专利名称：由地衣芽孢杆菌转化细胞制备脂酰基转移酶的制作方法已知脂酰基转移酶在食品应用中具有优势。已经发现脂酰基转移酶在食物中具有显著的酰基转移酶活性。这种活性在食物的制备方法中有惊人的有益应用。例如，WO 2004/064537公开了通过使用脂酰基转移酶来原位制备乳化剂的方法和与其相关的优点。因此，需要脂酰基转移酶的商业制备方法。然而，基因通常可能难以在异源宿主中表达，且在宿主细胞中表达脂酰基转移酶可能会有问题。WO 2004/064537公开了在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和大肠杆菌 (Escherichia coli)的表达两种气单胞菌(Aeromonas)脂酰基转移酶。然而，其在枯草芽孢杆菌中的表达很低，同时大肠杆菌不是GRAS生物体并因此不适合作为食品工业用酶的宿主。US 6，255，076公开了在芽孢杆菌(Bacillus)宿主细胞中制备多肽的方法。然而， 此种方法需要使用串联的启动子，其中每个启动子序列可操作地连接编码所述多肽序列的单拷贝核酸序列。因此，本领域中需要一种制备脂酰基转移酶的改进方法。
本发明的各个方面体现在权利要求书和以下详述中。本发明的一个方面涉及脂酰基转移酶的制备方法，所述方法包括以下步骤(i)提供宿主细胞，优选为芽孢杆菌宿主细胞，其中所述芽孢杆菌宿主细胞为除枯草芽孢杆菌之外的一种，优选为地衣芽孢杆菌细胞；(ii)用编码脂酰基转移酶的异源核苷酸序列转化宿主细胞，所述宿主细胞优选为芽孢杆菌宿主细胞，其中所述芽孢杆菌宿主细胞为除枯草芽孢杆菌之外的一种，优选为地衣芽孢杆菌细胞；和(iii)在启动子序列的控制下在细胞中表达脂酰基转移酶。另一方面，本发明涉及包含异源脂酰基转移酶的芽孢杆菌宿主细胞，其中所述芽孢杆菌宿主细胞为除枯草芽孢杆菌之外的一种，优选为地衣芽孢杆菌宿主细胞。另一方面，本发明涉及芽孢杆菌宿主细胞在制备异源脂酰基转移酶中的应用，其中所述芽孢杆菌宿主细胞为除枯草芽孢杆菌之外的一种，优选为地衣芽孢杆菌宿主细胞。适合地，与在枯草芽孢杆菌中的表达相比，在芽孢杆菌宿主中的表达可以引起表达的增加，其中所述芽孢杆菌宿主为除枯草芽孢杆菌之外的一种，且优选芽孢杆菌宿主为地衣芽孢杆菌。再一方面，本发明涉及包含编码脂酰基转移酶的核苷酸序列的表达载体，所述核苷酸序列可操作地连接一个或多个调控序列，使得所述调控序列能够在适合的宿主或宿主细胞中表达编码脂酰基转移酶的核苷酸序列，优选在芽孢杆菌宿主(或细胞)，其中所述芽孢杆菌宿主(或细胞)为除枯草芽孢杆菌之外的一种，优选在地衣芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌细胞。适合地，所述脂酰基转移酶可以是重组的脂酰基转移酶。 氨酸残基。此外或备选地，用于本发明载体、宿主细胞、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码的脂酰基转移酶包含SEQ ID No. 16所示的氨基酸序列，或与其具有75%或更高同源性的氨基酸序列。适合地，编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以包含SEQ ID No. 16所示的氨基酸序列。本文所用的术语“异源的”是指源自分离的遗传资源或物种的序列。异源序列是非宿主序列、修饰的序列、来自不同宿主细胞株的序列、或来自宿主细胞的不同染色体位置的同源序列。“同源”序列是指在同一遗传资源或物种中发现的序列，即其天然存在于宿主细胞的相关物种中。本文所用的术语“重组的脂酰基转移酶”是指已经通过遗传重组的方式制备的脂酰基转移酶。例如，将编码脂酰基转移酶的核苷酸序列插入克隆载体，得到以存在异源脂酰基转移酶为特征的地衣芽孢杆菌细胞。宿主细胞在本发明的一个实施方案中，用于本发明方法和/或应用中的宿主细胞是地衣芽孢杆菌宿主细胞。已经发现与其它生物体如枯草芽孢杆菌相比，使用地衣芽孢杆菌宿主细胞可使脂酰基转移酶的表达增加。已经将来自于杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的脂酰基转移酶插入到多个常规表达载体中，所述表达载体经设计可分别在枯草芽孢杆菌、多型汉逊酵母 (Hansenula polymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)禾口塔宾曲霉 (Aspergillus tubigensis)中有最佳的表达。然而，在多型汉逊酵母、粟酒裂殖酵母和塔宾曲霉中仅检测到极低的水平。这些表达水平低于1 μ g/ml,因此不可能选择出产生足量蛋白以起始商业生产的细胞(结果未显示)。相反，地衣芽孢杆菌能够产生对商业生产的可行性具有吸引力的蛋白水平。具体而言，已经发现在aprE启动子的控制下时，地衣芽孢杆菌中的表达比在枯草芽孢杆菌中的表达高约100倍，或在A4启动子的控制下并与纤维素融合时，比在变铅青链霉菌(S. Iividans)中的表达高约100倍(结果未显示在本文中)。在另一实施方案中，宿主细胞可以为除枯草芽孢杆菌之外的任何芽孢杆菌细胞。优选地，所述芽孢杆菌宿主细胞可以是以下物种中的一种地衣芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(B. alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、环状芽孢杆菌(B. circulars)、克劳氏芽孢杆菌 (B. clausii)、凝结芽孢杆菌(B. coagulans)、坚强芽孢杆菌(B. firmus)、B. lautus、缓慢芽孢杆菌(B. Ientus)、巨大芽孢杆菌(B. megaterium)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)或嗜热脂肪芽抱杆菌(S. stearothermophiIus)。本发明涉及的术语“宿主细胞”所包括具有以下特征的任何细胞包含本文所定义的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列或如上所述的表达载体，且用于具有如本文所定义的特异性质的脂酰基转移酶的重组制备。因此，本发明的其它实施方案提供了宿主细胞，其包含(如经转化或转染)本发明的核苷酸序列，或包含表达具有如本文所定义的特异性质的多肽的核苷酸序列。适合地，在一些实施方案中，宿主细胞可以是蛋白酶缺陷型或无蛋白酶型细胞株和/或α-淀粉酶缺陷型或无α-淀粉酶型细胞株。