专利名称：一种从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组dna的方法图1利用本发明方法从不同水稻品种(品系)单粒稻米胚乳中提取基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图(M :DNA分子量标准，100-5，000 bp ； 1-6 镇稻88，南粳44，南粳45，宁9108，南粳5055， 南粳46)图2 以不同水稻品种(品系)单粒稻米胚乳中提取的基因组DNA为模板扩增微卫星 (SSR)分子标记的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(A :RM495 ；B :RM7286)(Μ :DNA分子量标准，50 bp ladder ； 1-6 镇稻88，南粳44，南粳45，宁9108，南粳5055， 南粳46)图3以不同水稻品种(品系)单粒稻米胚乳中提取的基因组DNA为模板扩增水稻低直链淀粉含量基因Wx-mq的琼脂糖凝胶电泳图(M :DNA分子量标准，100-2，000 bp ； 1-6 镇稻88，南粳44，南粳45，宁9108，南粳5055， 南粳46)图4以不同水稻品种(品系)单粒稻米胚乳中提取的基因组DNA为模板扩增水稻胚乳蛋白合成基因彻^7的琼脂糖凝胶电泳图(M :DNA分子量标准，100-5，000 bp ； 1-6 镇稻88，南粳44，南粳45，宁9108，南粳5055， 南粳46)
五
为充分公开本发明一种从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法，以下结合方法验证和实施实例加以说明。(一)试验材料
镇稻88 (直链淀粉含量正常的中熟中粳品种，江苏省镇江市农业科学研究所)，南粳45 (直链淀粉含量正常的迟熟中粳品种，江苏省农业科学院粮食作物研究所)，南粳44 (直链淀粉含量正常的早熟晚粳品种，江苏省农业科学院粮食作物研究所)，宁9108 (低直链淀粉含量迟熟中粳品系，江苏省农业科学院粮食作物研究所)，南粳5055 (低直链淀粉含量早熟晚粳品种，江苏省农业科学院粮食作物研究所)，南粳46 (低直链淀粉含量中熟晚粳品种，江苏省农业科学院粮食作物研究所)
以上材料均为公知公用材料，江苏省农业种质资源中期库可免费提供。具体参考文献为胡春明等，中粳稻镇稻88育种实践的分析与启示，江西农业学报，2008,20 (11)47-49;仲维功等，粳稻新品种南粳45的选育及栽培技术，江苏农业科学，2009 (5) 123-125 ；王才林等，抗条纹叶枯病水稻新品种南粳44的特征特性与栽培技术，江苏农业科学，2007，2 :43-44 ；姚姝等，分子标记辅助选择聚合水稻暗胚乳突变基因和抗条纹叶枯病基因份广厂‘，中国水稻科学，2010，24 (4) =341-347 ；http //cnpvp. cn/ (品种权号 CNA20070694. 2)；
抗条纹叶枯病优良食味晚粳稻新品种南粳46的特征特性与栽培技术，江苏农业科学， 2008,2 :91-92)。(二)单粒稻米胚乳基因组DNA的提取
1)取镇稻88，南粳44，南粳45，宁9108，南粳5055，南粳46六个不同水稻品种(品系) 的干种子用糙米机去除谷壳，然后用精米机去除种皮和胚，得到与市售稻米一样，仅保留胚乳组织的精米；
2)不同品种(品系)的精米各取一粒经牛皮纸包裹后，用研磨棒砸碎后装于1.5mL离心管，加入800 μ L洗涤液，于摇床上低速(120 rpm)振荡5 min，4，000 rpm离心2 min，丢弃上清液，收集沉淀物备用。其中洗涤液配方100mM pH=8. 0的Tris-HCl，50mM EDTA，0. 35M 山梨醇Sorbitol，质量比为1%的聚乙烯吡咯烷酮PVP-40 ；
3)向上述沉淀物中加入600μ L的DNA提取缓冲液，漩涡振荡使沉淀悬浮并上下颠倒混勻，而后置于65° C水浴45 min,每隔10 min缓慢摇动一次，使混合物充分混勻。其中 DNA提取缓冲液配方质量比2%CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)，100 mM Tris-HCl, 25 mM EDTA, 15 M NaCl，质量比 1%PVP_40，0. 1 mg/mL Protease K(蛋白酶 K)，质量比 0. 5%NP_40， 质量比0. 5%Tween-20，蛋白酶K、表面活性剂NP-40和Tween_20现用现加；
