专利名称：组织特异性的重组质粒、病毒及其应用的制作方法肝癌是发生于肝脏的恶性肿瘤，是临床上最常见的恶性肿瘤之一，居恶性肿瘤的第五位。肝癌在我国属于高发病，一般男性多于女性。目前我国发病人数约占全球的半数以上，占全球肝癌病人的55%，已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手，其危险性不容小视。传统中药中提取的斑蝥素治疗肝癌虽然有显著效果，由于不具有组织特异性，对正常组织的毒副作用明显。斑蝥素作用的靶点是蛋白磷酸酶2A的活性C亚基(PP2Ac)。细胞内蛋白磷酸酶2A的活性C亚基(PP2Ac)是斑蝥素作用的靶点，是一个含&12+和狗2+的金属酶，由309个氨基酸残基组成，其具有α和β两种异构体，有两个不同的基因编码，其同源性高达97%。PP2Ac广泛表达于各种细胞。由于斑蝥素通过抑制PP2Ac发挥杀伤细胞的作用时，并不能够区分肿瘤细胞和正常细胞，因此斑蝥素对正常细胞组织也具有毒性作用。近年来，利用组织特异性基因启动子建立的基因治疗方法，为肿瘤靶向性治疗开辟了新的思路。基因的表达受其启动子的调控，启动子的转录活性与基因转录水平直接相关。某些启动子具有严格的组织特异性，即特定的启动子仅在特定的组织中存在活性。因此，某些基因仅表达于特定组织。如甲胎蛋白AFP的启动子在肝癌细胞中有很高的转录活性，因此AFP主要表达于肝癌细胞。利用肿瘤组织特异性基因的启动子，可以靶向性地在肿瘤细胞中表达某些抗肿瘤基因，从而实现针对肿瘤细胞的干预，减轻甚至避免对正常细胞的影响。发明内容本发明的目的是提供用于基因治疗的重组载体，通过重组载体将DN-PP2AC导入细胞中，使DN-PP2AC在细胞中过表达，从而抑制PP2Ac的活性，达到类似于斑蝥素的治疗目的，且控制DN-PP2AC特异性表达于肝癌细胞，在正常细胞中不表达，从而避免对正常细胞组织的损伤，减轻毒副作用。为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案将具有肝癌组织特异性的AFP增强子、pgk启动子和DN-PP2A表达序列重组到腺病毒质粒载体中，使DN-PP2AC的表达受到调控，仅在AFP阳性表达的肝癌细胞中能够表达出DN-PP2A，从而避免了对正常细胞的影响。本发明提供一种重组质粒，由AFP增强子、pgk启动子和蛋白PP2Aca的负显性突变体基因与质粒载体重组构建而成。AFP增强子具有组织特异性，但不具有强转录活性；pgk启动子具有强转录活性，但不具有组织特异性。二者结合可同时具有组织特异性和强转录活性。在本发明的具体实施例中，AFP基因的增强子序列和磷酸甘油酸激酶(pgk)基因的启动子组合形成的AFpg启动子，结合了 AFP启动子的肝癌组织特异性和pgk启动子的强转录活性，适用于肝癌组织特异性基因治疗。AFP增强子核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，pgk启动子核苷酸序列如SEQ ID No. 3 所示。
作为优选，所述PP2Aca的负显性突变体为PP2ACci第199位亮氨酸突变为脯氨酸形成的负显性突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
显性负性作用是指某些信号转导蛋白突变后不仅自身无功能，还能抑制或阻断同一细胞内的野生型信号转导蛋白的作用。具有显性负性作用的突变体被称为显性负性突变 {φ (dominant negative mutant)。
DN-PP2Ac (dominant negative PP2Ac)是 PP2Ac 的显性负性突变体。在本发明的实施例中，DN-PP2Ac是将PP2Acci第199位亮氨酸突变为脯氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，DN-PP2Ac通过质粒载体导入细胞中，使DN_PP2Ac在细胞中过表达，从而抑制 PP2Ac的活性，其作用类似于斑蝥素。PP2Ac有两种亚型α和β，二者基因序列相近，同源性高达97%，功能基本相同。本发明如采用β亚型在同样的位点做显性负性突变，也具有抑制ΡΡ2Α活性的作用。
更优选地，所述质粒载体为pGL3-basiC。
在本发明实施例中，具体提供一种重组质粒，命名为 pGL3-Basic-AFpg-DN-PP2Ac α，其质粒图谱如图 所示。
本发明还提供一种重组病毒质粒，由AFP增强子，pgk启动子及蛋白PP2Aca的负显性突变体基因与病毒载体重组制备而成。所述病毒载体为腺病毒、逆转录病毒或慢病毒载体。