调控序列在一些应用中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的脂酰基转移酶序列可操作地连接能够通过如所选宿主细胞(如地衣芽孢杆菌细胞)表达核苷酸序列的调控序列。例如，本发明涵盖包含可操作地连接此调控序列的本发明核苷酸序列的载体，即所述载体是表达载体。术语“可操作地连接”是指并列放置(juxtaposition)，其中所述组件的关系允许它们能以其希望的方式发挥功能。“可操作地连接”编码序列的调控序列以这样的方式连接，即能在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。术语“调控序列”包括启动子和增强子以及其它表达调控信号。所用的术语“启动子”为本领域的一般含义，如RNA聚合酶结合位点。编码具有如本文所定义的特定性质的酶的核苷酸序列的增强表达也可以通过选择调控区(如启动子、分泌引导子和终止子区)来实现，所述终止子区本质上不是编码所述酶的核苷酸序列的调控区。适合地，本发明的核苷酸序列至少可以可操作地连接启动子。适合地，编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以可操作地连接编码终止子序列的核苷酸序列。用于本发明载体、宿主细胞、方法和/或应用中任一项的适合的终止子序列的实例包括α -淀粉酶终止子序列(如，CGGGACTTACCGAAAGAAACCATCAATGATGGTTTCTTTTTTGTT CATAAA-SEQ ID No. 64)、碱性蛋白酶终止子序列(如，CAAGACTAAAGACCGTTCGCCCGTTTTTGCA ATAAGCGGGCGAATCTTACATAAAAATA-SEQ ID No. 65)、谷氨酸特异性终止子序列(如，ACGGCCG TTAGATGTGACAGCCCGTTCCAAAAGGAAGCGGGCTGTCTTCGTGTATTATTGT-SEQ ID No. 66)、果聚糖酶终止子序列(如，TCTTTTAAAGGAAAGGCTGGAATGCCCGGCATTCCAGCCACATGATCATCGTTT-SEQ ID No. 67)和枯草杆菌蛋白酶 E 终止子序列(如，GCTGACAAATAAAAAGAAGCAGGTATGGAGGAACCTGC TTCTTTTTACTATTATTG)。适合地，编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以可操作地连接α-淀粉酶终止子，如地衣芽孢杆菌α -淀粉酶终止子。启动子根据本发明所用的启动子序列与编码脂酰基转移酶的序列可以是异源的或同源的。所述启动子序列可以是能够指导脂酰基转移酶在所选宿主细胞中表达的任何启动子序列。适合地，所述启动子序列可以与芽孢杆菌(如地衣芽孢杆菌)同源。优选地，所述启动子序列与所选宿主细胞是同源的。用于本发明的适合的启动子序列包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子、 地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶基因的启动子、枯草芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶基因的启动子、地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(枯草杆菌蛋白酶Carlsberg基因)的启动子、地衣芽孢杆菌谷氨酸特异性蛋白酶基因的启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶的启动子和具有α -淀粉酶基因的“_35”区序列TTGACA和“_10” 区序列TATAAT的“共有”启动子(即-35至-10启动子)。适合在本发明方法中指导核酸序列转录的启动子的其它实例包括缓慢芽孢杆菌碱性蛋白酶基因(aprH)的启动子、枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyE)的启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)的启动子、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)的启动子、枯草芽孢杆菌XylA和XylB基因的启动子、和/或苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种 (Bacillus thuringiensis subsp· tenebrionis)CryIIIA 基因的启动子。在优选实施方案中，所述启动子序列为α-淀粉酶启动子(如地衣芽孢杆菌 α-淀粉酶启动子)。优选地，所述启动子序列包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶启动子的-35 至"10序列(参见图53和图55)。信号月太根据所用的序列和/或载体，宿主细胞通过表达编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所产生的脂酰基转移酶可以被分泌出或包含在细胞内。信号序列可以用于指导编码序列分泌通过特定的细胞膜。所述信号序列对脂酰基转移酶编码序列来说可以是天然的或外源的。例如，所述信号肽编码序列可以是从芽孢杆菌物种，优选是从地衣芽孢杆菌获得的淀粉酶或蛋白酶基因。可以由一种或多种以下基因获得适合的信号肽编码序列麦芽糖α-淀粉酶基因、枯草杆菌蛋白酶基因、内酰胺酶基因、中性蛋白酶基因、PrsA基因和/或酰基转移酶基因。优选地，所述信号肽为地衣芽孢杆菌α -淀粉酶的信号肽、气单孢菌酰基转移酶的信号肽(如，mkkwfvcllglialtvqa-SEQ ID No. 21)、枯草芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的信号肽(如，mrskklwi si If alt liftmafsnmsaqa-SEQ ID No. 22)或地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的信号肽(如，mmrkksfwfgmltafmlvftmefsdsasa-SEQ ID No. 23)。适合地，所述信号肽可以为地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的信号肽。