专利名称：一种spop基因杂合性缺失的熔解曲线分析检测试剂盒及其检测方法和应用的制作方法卵巢癌是女性生殖系统的三大恶性肿瘤之一，是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，早期无明显症状，易造成患者忽视，70% -80%确诊时已属晚期。卵巢癌中以卵巢上皮性癌最为常见，占80%左右，手术治疗效果不理想，术后59%患者2年内复发或其他转移，五年生存率仅30%左右。目前紫杉醇联合卡钼治疗卵巢癌有效率为60%左右，可作为卵巢癌术后化疗及复发的一线化疗方案。但紫杉醇和卡钼均可出现耐药，并具有较强的毒副作用。卵巢癌的发生、侵润和转移涉及肿瘤转移促进基因(metastasis promoting genes)和肿瘤转移抑制基因(metastasis suppressorgennes, MSG)的变化，是一个多因素、多步骤的连续过程。探讨卵巢癌浸润转移发生的作用机制，就能为卵巢癌的检测、辅助诊断、个体化治疗和预后判断提供新的靶点、新的指标。但迄今为止，明确的与卵巢癌发生相关的只有BRACl和BRAC2基因突变，然而这部分患者只占到卵巢癌患者的5%左右。因此，为卵巢癌的诊治寻找新的分子靶点是卵巢癌研究中的一个重点。SPOP基因位于人染色体17q21的位点，在肿瘤细胞中具有高缺失率及杂合性缺失 (loss of heterozygosity, L0H)现象。LOH的定义为导致与某一特殊基因正常的两个成对等位基因出现不同的基因组变化；常反映丧失该基因的一个等位基因的部分或全部基因组序列。LOH —般都与肿瘤的抑制基因有关，在两个等位基因都存在时，会抑制恶性肿瘤的发生。而当一个等位基因明显异常或缺失时(另一个等位基因已经处于没有活性的状态)不再发生抑制恶性状态，细胞就转化为癌细胞。近年来，学者在研究42种卵巢癌细胞株SPOP基因杂合性缺失(LOH)时，发现SPOP 基因在卵巢癌来源的细胞株中显著杂合性缺失(LOH)，如图1所示。SPOP基因除了在卵巢癌中出现大量LOH外，在胃肠间质瘤，甲状腺癌，肾癌，卵巢癌，食道癌等来源的细胞株中也出现大量的L0H。抑癌基因SPOP在卵巢癌中大量出现L0H，而正常卵巢组织中SPOP则不会出现这种LOH现象，因此，SPOP的杂合性缺失可作为卵巢癌的辅助诊断标志。目前，检测SPOP基因杂合性缺失(LOH)的方法主要是传统的聚合酶链式反应 (PCR)方法、传统测序、变性高效液相色谱分析(dHPLC)、芯片杂交等方法。传统PCR方法应用较广，但因其是通过PCR后的产物电泳，通过判断条带的数量和分布来达到区分野生型、 纯合缺失、杂合性缺失的目的，其操作繁琐，易出现假阳性和假阴性；传统测序的灵敏度为 20%左右，容易出现假阴性；dHPLC操作复杂、花费高，一般不适于临床检测；芯片杂交的方法花费较高，一般实验室没有此平台，其应用于临床检测尚有许多限制因素。
因此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种检测SPOP基因杂合性缺失的方法。本发明的再一个目的是提供一种SPOP基因杂合性缺失的熔解曲线分析检测试剂盒本发明的另一个目的是提供一种SPOP基因杂合性缺失的熔解曲线分析检测试剂盒在卵巢癌检测过程中的应用。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是提供一种SPOP基因杂合性缺失的高分辨率熔解曲线分析检测试剂盒在卵巢癌检测中的应用，其特征在于该试剂盒由卵巢癌抑癌基因SPOP高分辨率熔解曲线分析的SPOP 特异引物、DNA 提取试剂(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit)、LC480 HRM master mix、阳性质控DNA、阴性质控DNA组成；其中，高分辨率熔解曲线分析的SPOP特异引物由两对引物片段组成，其中一对扩增SPOP高频LOH区的序列，扩增片段长度为120bp ；另一对引物扩增SPOP基因以外两端的序列，片段长度为lOObp，其序列如下表。
本发明提供了一种SPOP基因杂合性缺失的熔解曲线分析检测试剂盒及其在卵巢癌检测中的应用，该试剂盒使用了卵巢癌抑癌基因SPOP，包括用于高分辨率熔解曲线分析的SPOP特异引物、DNA提取试剂、LC480 HRM master mix、阳性质控DNA、阴性质控DNA。本发明还涉及试剂盒的制作及检测方法。