作为优选，所述病毒载体为腺病毒。在本发明的
中，采用腺病毒载体系统导入基因，替代方案可选择其他基因导入方式，如逆转录病毒系统、慢病毒系统等病毒载体，或用脂质体、FuGENE等转染试剂进行质粒转染。在本发明的实施例中提供的重组病毒质粒其图谱如图9所示。
本发明还提供一种重组病毒，由所述的重组病毒质粒经包装细胞包装而成。
作为优选，所述包装细胞为293细胞。在本发明的具体实施例，所获得的重组病毒命名为 Ad-AFpg-DN-PP2Ac α。
本发明还提供上述重组质粒、重组病毒质粒及重组病毒在制备治疗AFP阳性肝癌药物中的应用。
本发明将具有肝癌组织特异性的AFpg启动子和DN-PP2A表达序列重组到腺病毒质粒载体中，使DN-PP2AC的表达受到AFpg启动子的调控，使DN_PP2Ac特异性表达于AFP 表达阳性的肝癌细胞中，从而避免对正常细胞的影响。
用空质粒对照腺病毒、Ad-CMV-DN_PP2Aca、Ad-AFpg-luciferase以及 Ad-AFpg-DN-PP2Ac α，感染正常人肝细胞系L-02、不表达AFP的肝癌细胞系SK-H印-1、高表达AFP的肝癌细胞系H印G2。采用MTT比色法检测对细胞生长的影响。结果显示空质粒对照腺病毒、Ad-AFpg-luciferase对细胞生长无明显影响。阳参Ad-CMV-DN_PP2Ac α对三种细胞的生长均有抑制作用。d-AFpg-DN-PP2Ac α仅对高表达AFP的HepG2有抑制作用，对不表达AFP的L-02、SK-Hep-I无明显影响。
不表达AFP的肝癌细胞系SK-Ifep-I和高表达AFP的肝癌细胞系H印G2分别接种于裸鼠腋下，当形成约IOOmm3大小肿瘤时，向肿瘤内分别注射空质粒对照腺病毒(control)、 Ad-CMV-DN-PP2Ac α、Ad-AFpg-Iuciferase 以及 Ad-AFpg-DN-PP2Ac α，并检测肿瘤生长速度。结果显示，空质粒对照腺病毒、Ad-AFpg-luciferase对肿瘤生长无明显影响。阳参 Ad-CMV-DN-PP2Ac α对两种细胞形成的肿瘤均有抑制作用。Ad-AFpg-DN_PP2Ac α仅对高表达AFP的H印G2形成的肿瘤有抑制作用，而对不表达AFP的SK-Ifep-I形成的肿瘤无明显影响。说明DN_PP2Aca可显著抑制肝癌细胞和正常细胞生长。AFpg启动子可使DN_PP2Ac a 选择性地表达于AFP表达阳性的肝癌细胞中，从而避免对正常细胞的影响。
本发明采用DN-PP2AC抑制肿瘤细胞生长，其作用机制类似于抗肿瘤药物斑蝥素， 其优势在于可以使用具有肝癌组织特异性的AFpg启动子调控DN-PP2AC表达，使DN_PP2Ac 特异性表达于AFP表达阳性的肝癌细胞中，从而避免对正常细胞的影响，动物试验证实，本发明所述重组载体可显著抑制AFP表达阳性肝癌细胞生长，避免对正常细胞的影响，具有良好的临床应用前景。


图 1 为 pcDNA3. l_PP2Ac α 质粒图谱；
图2显示DN-PP2AC对PP2A活性的抑制作用；
图3显示DN-PP2AC对细胞生长的抑制作用；
图 4 为 pGL3_Basic-AFpg 质粒图谱；
图5显示正常人肝细胞系L-02，以及肝癌细胞系SK-Ifep-I和H印G2细胞中，AFpg 启动子转录活性；
图 6 示 pGL3-Basic-AFpg-DN_PP2Ac α 的构建方法；
图 7 为 pGL3-Basic-AFpg-DN_PP2Ac α 的质粒图谱；
图8为腺病毒构建方法；
图9为重组腺病毒质粒图谱；
图10显示Ad-AFpg-DN_PP2Ac α对正常人肝细胞系L-02生长的影响；
图11显示Ad-AFpg-DN_PP2Ac α对不表达AFP的肝癌细胞系SK-H印_1生长的影响；
图12显示Ad-AFpg-DN_PP2Ac α对高表达AFP的肝癌细胞系H印G2生长的影响；
图13显示Ad-AFpg-DN_PP2Ac α对不表达AFP的肿瘤无抑制作用；
图14显示Ad-AFpg-DN_PP2Ac α对AFP阳性肿瘤的选择性抑制作用。

本发明公开了一种针对AFP阳性肝癌细胞的组织特异性基因治疗载体，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