然而，可以使用能够指导所表达的脂酰基转移酶进入所选芽孢杆菌宿主细胞(优选为地衣芽孢杆菌宿主细胞)的分泌途径的任何信号肽编码序列。在本发明的一些实施方案中，编码信号肽的核苷酸序列可以可操作地连接编码所选脂酰基转移酶的核苷酸序列。所选脂酰基转移酶可以在本文所定义的宿主细胞中作为融合蛋白表达。表达载体术语“表达载体”是指能够在体内或体外表达的构建体。优选地，所述表达载体被引入到生物体如地衣芽孢杆菌宿主的基因组中。术语“引入”优选涵盖稳定的引入到基因组中。如本文所定义的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以存在于载体中，在该载体中所述核苷酸序列可操作地连接调控序列，使得所述调控序列能够通过适合的宿主生物体 (如地衣芽孢杆菌)表达所述核苷酸序列，即所述载体是表达载体。本发明的载体可以被转化到上述的适合的宿主细胞中，以表达具有如本文所定义的脂酰基转移酶活性的多肽。通常根据其将被引入的宿主细胞来选择载体(如质粒、粘粒、病毒或噬菌体载体、 基因组插入物)。本发明可以涵盖具有等同功能且本领域已知或可知的其它形式的表达载体。—旦转化到所选择的宿主细胞中，载体可以不依赖宿主细胞的基因组而复制并发挥功能，或可以自行整合进入基因组。所述载体可以包含一种或多种选择性标记基因，如提供抗生素抗性的基因，如氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性或四环素抗性的基因。或者，可以通过共转化完成选择(如W091/17243中所述)。载体可以在体外使用，例如，用于制备RNA或用于转染或转化宿主细胞。因此，在另一实施方案中，本发明提供用于本发明载体、宿主细胞、其它方法和/ 或应用中任一项的本发明的核苷酸序列或编码具有如本文所定义的特定性质的多肽的核苷酸序列的制备方法，所述方法是通过将核苷酸序列引入可复制载体，将所述载体引入相
8容的宿主细胞，并使宿主细胞在可以进行载体复制的条件下生长。所述载体可以进一步包含能使该载体在所述宿主细胞中复制的核苷酸序列。所述序列的实例为质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMBl和pIJ702的复制起点。脂酰基转移酶用于本发明方法、载体和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码天然的脂酰基转移酶或脂酰基转移酶变体。例如，用于本发明的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以是W02004/064537、 W02004/064987、W02005/066347或W02006/008508中所述的一种。这些文献通过引用并入本文。本文所用的术语“脂酰基转移酶”优选地是指具有脂酰基转移酶活性的酶(通常被归类为E. C. 2. 3. 1. X，如2. 3. 1. 43)，其中所述酶能够将酰基基团从脂质转移到一个或多个受体(acceptor)物质，如以下的一种或多种固醇(sterol)、留烷醇(stanol)、碳水化合物、蛋白、蛋白亚基、糖醇(如抗坏血酸和/或甘油)，优选甘油和/或固醇，如胆固醇。优选地，用于本发明载体、宿主细胞、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码能够将酰基基团从磷脂(如本文所定义)转移到糖醇(如抗坏血酸和 /或甘油，最优选为甘油)的脂酰基转移酶。对于一些方面，本发明的“酰基受体”可以是包含羟基基团(-0H)的任何化合物， 例如多价的醇，包括甘油、固醇、留烷醇、碳水化合物；羟酸，包括果酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸和抗坏血酸；蛋白或其亚基，如氨基酸、蛋白水解产物和肽(部分水解的蛋白)；和其混合物和衍生物。优选地，根据本发明的“酰基受体”不是水。优选地，根据本发明的“酰基受体” 是糖醇如多元醇，最优选为甘油。出于本发明的目的，抗坏血酸也被认为是糖醇。优选地，所述酰基受体不为甘油单酯。优选地，所述酰基受体不为甘油二酯。一方面，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以且能够将酰基基团从脂质转移到甘油，此外能够将酰基基团从脂质转移到以下的一种或多种物质碳水化合物、蛋白、蛋白亚基、固醇和 /或留烷醇，优选其能够转移到糖醇(如抗坏血酸和/或甘油，最优选为固醇(如胆固醇)) 和/或植物固醇/留烷醇。优选地，脂酰基作用的脂质底物是以下脂质中的一种或多种磷脂，如卵磷脂，如磷脂酰胆碱。所述脂质底物在本文中可以被称为“脂酰基供体”。本文所用的术语卵磷脂涵盖磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油。对于一些方面，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列优选编码不能或基本上不能作用于甘油三酯和/或ι-甘油单酯和 /或2-甘油单酯的脂酰基转移酶。对于一些方面，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码不表现出三酰基甘油(triacylglycerol)脂肪酶活性 (E. C. 3. 1. 1. 3)或不表现出显著的三酰基甘油脂肪酶活性(E. C. 3. 1. 1. 3)的脂酰基转移酶。
水解甘油三酯的能力(E. C. 3. 1. 1. 3活性)可以由根据Food Chemical Codex (3rdEd. ,1981,pp 492-493)(修改为葵花油、pH 5. 5以替代橄榄油、pH 6. 5)测定的脂肪酶活性来测定。脂肪酶活性以LUS(葵花的脂肪酶单位)来测定，其中将ILUS定义为在以上试验条件下每分钟可以从葵花油中释放1 μ mol脂肪酸的酶量。或者，也可以使用如W09845453中定义的LUT试验。此文献通过引用并入本文。用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码基本上不能作用于甘油三酯的脂酰基转移酶，所述脂酰基转移酶的LUS/mg可以小于1000，如小于500、如小于300、优选为小于200、更优选为小于100、更优选为小于50、更优选为小于20、更优选为小于10，如小于5、小于2、更优选为小于lLUS/mg。优选地，LUT/mg活性小于500，如小于300、优选为小于200、更优选为小于100、更优选为小于50、更优选为小于20、更优选为小于10，如小于5、小于2、更优选为小于lLUT/mg。