专利名称：黄瓜枯萎病的苗期人工接种方法及其接种物的制作方法由半知菌亚门尖镰孢菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum(Schl.) f. s p. cucumerinumowen)侵染引起的黄瓜枯萎病是设施栽培和露地栽培黄瓜上的一种世界性土传病害，常给黄瓜生产造成严重甚至毁灭性损失。在病害防治中，化学防治效果不理想； 轮作倒茬虽然有效，但给蔬菜生产的茬口安排带来实际困难；选育和合理利用抗病品种是最经济、安全、高效的措施。而苗期人工接种是枯萎病抗病育种、抗病性遗传以及病菌生理小种鉴定的重要环节。目前，国内外枯萎病苗期接种方法主要有(1)胚根法该接种法简便易行，但由于枯萎病菌侵染产生不出苗种子，而且不出苗种子比率与病原菌致病力及寄主抗病性不成正比，品种间差异小，因此认为胚根接种法所用的刚发根的幼植物体与成苗后的植物体可能有不同的抗病性。(2)菌土法该方法与胚根法一样存在枯萎病菌侵染产生不出苗种子而影响抗病性鉴定结果问题。(3)灌根法该方法由于人为对根部造成较大伤口，接种后植株发病迅速，但该方法难以检测植株根系分泌物等对抗病性的影响，且对不同植株很难做到伤根均勻，难以保证结果的准确性。(4)沾根法该方法拔出的幼苗由于机械损伤而使幼嫩根系出现多处微伤，依靠机械微伤给病菌提供侵入根部的条件以达到接种效果。同样存在灌根法的缺点。综上所述，上述各种接种方法均存在一定弊端，因此探寻周期短、稳定可靠、能够正确反映品种抗病性的人工接种方法对黄瓜抗枯萎病的抗病性鉴定、生理小种分化研究具有重要意义。
本发明的一个目的是提供一种用于接种黄瓜枯萎病菌的接种物。本发明所提供的用于接种黄瓜枯萎病菌的接种物，由包括如下步骤的方法制备得到的向灭菌后的培养基中加入黄瓜枯萎病菌，于培养13-15天，即得到用于接种黄瓜枯萎病菌的接种物；所述培养基由土壤、米糠、蔗糖和水组成；所述培养基中所述土壤、米糠、蔗糖和水的质量比为 40 8 0. 5 12.5-40 12 0. 7 17.5。所述加入黄瓜枯萎病菌的量为3. 6 X IO5个孢子/g培养基-4. 1 X IO5个孢子/g培养基；所述黄瓜枯萎病菌为尖镰孢菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum(Schl. ) f. sp. cucumerinum owen)。本发明的另一个目的是提供一种用于接种黄瓜枯萎病菌的培养物。本发明所提供的用于接种黄瓜枯萎病菌的培养物，由所述用于接种黄瓜枯萎病菌的接种物和灭菌土组成。所述接种物和所述灭菌土的质量比为1 4。所述黄瓜枯萎病菌为尖镰孢菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum(Schl. ) f. sp. cucumerinum owen)。本发明的又一个目的是提供一种接种黄瓜枯萎病菌的方法。本发明所提供的接种黄瓜枯萎病菌的方法，包括以下步骤将黄瓜幼苗移栽于所述用于接种黄瓜枯萎病菌的培养物中，进行培养，即得到接种了黄瓜枯萎病菌的黄瓜幼苗。所述黄瓜幼苗为子叶期的黄瓜幼苗。所述培养是在温度为光照25°C 和黑暗18°C的条件下培养10天-15天。本发明的又一个目的是提供一种用于培养黄瓜枯萎病菌的培养基。本发明所提供的用于培养黄瓜枯萎病菌的培养基，所述培养基由土壤、米糠、蔗糖和水组成；所述培养基中所述土壤、米糠、蔗糖和水的质量比为 40 8 0. 5 12. 5-40 12 0. 7 17. 5。所述黄瓜枯萎病菌为尖镰孢菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum(Schl. ) f. sp. cucumerinum owen)。所述黄瓜的品种名称为傲雪、中农12号、中农21号、中农27号、中农203号、强大理想、谷雨07-1、荷兰绿剑、新北京自玉香黄瓜、魔尔优加优九号、北国寒秀、春冠王、中农 10号、长春密刺、津春2号或津研2号。采用本发明的方法接种后IOd 15d调查的发病结果与田间成株期自然发病的结果相吻合，而且经多年多次抗病性鉴定，结果表明该方法接种后抗病反应比较稳定、可靠性强。本发明所提供的接种方法适用于黄瓜品种的抗病性鉴定、黄瓜枯萎病菌生理小种分化、 致病力的遗传变异等方面的研究。