除非另有说明，实施例中进行的操作质粒、DNA、酶、病毒、培养细胞的各种步骤都是根据Molecular Cloning, A laboratory Manual (Τ· Maniatis等编，第二版，Cold Spring Laboratory)中描述的方法的改进。
在本发明的实施例中，正常人肝细胞系L-02，以及肝癌细胞系SK-Ifep-I和!fepG2 均购自美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection，ATCC)。腺病毒穿梭质粒pAdTrack与腺病毒骨架质粒pAdEasy-Ι腺病毒质粒购自美国Mratagene公司
AFP 基因的增强子出自文献=Nakabayashi H, Hashimoto Τ, Miyao Y, Tjong KK, Chan J, Tamaoki T et al. Mol Cell Biol 1991 ;11 :5885-93.，其核苷酸序列如 SEQ ID No. 2所示
pgk基因的启动子出自文献=Kita-Matsuo H, et al. · PLoS One 2009 ；4 :e5046，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示
PP2Ac有两种亚型α禾口 β , PP2Ac α基因序列如SEQ ID No. 4所示，PP2Ac β基因序列如SEQ ID No. 5所示。
实施例1 克隆PP2Ac，并通过定点突变技术将其突变为DN_PP2Ac
发明人在前期研究中已构建PP2Ac表达质粒pcDNA3. l_PP2Ac α，(参见Li W, et al. . Cancer Lett 2011 ;304 :117-27)，质粒图谱如图 1 所示。PP2Ac 基因序列如 SEQ ID No. 4 或 SEQ ID No. 5 所示。
DN-PP2AC表达质粒由pcDNA3. l_PP2Ac α经定点突变的方法获得，突变后质粒命名为pcDNA3. 1-DN-PP2AC α，经测序证实PP2Ac α第199位亮氨酸(CTG)已突变为脯氨酸(CCG)。PP2Ac α的氨基酸序列如SEQ ID No. 6所示，突变后表达的负显性突变体 DN-PP2Ac α氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
实施例2 :DN-PP2Ac功能鉴定
采用蛋白磷酸酶活性检测试剂盒(Nonradioactive serine/ threonine-phosphatase assay kit,购自 Promega))，检测 DN_PP2Ac 表达对 PP2A 活性的抑制作用。用pcDNA3. l-DN-PP2Ac α转染正常人肝细胞系L-02，以及肝癌细胞系SK-Ifep-I 和H印G2，结果如图2所示，显示pcDNA3. l_DN_PP2Ac α转染人肝细胞系L-02，以及肝癌细胞系SK-Ifep-I和!fepG2后，其PP2A活性被显著抑制，其与对照组差异具有统计学意义。
PP2A的相对活性(relative PP2A activity)按照下述公式计算。PP2A的相对活性=(处理组PP2A活性/对照组PP2A活性)X 100%。
采用MTT实验，检测DN-PP2AC对细胞生长的抑制作用。用pcDNA3. l_DN_PP2Ac α 转染正常人肝细胞系L-02，以及肝癌细胞系SK-Ifep-I和H印G2，结果如图3所示，转染 pcDNA3. 1-DN-PP2AC α后细胞活力(cell viability)被显著抑制，其与对照组差异具有统计学意义。
反映细胞生长能力的相对细胞活力(relative cell viability)按照下述公式计算。相对细胞活力=(处理组细胞活力性/对照组细胞活力)X100%。
上述研究提示，DN-PP2AC可抑制PP2A活性，并对肝癌细胞和正常肝细胞的生长产生抑制，具有与斑蝥素相似的细胞毒性作用。
实施例3 构建AFpg启动子
AFP增强子具有组织特异性，但不具有强转录活性；pgk启动子具有强转录活性， 但不具有组织特异性。二者结合可同时具有组织特异性和强转录活性。AFP增强子核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，pgk启动子核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
以肝癌细胞H印G2基因组DNA为模板，采用PCR克隆AFP增强子和pgk启动子，并将二者构建入荧光素酶报告基因载体pGL3-BasiC (购自Promega公司)，所得质粒命名为 pGL3-Basic-AFpg。质粒图谱如图4所示。