用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码基本上不能作用于甘油单酯的脂酰基转移酶，所述脂酰基转移酶可以在LUS试验中使用单油酸酯(M77651-油酰-rac-甘油99% )以替代葵花油来测定。将IMGHU定义为在所述试验条件下每分钟可以从甘油单酯中释放1 μ mol脂肪酸的酶量。用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码基本上不能作用于甘油三酯的脂酰基转移酶，所述脂酰基转移酶具有的MGHU/mg可以小于5000，如小于1000、如小于500、如小于300、优选为小于200、更优选为小于100、更优选为小于50、更优选为小于20、更优选为小于10 (如小于5、小于2)、更优选为小于 lMGHU/mg。适合地，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码可以表现出一种或多种以下磷脂酶活性的脂酰基转移酶磷脂酶A2活性(E. C. 3. 1. 1. 4)和/或磷脂酶Al活性(E. C. 3. 1. 1. 32)。所述脂酰基转移酶也可以具有磷脂酶B活性(E. C 3. 1. 1. 5)。适合地，对于一些方面，所述脂酰基转移酶可以能够将酰基基团从磷脂转移到糖醇(优选为甘油和/或抗坏血酸)。对于一些方面，优选地用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码能够将酰基基团从磷脂转移到固醇和/或留烷醇以至少形成固醇酯和/或留烷醇酯的脂酰基转移酶。所述脂酰基转移酶可以能够将酰基基团从脂质转移到多元醇(如甘油)和/或固醇(如胆固醇或植物固醇)和/或留烷醇。因此，在一个实施方案中，本发明的“酰基受体”可以为甘油和/或胆固醇或植物固醇和/或留烷醇。优选地，所述脂酰基转移酶可以使用以下标准进行表征所述酶具有可以被定义为酯转移活性的酰基转移酶活性，通过此活性将脂酰基供体的原初酯键的酰基部分转移到酰基受体(优选为甘油或胆固醇)以形成新的酯；和所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基中的一种或多种L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M 或 S。优选地，⑶SX基序的X为L或Y。更优选地，⑶SX基序的X为L。因此，优选本发明的酶包含氨基酸序列基序GDSL。
GDSX基序由四个保守的氨基酸构成。优选地，该基序中的丝氨酸为所述脂酰基转移酶的催化性丝氨酸。适合地，⑶SX基序的丝氨酸的位置对应于Brumlik和Buckley (Journal of Bacteriology Apr. 1996，Vol. 178，No. 7，ρ 2060-2064)中教导的嗜水气单胞菌脂酰基转移酶的kr-16。为了测定蛋白是否具有本发明的⑶SX基序，优选使用W02004/064537或W02004/064987(均通过引用并入本文)中教导的方法，将序列与pfam数据库的隐马尔可夫模型序型(hidden markov model profile) (HMM 序型)进行比较。优选地，所述脂酰基转移酶可以使用Pfam00657共有序列进行比对(完整的解释可参见 W02004/064537 或 W02004/064987)。优选地，与pfam00657结构域家族的隐马尔可夫模型序型(HMM序型)的阳性匹配表示存在本发明的GDSL或GDSX结构域。优选地，当与Pfam00657共有序列进行比对时，用于本发明方法和/或应用的脂酰基转移酶可以具有至少一个、优选为大于一个、更优选为大于两个的下述部分(block)⑶GANDY、HPT0适合地，所述脂酰基转移酶可以具有⑶部分和GANDY部分。或者，所述酶可以具有GD&c部分和HPT部分。优选地，所述酶至少包含GD&c部分。更多细节请参见 W02004/064537 或 W02004/064987。优选地，GANDY基序的残基选自GANDY、GGNDA, GGNDL,最优选为GANDY。优选地，当与Pfam00657共有序列进行比对时，与嗜水气单胞菌多肽参考序列(SEQ ID No. 1)相比，用于本发明方法和/或应用的酶具有以下氨基酸残基中的至少一个、优选大于两个、优选大于三个、优选大于四个、优选大于五个、优选大于六个、优选大于七个、优选大于八个、优选大于九个、优选大于十个、优选大于十一个、优选大于十二个、优选大于十三个、优选大于十四个28hid、29hid、30hid、31hid、32gly、33Asp、34kr、35hid、130hid、131Gly、132Hid、133Asn、134Asp、135hid、309His。Pfam00657⑶SX结构域是区分有此结构域的蛋白和其它酶的独特标志。表3中显示了 pfam00657共有序列(SEQ ID No. 2)。其源自于对第6版数据库pfam家族00657 (在本文中也可以称为pfam00657. 6)的鉴定。所述共有序列可以通过使用较新版pfam数据库来升级(如参见W02004/064537或 W02004/064987)。在一个实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码可以使用以下标准进行表征的脂酰基转移酶(i)所述酶具有可以被称为酯转移活性的酰基转移酶活性，通过此活性将脂酰基供体的原初酯键的酰基部分转移到酰基受体(优选为甘油或胆固醇)以形成新的酯，优选分别为甘油单酯或胆固醇酯；(ii)所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是以下氨基酸残基中的一种或多种丄、八、￥、1、卩、丫、!1、0、11]1或3;(iii)所述酶包含 His-309 或在图 2 和 4 中(SEQ ID No. 1 或 SEQ ID No. 3)所示的嗜水气单胞菌脂酰基转移酶中His-309的对应位置上包含组氨酸残基。优选地，所述⑶SX基序的氨基酸残基为L。在SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1中，起始的18个氨基酸残基形成信号序列。全长序列(即包含信号序列的蛋白)中的His-309等同于蛋白的成熟部分(即不含信号序列的序列)中的His491。