专利名称：基于hrm基因分型技术的集成化基因检测方法HRM技术是high-resolution melting analysis即高分辨熔解曲线分析技术，是 近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。基于高效稳健的PCR技 术，HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分 辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA配型等的分析。HRM的主 要原理是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对 样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。 HRM技术对DNA样本的质量要求很高，所以常用于研究细胞体系的研究。HRM技术应用于基因突变检测依据于饱和性荧光染料的，根据荧光信号强度的微 妙变化来判断基因类别，故HRM技术有着很高的灵敏度和准确度。基因指导下个体化疗与个体化分子靶向治疗是近年兴起的一种肿瘤药物治疗选 择方式，目的是提高肿瘤药物治疗的精确性，减少预期无效的治疗。美国食品和药品管理局 (FDA)明确支持应用靶向药物前进行如EGFR、K-raS、B-raf等基因突变检测，以决定对应药 物是否有效，而先前欧洲药品管理局(EMEA)已经宣布了这个决定。作为世界上最权威和最 严格的药品审批机构，FDA这个决定无疑标志着“个性化治疗的时代”的来临。靶向治疗药物与基因信息相关性如下(1)《09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出通常如EGFR 19外显子 和21外显子突变或缺失的患者对这些药物治疗有效，无突变者预后不良。《09年NCCN非小 细胞肺癌临床实践指南》明确指出当K-ras基因如果发生了突变，则不建议病人使用特罗 凯(Tarceva/Erlotinib)进行分子靶向治疗。NSCLC患者使用易瑞沙或特罗凯时，应同时检测EGFR和K_ras突变。(2)K_raS是公认的癌基因，参与表皮生长因子受体(EGFR)信号传导过程，与EGFR 抑制剂类靶向药物的疗效密切相关。《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指 南》明确指出一是所有转移性结直肠癌患者都应检测K-ras基因状态；二是只有K-ras野 生型患者才建议接受EGFR抑制剂如西妥昔单抗(Cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab) 的治疗。(3)B-raf基因的突变检测可协助医生筛选西妥昔单抗(Cetuximab)和帕尼单抗 (panitumumab)等药物治疗的有效人群。建议B-raf野生型患者接受该类EGFR抑制剂的治疗。(4)其他相关基因等。以上基因的检测都是常规必检的，甚至有时需要联合检测，例如对于非小细胞肺癌相关基因的检测，需要同时检测EGFR和KRAS基因的序列信息；对于结直肠癌，需要同时 检测KRAS和BRAF基因的序列信息。以往常规检测方法只能一对一的进行检测，严重影响 操作时效性，所以对于多个基因多个位点的同时检测已是很有必要，以便更快速的提供出 待检基因的位点信息，而且大量基因集成化检测便于筛查相关肿瘤基因，为预查和监控带 来了方便。目前普遍应用的基因突变检测方法为限制小片段长度多态性分析法(RFIi^i)和 DNA直接测序法。RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法。但是该方法存在以下缺点 RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，以及存在第一轮酶切不完全导致的假阳性DNA直接测序的原理是DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括 Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。自动化测序可使用美国PE ABI公 司已生产出310型等DNA测序仪，ABI PRISM 310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用 毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的 ddNTP (标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基 的3 ’末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在 一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于 分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测 器窗口中的CCD (charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激 发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同 步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果 能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。该方法存在以下缺点在于花费昂贵，所以对一些较大的，外显子较多的基因不宜 用测序法直接检测突变；另外不适用于临床对大量的标本进行检测，而且多基因多位点的 检测需要的多次反应来完成。DNA直接测序也不能被当成是突变检测的金标准，杂合突变、 胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据。所以为了提高检测效率和准确性，开发一种集成化检测方法是很有必要的，这样 就可以在很短的时间内完成多基因多位点多样本的快速检测，以快速的操作方法获得需要 的基因信息，以满足临床用药和检测诊断方面的时效性要求，也通过集成化检测满足相关 肿瘤诊断的筛查工作，为相关肿瘤的预判提供了一个依据。