图1为用本发明的接种方法接种后不同品种的病情指数。图2为用灌根接种法接种后不同品种的病情指数。图3为用浸根接种法接种后不同品种的病情指数。图4为用胚根接种法接种后不同品种的病情指数。图5为用菌土法接种后不同品种的病情指数。

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将保存于PDA斜面培养基上的黄瓜枯萎病菌，即尖孢镰孢菌黄瓜专化型 (Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum owen)(公众可从东北农业大学获得，记载过该材料的非专利文献是陈霞，刘东，张艳菊，秦智伟，周秀艳.黄瓜枯萎病株镰孢菌的分离与鉴定。东北农业大学学报，2010,41(7) :37-44)，接种于盛有150mL PL培养液(马铃薯 200g，葡萄糖20g，定容至IOOOmL,灭菌)的锥形瓶中，置于摇床上，以120rpm -min"1培养7d。培养液经两层纱布过滤，滤液置于离心机中以4，OOOrpm · mirT1离心lOmin，倒除上清液，加适量蒸馏水稀释后，用血球计数板测定孢子数，再加水调至接种浓度为1 X IO6个小孢子iL-1，备用。二、培养基配制称取土壤80g，米糠20g，混勻后加入40g/L蔗糖溶液30mL，搅拌均勻后装于可灭菌的容器中，121°C灭菌20min，即得到用于培养黄瓜枯萎病菌的培养基，所述培养基由土壤、 米糠、蔗糖和水组成，土壤、米糠、蔗糖和水的质量比为40 10 0.6 15。三、黄瓜枯萎病菌在培养基中的培养向上述步骤二得到的132g培养基中加入50mL上述步骤一得到的浓度为IX IO6个孢子/mL的黄瓜枯萎病菌悬液(即黄瓜枯萎病菌的加入量为3. 8 X IO5个孢子/g培养基)， 于无菌条件下充分搅拌均勻后，28°C培养14天，即得到用于接种黄瓜枯萎病菌的接种物。四、鉴定材料准备设长春密刺(2005年购自哈尔滨蔬菜市场)为抗病对照品种，津研2号(2005年购自哈尔滨蔬菜市场)为感病对照品种。2009年以12份黄瓜品种及种质资源作为供试品种(见表1，各供试品种的来源见表幻，种子经5%次氯酸钠溶液消毒IOmin后，用清水冲洗，放入垫有两层滤纸的培养皿中，然后于恒温培养箱中催芽。待胚根长至0. 5cm左右时，将其播于塑料育苗钵内，播种基质为消毒的蛭石营养土(3 1)，每钵1粒，每品种重复 3次，每重复10株苗。20 25°C温室内育苗7天，得到子叶期的黄瓜幼苗。五、接种将上述步骤三得到用于接种黄瓜枯萎病菌的接种物与灭菌土按质量比为1 4的比例混合制成接种土，装入营养钵中，然后将子叶期的黄瓜幼苗移栽于营养钵中。在温度为光照^TC/黑暗18°C的条件下培养13天。调查发病率及病情指数。同时，以田间自然发病情况为对照。田间鉴定设在自然菌源较多、每年发病较重的温室内进行。病情分级标准如下0级无病症1级胚轴或子叶出现轻微病症，但生长正常2级胚轴或子叶出现明显坏死斑，或一片子叶黄化，影响生长3级两片子叶黄化，或一片子叶枯死4级两片子叶生长僵化，植株部分萎蔫或停止生长5级整株萎蔫、倒伏或枯死计算病情指数，公式为
病情指数=Σ(各级病叶数χ各级翻)χ 100 R调查总叶数χ最高一级代表值xl(K)
抗性评价指标种质群体对枯萎病的抗性依苗期病情指数分5级。


本发明公开了黄瓜枯萎病的苗期人工接种方法及其接种物。本发明提供了一种用于接种黄瓜枯萎病菌的接种物。本发明所提供的用于接种黄瓜枯萎病菌的接种物，由包括如下步骤的方法制备得到的向灭菌后的培养基中加入黄瓜枯萎病菌，于28℃培养13-15天，即得到用于接种黄瓜枯萎病菌的接种物；所述培养基由土壤、米糠、蔗糖和水组成；所述培养基中所述土壤、米糠、蔗糖和水的质量比为40∶8∶0.5∶12.5-40∶12∶0.7∶17.5。本发明所提供的接种方法适用于黄瓜品种的抗病性鉴定、黄瓜枯萎病菌生理小种分化、致病力的遗传变异等方面的研究。