在一个实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶包含以下催化三联体Ser-34、Asp-306和His-309，或在图4 (SEQ ID No. 3)或图2(SEQ ID No. 1)中所示的嗜水气单胞菌脂酰基转移酶中kr-34、Asp-306和His-309的对应位置上分别包含丝氨酸残基、天冬氨酸残基和组氨酸残基。如上所述，在SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1所示的序列中，起始的18个氨基酸残基形成信号序列。全长序列(即包含信号序列的蛋白)中的kr-34、Asp-306和His-309等同于蛋白的成熟部分(即不含信号序列的序列)中的Ser-16、Asp-288和HiSj91。在图3 (SEQ ID No. 2)所示的pfam00657共有序列中，活性位点残基为Ser_7、Asp-345和His-348。在一个实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列编码可以使用以下标准进行表征的脂酰基转移酶所述酶具有可以被称为酯转移活性的酰基转移酶活性，通过此活性将第一脂酰基供体的原初酯键的酰基部分转移到酰基受体以形成新的酯；和所述酶至少包含Gly-32、Asp-33、kr-34、Asp-134 和 His-309，或在 SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1所示的嗜水气单胞菌脂酰基转移酶中Gly-32、Asp-33、kr-34、Asp-306和His-309的对应位置上分别包含甘氨酸残基、天冬氨酸残基、丝氨酸残基、天冬氨酸残基和组氨酸残基。适合地，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以是以下核苷酸序列中的一种
0129](a)SEQIDNo.36所示的核苷酉堯序列参见图29)、0130](b) SEQIDNo.38所示的核苷酉堯序列参见图31)、0131](c) SEQIDNo.39所示的核苷酉堯序列参见图32)、0132](d) SEQIDNo.42所示的核苷酉堯序列参见图35)、0133](e) SEQIDNo.44所示的核苷酉堯序列参见图37)、0134](f) SEQIDNo.46所示的核苷酉堯序列参见图39)、0135](g) SEQIDNo.48所示的核苷酉堯序列参见图41)、0136](h)SEQIDNo.49所示的核苷酉堯序列参见图57)、0137](i)SEQIDNo.50所示的核苷酉堯序列参见图58)、0138](j)SEQIDNo.51所示的核苷酉堯序列参见图59)、0139](k)SEQIDNo.52所示的核苷酉堯序列参见图60)、0140](I)SEQIDNo.53所示的核苷酉堯序列参见图61)、0141](m) SEQIDNo.讨所示的核苷酉堯序列参见图62)、0142](η)SEQIDNo.阳所示的核苷酉堯序列参见图6；3)、0143](ο)SEQIDNo.56所示的核苷酉堯序列参见图64)、0144](P) SEQIDNo.57所示的核苷酉堯序列参见图65)、0145](q) SEQIDNo.58所示的核苷酉堯序列参见图66)、0146](r)SEQIDNo.59所示的核苷酉堯序列参见图67)、
(s) SEQ ID No. 60所示的核苷酸序列(参见图68)、(t) SEQ ID No. 61所示的核苷酸序列(参见图69)、(u) SEQ ID No. 62所示的核苷酸序列(参见图70)、(V)SEQ ID No. 63所示的核苷酸序列(参见图71)或(w)与 SEQ ID No. 36、SEQ ID No. 38、SEQ ID No. 39、SEQ ID No. 42、SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 46,SEQ ID No. 48、SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 5USEQ ID No. 52、SEQ ID No. 53,SEQ ID No. 54、SEQ ID No. 55、SEQ ID No. 56、SEQ ID No. 57、SEQ ID No. 58、SEQ ID No. 59、SEQ ID No. 60、SEQ ID No. 61、SEQ ID No. 62 或 SEQ ID No. 63 中所示的任一序列具有70%或更高，优选为75%或更高同一性的核苷酸序列。适合地，所述核苷酸序列可以与SEQ ID No. 36、SEQ ID No. 38、SEQ ID No. 39、SEQID No. 42,SEQ ID No. 44,SEQ ID No. 46,SEQ ID No. 48,SEQ ID No. 49,SEQ ID No. 50,SEQID No. 5USEQ ID No. 52,SEQ ID No. 53,SEQ ID No. 54,SEQ ID No. 55,SEQ ID No. 56,SEQID No. 57、SEQ ID No. 58、SEQ ID No. 59、SEQ ID No. 60、SEQ ID No. 61、SEQ ID No. 62 或SEQ ID No. 63中所示的任一序列具有80%或更高，优选为85%或更高，更优选为90%或更高，且更优选为95%或更高同一性。在一个实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列为与SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 51、SEQ IDNo. 62和SEQ ID No. 63中所示的任一序列具有70%或更高，优选为75%或更高同一性的核苷酸序列。适合地，所述核苷酸序列可以与SEQ ID No. 49、SEQ ID No. 50、SEQ ID No. 51、SEQ ID No. 62和SEQ ID No. 63中所示的任一序列具有80%或更高，优选为85%或更高，更优选为90 %或更高，且更优选为95 %或更高同一性。在一个实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列为与SEQ ID No. 49中所示的序列具有70%或更高，75%或更高，80%或更高，优选为85%或更高，更优选为90%或更高，且更优选为95%或更高同一性的核苷酸序列。适合地，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码包含一种或多种以下氨基酸序列的脂酰基转移酶(i)SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列、(ii)SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列、(iii)SEQ ID No. 5所示的氨基酸序列、(iv) SEQ ID No. 6所示的氨基酸序列、(v) SEQ ID No. 7所示的氨基酸序列、(vi)SEQ ID No. 8所示的氨基酸序列、(vii)SEQ ID No. 9所示的氨基酸序列、(viii)SEQ ID No. 10所示的氨基酸序列、(ix) SEQ ID No. 11所示的氨基酸序列、(X)SEQ ID No. 12所示的氨基酸序列、(xi)SEQ ID No. 13所示的氨基酸序列、(xii)SEQ ID No. 14所示的氨基酸序列、