4)待上述混合物冷至室温后加入等体积即600 μ L的苯酚氯仿异戊醇体积比为25 :24 :1的苯酚-氯仿-异戊醇混合液，于摇床上低速(120 rpm)振荡至乳白色(5_10 min), 12，000 rpm离心5 min,定量吸取500 μ L上清液至另一新离心管；
5)向上述液体中加入等体积即500 μ L的氯仿异戊醇体积比为M 1的氯仿-异戊醇混合液，于摇床上低速(120 rpm)振荡至乳白色(5-10 min)，12，000 rpm离心5 min,定量吸取400 μ L上清液至另一新离心管；
6)向上述液体中加入1/10体积即40 μ L的ρΗ=5. 2的5 M醋酸钾，再加入2/3体积即四3 μ L的异丙醇混勻，于4° C放置2 h，12，000 rpm离心10 min，丢弃上清液，收集沉淀；
7)向上述沉淀中加入1 mL体积比70%乙醇，轻弹管底使沉淀悬浮，于摇床上低速(120 rpm)振荡2 min, 7, 000 rpm离心3 min，丢弃上清液，室温下干燥沉淀，加入100 μ L去离子水溶解沉淀，获得DNA粗提液；
8)向粗提液加入核糖核酸酶A至终浓度0.1 mg/mL, 37° C温浴30 min去除RNA ；
9)重复步骤5-7；
10)将沉淀用100μ L去离子水溶解，即获得DNA溶液。(三)单粒稻米胚乳基因组DNA的质量测定
采用上述一种从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法制备了镇稻88，南粳 44，南粳45，宁9108，南粳5055，南粳46等6个水稻品种(品系)的基因组DNA，并通过日本进口 HITACHI UjSlO紫外分光光度计对其浓度和质量进行检测。结果表明所提DNA浓度介于1(T15 ng/yL，OD26Q/OD28Q均在1.7 1.9之间(计算公式DNA纯度=0D260/0D280 (如果该值> 1. 9，表明有RNA污染；如果该值< 1. 6，表明有蛋白质、酚类等污染);DNA样品的浓度 (Ug / μ L)=0D260 X稀释倍数X 50/1000)；同时，为检测基因组DNA的完整性，取3 μ L DNA溶液在质量比1%琼脂糖凝胶电泳120V电泳20min，经溴化乙锭染色后在GENE GENIUS 全自动紫外凝胶成像分析系统中可以看出，凝胶的点样孔干净、无蛋白或多糖残留，DNA条带清晰、无拖尾(图1)。因此，利用该方法提取的单粒稻米胚乳基因组DNA浓度(1(T15 ng/ μ L)、纯度(1. 7 1. 9)和完整性都非常好。(四)以单粒稻米胚乳基因组DNA为模板进行SSR分子标记的扩增
以上述6个水稻品种(品系)的单粒稻米胚乳基因组DNA为模 板，利用两对SSR标记 RM495和RM7286对其进行扩增。PCR扩增体系为10 μ L的PCR反应体系中包括提取的单粒稻米胚乳基因组DNA溶液1 yL，2. 5 nmol/L的SSR引物0. 5 μ L，2. 5 mmol/L的dNTP 0.25 μ L，10XPCR Buffer (包括MgCl2)l μ L，Taq DNA聚合酶0. 5U (购于北京鼎国生物技术有限公司)，ddH20 6. 75 μ L ；PCR扩增程序为94° C预变性5min ；随后进入32个循环， 每个循环中94° C变性30 s, 55° C退火30 s，72° C延伸30 s，72° C后延伸10 min。 取2 μ L PCR产物上样，经质量比9%聚丙烯酰胺凝胶180V电泳2 h，银染显色得到PCR的扩增结果，由图2可以看出扩增条带清晰、杂带少、便于读带，说明利用该方法提取的单粒稻米胚乳基因组DNA符合SSR标记PCR扩增的要求。(五)以单粒稻米胚乳基因组DNA为模板进行水稻低直链淀粉含量基因Wx-mq的 PCR检测