实施例4 =AFpg启动子功能鉴定
采用荧光素酶报告基因实验(参见Li W，et al. · Cancer Lett2011 ；304 :117-27) 检测AFpg启动子活性。pGL3-Basic-Afpg和内参质粒pRL_SV40 (购自Promega公司)共转染正常人肝细胞系L-02，以及肝癌细胞系SK-Ifep-I和H印G2，转染后双报告基因检测试剂盒(购自Promega公司)检测荧光素酶值。相对荧光素酶活性(relative Iuciferase activity) =pGL3-BaSiC-Afpg荧光素酶值/内参荧光素酶值。结果如图5所示，在正常人肝细胞系L-02，和不表达AFP的肝癌细胞系SK-Ifep-I中，AFpg启动子活性很低；而在高表达AFP的肝癌细胞系IfepG2中，AFpg启动子活性很高。
实施例5 将AFpg启动子和DN-PP2AC重组到腺病毒表达载体中并制备病毒
首先通过质粒酶切连接，将pGL3-BaSiC-Afpg质粒中的荧光素酶(Iuciferase)编码序列替换为pcDNA3. l-DN-PP2Ac α质粒中的DN_PP2Ac α编码序列。获得由Afpg启动子调控DN-PP2AC α表达的质粒载体，质粒命名为pGL3-Basic-AFpg-DN_PP2Ac α，图谱见图7。 具体构建过程如下
1.以pcDNA3. 1 (+) _DN_PP2Ac α质粒为模板，通过PCR扩增DN_PP2Ac α编码序列和polyA尾，上下游引物5’端分别带有BamH I和Nhe I酶切位点。PCR产物用BamH I、Nhe I限制性内切酶进行双酶切。
2.将pGL3-Basic-AFpg质粒用Bgl II、Xba I限制性内切酶进行双酶切，回收大片段。
3.利用同尾酶原理，将BamH I、Nhe I酶切后的DN_PP2Ac α编码序列和polyA尾， 插入pGL3-Basic-AFpg质粒用Bgl II>Xba I酶切后的大片段。
质粒构建过程见图6。
进一步将pcDNA3. 1 (+)-DN-PP2Ac α 质粒中的 CMV_DN_PP2Ac α 序列、 pGL3-Basic-AFpg Mf立巾白勺 AFpg-Iuciferase 歹I」、pGL3-Basic-AFpg-DN-PP2Ac α Mf立巾的AFpg-DN-PP2Ac α序列，分别构建到腺病毒系统的穿梭质粒pAdTrack中，质粒构建过程如图8所示，具体如下1.以pcDNA3. 1 (+) -DN_PP2Ac α质粒为模板，通过PCR扩增CMV启动子、DN-PP2AC α编码序列和polyA尾，上下游引物5’端分别带有EcoR V和Ml I酶切位点。PCR产物用EcoR V.Sal I限制性内切酶进行双酶切。
2.以pGL3-Basic-AFpg质粒为模板，通过PCR扩增AFP增强子、pgk启动子、荧光素酶编码序列和polyA尾，上下游引物5’端分别带有EcoR V和Ml I酶切位点。PCR产物用EcoR V.Sal I限制性内切酶进行双酶切。
3.以 pGL3-Basic-AFpg-DN_PP2Ac α 质粒为模板，通过 PCR 扩增 AFP 增强子、pgk 启动子、DN-PP2AC α编码序列和polyA尾，上下游引物5’端分别带有EcoR V和Ml I酶切位点。PCR产物用EcoR V.Sal I限制性内切酶进行双酶切。
4.将上述三个酶切后的PCR产物分别构入pAdTrack载体的EcoR V、Sal I多克隆位点。
构建的穿梭质粒分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy-Ι混合后，以化学转化法导入大肠杆菌BJ5183，在菌内进行同源重组，构建重组腺病毒质粒，其图谱如图9所示。以脂质体法将重组腺病毒质粒转染293细胞包装重组腺病毒，病毒分别命名为Ad-CMV-DN-PP2Ac α、 Ad-AFpg-Iuciferase、Ad-AFpg-DN_PP2Ac α 0
腺病毒载体构建方法出自文献
He TC, Zhou S, da Costa LT, Yu J, Kinzler Kff, Vogelstein B. Asimplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc NatlAcad Sci USA 1998 ；95 2509-14.