(xiii)SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列、(xiv)SEQ ID No. 15所示的氨基酸序列或与SEQ ID No. USEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ IDNo. 7、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、SEQ IDNo. 13,SEQ ID No. 14或SEQ ID No. 15 中所示的任一序列具有75%、80%、85%、90%、95%、
98%或更高同一性的氨基酸序列。适合地，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以包含如SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 4或SEQ IDNo. 1或SEQ ID No. 15所示的氨基酸序列，或包含与SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列或SEQID No. 4所示的氨基酸序列或SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列或SEQ ID No. 15所示的氨基酸序列具有75%或更高、优选为80%或更高、优选为85%或更高、优选为90%或更高、优选为95%或更高的同一性的氨基酸序列。适合地，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以包含与SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ IDNo. 5,SEQ ID No. 6,SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10,SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12,SEQ ID No. 13,SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 1 或 SEQ ID No. 15 中所示的任一序列具有80%或更高、优选为85%或更高、更优选为90%或更高、且更优选为95%或更高的同一性的氨基酸序列。适合地，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码包含一种或多种以下氨基酸序列的脂酰基转移酶(a) SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸残基1-100所示的氨基酸序列；(b)SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸残基101-200所示的氨基酸序列；(C)SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸残基201-300所示的氨基酸序列；或(d)与以上(a)至(c)中所定义的氨基酸序列中任一序列具有75%或更高、优选为85%或更高、更优选为90%或更高、且更优选为95%或更高的同一性的氨基酸序列。适合地，用于本发明方法和/或应用中的脂酰基转移酶可以包含一种或多种以下氨基酸序列(a) SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸残基观_39所示的氨基酸序列；(b) SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸残基77_88所示的氨基酸序列；(c)SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸残基1沈_136所示的氨基酸序列；(d)SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸残基163-175所示的氨基酸序列；(e) SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 1的氨基酸残基304-311所示的氨基酸序列；或(f)与以上(a)至(e)中所定义的氨基酸序列中任一序列具有75%或更高、优选为85%或更高、更优选为90%或更高、且更优选为95%或更高的同一性的氨基酸序列。一方面，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以是如EP 1275711中教导的来自于近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)的脂酰基转移酶。因此，一方面，用于本发明方法和应用中的脂酰基转移酶可以为包含SEQ ID No. 17或SEQ ID No. 18所教导的一种氨基酸序列的脂酰基转移酶。
