1wet wt之间，在含200mg/LNa2SeO3的海水中富硒56小时，总硒含量在20.56～23.34μgg-1wet wt之间，这说明海带整体对硒都有富集能力。因此，海带叶状体全体都具有比较显著的富硒能力。
表4.海带各部位的总硒含量(μgg-1wet wt)

实施例五1.富硒海带中硒的化学状态对于富硒实验后的海带叶状体进行了不同化学成分的分类提取，分别制备样品。首先制备无机物+小分子有机物加入50ml蒸馏水匀浆，添加无水乙醇至终浓度为70％，25℃搅拌12h，过滤。滤渣用无水乙醇25℃搅拌6h，过滤。合并滤液，402旋转蒸发除去乙醇，沉淀为色素，用1∶1V/VCHCl3/CH3OH溶解，过滤后的滤液冷冻干燥得到上述样品。其次制备脂类在上述过程中过滤得到的滤渣用1∶1(V/V)CHCl3/CH3OH(3×50ml)提取，25℃搅拌12h，过滤，滤液40℃旋转蒸发除去CHCl3/CH3OH，与上述色素合并，作为脂类。在次制备蛋白质成分将滤渣60℃烘干，加入含0.1％SDS，0.1MTris/HCl(pH＝9.0)溶液(3×50ml)提取，25℃搅拌24h，过滤。滤液透析后冷冻干燥获得。上述提取过程所留滤渣作为多糖成分。
2.不同化学成分中的硒含量测定同实施例一。其中″无机物+小分子有机物″在硒含量测定过程中分别进行消化与不消化处理的分别测定，以此来测定无机硒含量，及无机硒与小分子有机硒的总含量，再扣除无机硒含量得到小分子有机硒的含量。
3.实验结果表明从试验结果可以看到富硒前，海带在各个组分中的硒含量都明显低于富硒海带，其中无机硒含量最低，仅0.03μgg-1wet wt，占总量的4.85％；其次是脂结合硒0.03μgg-1wet wt，仅占5.63％；硒主要与蛋白质，糖和氨基酸结合，特别是蛋白结合硒0.25μgg-1wet wt，占总量的47.57％，；水溶性有机硒包括小分子糖和氨基酸结合硒，含量为0.12μgg-1wet wt，占总量的22.91％；多糖中也含有一定量的硒0.05μgg-1wet wt，占总量的10.11％；整个试验中损失量为8.93％。一般的富硒组中硒的含量得到了很大的提高，富集倍率达到近50倍，而通过特殊营养条件增强的富硒组不仅硒的富集倍率达到了60多倍，而且增加部分集中在有机硒组分。
表7富硒海带中各生化组分的硒含量及所占百分率(μgg-1wet wt)

*()内为所各生化组分中硒含量在总硒含量中所占的百分比。一般富硒组是指海带在含有200mg/L Na2SO3的海水中富集56h，增强富硒组是指海带在含有200mg/LNa2SO3，150mg/L NaNO3，25mg/L NaH2PO4的海水中富集56h，损失量是指上述测定的无机硒、水溶性有机硒、脂结合硒、蛋白结合硒、多糖结合硒相加后的总量与总硒测定值之间的差值与百分比。


本发明涉及一种新型富硒海带和海带对微量元素硒的富集方法及其应用技术领域。该富硒海带通过活体海带在高浓度的无机硒培养基中进行一定时间的培养，可以使海带的硒含量明显增加，在优化的培养基与培养条件下，可以使硒含量增加50倍以上，同时有机硒的比例也同时增加。这种经过生物富集转化的海带，可以作为补硒补碘的天然生物原料，广泛应用于各种保健食品、饮料、以及动物饲料添加剂中。