本发明主要目的在于提供一种基于HRM基因分型技术的集成化基因检测方法，该 方法高通量，快速便捷，可以多个基因同时检测，解决了不同基因分批操作的麻烦；应用本 发明的集成化程序后可以一次性完成对多个基因信息进行全面的扫描。为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是一种基于HRM基因分型技术的集成化基因检测方法，其特征在于所述方法包含以 下步骤(1)针对待检目的基因的至少两个靶向区域或若干个目的基因的靶向区域的连续 核苷酸序列设计筛选适合的引物对；(2)提取样本DNA，利用步骤(1)筛选的若干基因扩增引物，利用集成化反应程序5进行基因扩增；(3)根据高分辨率熔解曲线法对扩增后的所有目的基因或单个目的基因的若干个 突变位点同时检测。优选的，所述目的基因选自EGFR，KRAS, BRAF, C-KIT，PI3K和PDGFRA的一种或一 种以上；所述引物对含有目的基因靶向序列中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸 序列。优选的，所述方法在PCR反应体系中进行，所述PCR反应体系包括PCR缓冲液、 dNTPs、荧光染料、MgCl2, TaqDNA聚合酶、模板DNA，所述PCR反应体系终浓度组成为PCR缓冲液 终浓度1 5X;dNTPs0. 1 ImM ；引物序列 终浓度为0. 1 1 μ M ；模板 DNA 0. 05 2ng/ μ L ；TaqDNA 聚合酶 0. 01 0. IOU/ μ L ；MgCl2终浓度为 1 5mM ；荧光染料 1 3X。优选的，所述用于集成化检测的PCR反应体系终浓度组成为PCR缓冲液 终浓度1 3X;dNTPs0. 1 0. 5mM ；引物序列 终浓度为0. 1 0. 5 μ M ；模板 DNA 0. 05 1. 5ng/ μ L ；TaqDNA 聚合酶 0. 01 0. IOU/ μ L ；MgCl2终浓度为 1 3mM ；荧光染料 1 2X。优选的，所述荧光染料选自DNA饱和性染料包括EvaGreen染料、LC Green PLUS 染料、ResoLight 染料、SYTO 9 染料；所述 dNTP 混合液包括 IOmM dATPUOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP的混合液；所述PCR缓冲液包括Tris · cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；_20°C TpH 值在 8. 0-9.0 间。优选的，所述集成化反应程序包括集成在一起形成程序化操作的进行基因扩增的 PCR扩增程序和进行突变位点检测的产物熔解程序。优选的，所述PCR扩增程序中进行PCR扩增反应的条件为92 97°C预变性4 15min ；92 97°C变性 10 30s，50 65°C退火 10 30s，70 75°C延伸 10 30s，40-55 个循环；所述进行突变位点检测的产物熔解程序中进行产物溶解检测的条件为92 97°C 变性1分钟；40°C复性1分钟；然后初始熔解温度60 65°C开始程序升温熔解至95°C，并 在熔解过程中实时检测荧光信号，25 45次每秒；然后40°C进行冷却10秒。优选的，所述PCR扩增程序中进行PCR扩增反应的条件为95°C预变性5min ；95°C 变性10s，60°C退火15s，72°C延伸25s，50个循环；所述进行突变位点检测的产物熔解程序 中进行产物溶解检测的条件为95°C变性1分钟；40°C复性1分钟；然后初始熔解温度65°C 开始程序升温熔解至95°C，并在熔解过程中实时检测荧光信号，40次每秒；然后40°C进行 冷却10秒。优选的，所述方法具体按照如下步骤进行Al、设计所有待检目的基因靶向区域连续核苷酸序列，筛选适合的弓I物对；A2、根据引物条件预选PCR条件，筛选最优PCR扩增条件，锁定扩增条件之后，再用 设定的扩增条件筛选设计的引物；A3、提取样本DNA，利用步骤A2筛选出来的若干基因扩增引物，集体加样后上机 后，利用集成化反应条件进行基因扩增；A4、根据高分辨率熔解曲线法对扩增后的目的基因进行突变位点检测。优选的，所述模板DNA从选自外周血血浆、外周血血清、体液、腔道的脱落物、病变 组织样本中提取。本发明中，用于特异性扩增目的基因靶向序列的引物对含有目的基因靶向序列中 至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列；所述集成化检测条件包含PCR扩增条件和 产物熔解条件。本发明进行集成化检测基因突变方法研究时，按照PCR反应程序的预选范围，优 化基因扩增程序的确定，产物熔解条件预选范围以及优化条件的筛选这些程序得到本发 明。所述PCR反应程序预选范围选自以下设置程序本发明公开了一种基于HRM基因分型技术的集成化基因检测方法，其特征在于所述方法包含以下步骤(1)针对待检目的基因的至少两个靶向区域或若干个目的基因的靶向区域的连续核苷酸序列设计筛选适合的引物对；(2)提取样本DNA，利用步骤(1)筛选的若干基因扩增引物，利用集成化反应程序进行基因扩增；(3)根据高分辨率熔解曲线法对扩增后的所有目的基因或单个目的基因的若干个突变位点同时检测。该方法应用带HRM模块的荧光定量PCR仪分析，参照阴性对照，即可完成对样本多种基因型的判断，可以用于联合筛查。