优选地，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以是包含SEQ ID No. 16所示的氨基酸序列的脂酰基转移酶，或者是包含与SEQ ID No. 16具有75%或更高、优选为85%或更高、更优选为90%或更高、更优选为95%或更高、更优选为98%或更高、或更优选为99%或更高的同一性的氨基酸序列的脂酰基转移酶。所述酶可以被认为酶的变体。一方面，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以为卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)或其变体(如由分子进化产生的变体)。适合的LCAT为本领域已知的，且可以获得来自一种或多种如下的生物体，如哺乳类、大鼠、小鼠、鸡、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、植物(包括拟南芥(Arabidopsis)和水稻(Oryza sativa))、线虫、真菌和酵母。在一个实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以是可获得的，优选从带有PPetl2aAhydr0和pPetl2aA&ilm0的大肠杆菌株TOP 10获得的脂酰基转移酶，所述大肠杆菌株 TOP 10 由 Danisco A/S of Langebrogade 1, DK-IOOlCopenhagen K, Denmark根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约保藏在National Collectionof Industrial, Marine and Food Bacteria(NCIMB)23 St. Machar Street, AberdeenScotland，GB，保藏日为2003年12月22日，保藏号分别为NCIMB 41204和NCIMB41205。用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码磷脂甘油酰基转移酶。磷脂甘油酰基转移酶包括分离自气单孢菌，优选为嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌，最优选为杀鲑气单胞菌或其变体的那些磷脂甘油酰基转移酶。用于本发明的最优选的脂酰基转移酶可以由SEQ ID No. 1、3、4、15和16所编码。本领域技术人员可以理解，优选酰基转移酶的信号肽已经在转移酶的表达过程中被切割。SEQID No. 1、3、4、15和16的信号肽为氨基酸1-18。因此，最优选的区域为SEQ ID No. 1和SEQID No. 3 (嗜水气单胞菌)中的氨基酸 19-3；35，和 SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 15 和 SEQ IDNo. 16(杀鲑气单胞菌)中的氨基酸19-336。当用于测定氨基酸序列的同一性或同源性时，优选使用成熟序列进行本文所述的比对。因此，用于测定同源性(同一性)的最优选的区域为SEQ ID No.l和3(嗜水气单胞菌)中的氨基酸19-335 JPSEQ ID No. 4、15和16 (杀鲑气单胞菌)中的氨基酸19-336。SEQ ID 34和35分别是来自嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌的脂酰基转移酶的成熟蛋白序列。用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶也可以分离自喜热裂孢菌(Thermobifida)，优选为褐色喜热裂孢菌(T. fusca)，最优选其由SEQ ID No. 28编码。用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的核苷酸序列也可以分离自链霉菌属，优选为阿维链霉菌(S. avermitis)，最优选其由SEQ ID No. 32编码。用于本发明的来自链霉菌的其它可能的酶包括由SEQ IDNo. 5、6、9、10、11、12、13、14、31 和 33 所编码的那些酶。用于本发明的酶也可以分离自棒状杆菌属(Corynebacterium)，优选为C. efficiens，最优选其由SEQ ID No.四编码。适合地，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以包含SEQ ID No. 37、38、40、41、43、45或47所示的任一氨基酸序列，或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID No. 36、39、42、44、46或48所示的任一核苷酸序列所编码，或由与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的核苷酸序列所编码。在一个实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列选自由以下组成的组a)包含SEQ ID No. 36所示的核苷酸序列的核酸；b)由于遗传密码简并性而与SEQ ID No. 36的核苷酸序列相关的核酸；和c)包含与SEQ ID No. 36所示的核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序列的核酸。在一个实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶包含SEQ ID No. 37所示的氨基酸序列或与其具有至少60%同一性的氨基酸序列。在另一实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以包含SEQ ID No.37、38、40、41、43、45或47所示的任一氨基酸序列，或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列，或由SEQ ID No. 39、42、44、46或48所示的任一核苷酸序列所编码，或由与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的核苷酸序列所编码。在另一实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以包含SEQ ID No.38、40、41、45或47所示的任一氨基酸序列，或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列，以用于本发明。在另一实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以包含SEQ ID No.38、40或47所示的任一氨基酸序列，或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列，以用于本发明。更优选地，在一个实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以包含SEQ ID No. 47所示的氨基酸序列，或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同