根据水稻低直链淀粉含量基因Wx-im在Wx位点第497位核苷酸发生G到A的等位变异，设计Wx-mq两对特异PCR引物(正向外引物序列Wxiq-Q-V为5，-ATGTTGTGTTCTTGTGT TCTTTGCAGGC-3，，反向外引物序列 Wx-mq-Q-R 为 5，-GTAGATCTTCTCACCGGTCTTTCCCCAA-3’ ，正向内引物序列Wx-mq-1-F为5，-GGGTGAGGTTTTTCCATTGCTACAATCG-3，，反向内引物序列 Wx-mq-1-R为5，-GTCGATGAACACACGGTCGACTCAAT-3，，引物序列尚为发表)，并以上述6个水稻品种(品系)的单粒稻米胚乳基因组DNA为模板，对其进行扩增。PCR扩增体系为20 UL 的PCR反应体系中包括提取的胚乳基因组DNA溶液2 uL,2. 5 nmol/L的引物(/^-M7-O-F, Wx-niq-Q-R, Wx-mq-1-F 和 Wx-mq-l-O 2 μ L，2· 5 mmol/L 的 dNTP 0. 5 μ L, 10XPCR Buffer (包括MgCl2)2 μ L, Taq DNA聚合酶0. 5U (购于北京鼎国生物技术有限公司)，ddH20 13 μ L ；PCR扩增程序为94° C预变性5min ；随后进入32个循环，每个循环中94° C变性30 s, 65° C退火30 s, 72° C延伸30 s，72° C后延伸10 min。取20 μ L PCR产物在质量比1. 5%琼脂糖凝胶上120V电泳25 min,经溴化乙锭染色后并于GENE GENIUS全自动紫外凝胶成像分析系统下观察。由图3可以看出直链淀粉含量正常的水稻品种(系)镇稻88，南粳44，南粳45能扩增出439 bp和200 bp的特异条带，而低直链淀粉含量的水稻品种(系) 宁9108，南粳5055，南粳46则能扩增出439 bp和292 bp的特异条带。上述扩增条带非常清晰，易于区别目的基因的等位性变异，这说明利用该方法提取的单粒稻米胚乳基因组DNA 适合进行短片段特异PCR检测。(六)以单粒稻米胚乳基因组DNA为模板进行水稻胚乳蛋白合成基因As炉7的PCR 扩增
根据GenBank序列数据库(www. ncbi. nlm. nih. gov/pubmed)中报道的水稻胚乳蛋白合成基因 OsVPl (AK073805)的序列设计引物(正向引物 OsVPl-Y CACTACAGGGGTTCAACGATGA, 反向引物OsVPl-效:CGTCTTTTTCGCTGACGATACCT)，并以上述6个水稻品种(品系)的单粒稻米胚乳基因组DNA为模板，进行扩增，PCR扩增体系为30 μ L的PCR反应体系中包括提取的 DNA 溶液 2 μ L,2. 5 nmol/L 的引物(As炉7-F 和 As炉7-R) 2 μ L,2. 5 mmol/L 的 dNTP 2 μ L，5 X PS Buffer 1 μ L，Prime STAR DNA 聚合酶 1 U (购于 TaKaRa 公 司)，ddH20 22 μ L ； PCR扩增程序为94° C预变性5min ；进入32个循环，每个循环中98° C变性10 s，58° C 退火10 s,72° C延伸210s;72° C后延伸10 min。取30 μ L PCR产物在质量比1%琼脂糖凝胶上120V电泳30min，经溴化乙锭染色后并于GENE GENIUS全自动紫外凝胶成像分析系统下观察，由图4可以看出6个品种均扩增出长度为3. 5 kb的特异条带，且亮度高、非常清晰。因此，说明利用该方法提取的单粒稻米胚乳基因组DNA适合进行长片段特异PCR扩
+飽
+曰ο


本发明提供了一种从单粒稻米胚乳中提取高质量基因组DNA的方法，属于农业生物技术领域。以单粒稻米研磨棒砸碎后，经苯酚-氯仿-异戊醇和氯仿-异戊醇两步抽提后，用醋酸钾和异丙醇共同沉淀核酸；DNA沉淀经70%乙醇润洗后室温干燥，加入去离子水溶解，得到DNA粗提液；向粗提液中加入RNA核糖核酸酶A，处理后重复氯仿-异戊醇抽提、核酸沉淀、润洗、干燥、溶解等步骤，获得较高质量的DNA溶液。采用本发明方法能有效的从单粒稻米胚乳中提取高质量的水稻基因组DNA，这些DNA不仅能有效用于稻米品种真实性和纯度的分子鉴定，解决其真伪判别的关键性技术难题；同时，还可用于水稻大片段基因的特异扩增，为其功能基因组研究奠定基础。