简要步骤如下将穿梭质粒经Rne I酶切线性化，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同转化导入大肠杆菌BJ5183，在菌内进行同源重组，构建重组腺病毒质粒。再将重组腺病毒质粒转染293细胞，在细胞内包装出重组腺病毒。
因CMV启动子不具有组织特异性，在各种细胞中均具有较高活性，故将 Ad-CMV-DN-PP2Ac α 作为阳参；Ad-AFpg-Iuciferase 不含有 DN_PP2Ac α 编码序列，作为阴参。
实施例6 :Ad-AFpg-DN-PP2Ac α 疗效验证
首先进行细胞水平的体外研究。分别用空质粒对照腺病毒(对照)、 Ad-CMV-DN-PP2Ac α、Ad-AFpg-Iuciferase 以及 Ad-AFpg-DN-PP2Ac α，感染正常人肝细胞系L-02、不表达AFP的肝癌细胞系SK-H印-1、高表达AFP的肝癌细胞系H印G2。采用MTT比色法检测对细胞生长的影响。
结果如图10-12所示，显示空质粒对照腺病毒、Ad-AFpg-Iuciferase对细胞生长无明显影响。阳参Ad-CMV-DN-PP2Ac α对三种细胞的生长均有抑制作用。 d-AFpg-DN-PP2Ac α仅对高表达AFP的H印G2有抑制作用，对不表达AFP的L_02、SK-Ifep-I 无明显影响。
进一步采用裸鼠荷瘤模型进行体内研究。不表达AFP的肝癌细胞系SK-Hep-I和高表达AFP的肝癌细胞系HepG2分别接种于裸鼠腋下，当形成约IOOmm3大小肿瘤时，向肿瘤内分别注射空质粒对照腺病毒(control)、Ad-CMV-DN-PP2Ac α、Ad-AFpg-Iuciferase以及Ad-AFpg-DN-PP2Ac α，并检测肿瘤生长速度。
结果如图13和图14所示，空质粒对照腺病毒、Ad-AFpg-Iuciferase对肿瘤生长无明显影响。阳参Ad-CMV-DN-PP2Ac α对两种细胞形成的肿瘤均有抑制作用。 Ad-AFpg-DN-PP2Ac α仅对高表达AFP的H印G2形成的肿瘤有抑制作用，而对不表达AFP的 SK-Hep-I形成的肿瘤无明显影响。
上述研究说明DN-PP2ACci可显著抑制肝癌细胞和正常细胞生长。AFpg启动子可使DN-PP2AC α选择性地表达于AFP表达阳性的肝癌细胞中，从而避免对正常细胞的影响。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。8


本发明涉及生物技术领域，公开了针对AFP阳性肝癌细胞的组织特异性重组质粒、重组病毒质粒、重组病毒及其在制备治疗AFP阳性肝癌药物中的应用。本发明使用具有肝癌组织特异性的AFpg启动子调控DN-PP2Ac表达，使DN-PP2Ac特异性表达于AFP表达阳性的肝癌细胞中，从而避免对正常细胞的影响，具有良好的临床应用前景。