一性的氨基酸序列。在另一实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以包含SEQ ID No. 43或44所示的氨基酸序列，或与其具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列。在另一实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶可以包含SEQ ID No. 41所示的氨基酸序列，或与其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列选自由以下组成的组a)包含SEQ ID No. 36所示的核苷酸序列的核酸；b)由于遗传密码简并性而与SEQ ID No. 36的核苷酸序列相关的核酸；和c)包含与SEQ ID No. 36所示的核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序列的核酸。在一个实施方案中，根据本发明的脂酰基转移酶可以是可获得的，优选从链霉菌属株L130或L131获得的脂酰基转移酶，所述链霉菌属株L130或L131由Danisco A/S of Langebrogade 1，DK-IOOlCopenhagen K，Denmark 根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约保藏在 National Collection of Industrial, Marine and FoodBacteria (NCIMB) 23St. Machar Street, Aberdeen Scotland, GB，保藏日为 2004 年 6 月 25日，保藏号分别为NCIMB 412 和NCMB 41227。用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的适合的核苷酸序列可以编码脂酰基转移酶(SEQ ID No. 16)，或可以编码脂酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID No. 17)。用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的适合核苷酸序列可编码如下所述的氨基酸序列，该氨基酸序列可使用Align X(使用默认设置的VectorNTI的Clustal W成对比对算法)通过与L131 (SEQ ID No. 37)序列的比对进行鉴定。L131与来自灰色链霉菌(S. avermitilis)和褐色喜热裂孢菌的同源物的比对可以显示GD&c基序(L131以及灰色链霉菌和褐色喜热裂孢菌中为GDSY)、GANDY框(其为GGNDA或GGNDL)和HPT部分(被认为是保守的催化性组氨酸)的保守性。这三个保守部分突出标记在图42中。与pfam Pfam00657共有序列(如W004/064987中所述)和/或本文公开的L131序列(SEQ ID No. 37)比对时，可以鉴定出三个保守区，⑶部分、GANDY部分和HTP部分(详述参见 W004/064987)。与pfam Pfam00657共有序列(如W004/064987中所述)和/或本文公开的L131序列(SEQ ID No. 37)比对时，i)用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码具有GD&c基序，更优选为选自GDSL或GDSY基序的GD&c基序的脂酰基转移酶；和/或ii)用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码具有GANDY部分，更优选为包含氨基GGNDx的GANDY部分，更优选为GGNDA或GGNDL的脂酰基转移酶；和/或iii)用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码优选具有HTP部分的脂酰基转移酶；和优选地，
iv)用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码优选具有GD&c或GDSY基序，和包含氨基GGNDx (优选为GGNDA或GGNDL)的GANDY部分，和HTP部分(保守的组氨酸)的脂酰基转移酶。脂酰基转移酶变体在优选的实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶为脂酰基转移酶变体。可以使用对磷脂的活性增加的变体，如对磷脂的水解活性增加和/或转移酶活性增加的变体，优选为对磷脂的转移酶活性增加的变体。优选地，通过如上定义的脂酰基转移酶的一个或多个氨基酸修饰来制备所述脂酰基转移酶变体。适合地，当用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列所编码的脂酰基转移酶为脂酰基转移酶变体时，在此情况中，所述酶的特征为所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种L、A、V、I、F、Y、H、Q、Τ、N、M或S，且其中所述酶变体相对于亲本序列在第2组、第4组、第6组或第 组限定的一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸修饰(如W02005/066347和下文所定义)。例如，脂酰基转移酶变体可以被表征为所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种L、A、V、I、F、Y、H、Q、Τ、N、M或S，且其中酶变体相对于亲本序列在第2组、第4组、第6组或第7组限定的一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸修饰(如W02005/066347和下文所定义)，所述组是通过所述亲本序列与本文定义的Ρ10480结构模型在结构上进行比对而鉴定出来的，其优选是通过Ρ10480晶体结构等同物(crystal structure coordinates)与如 W02005/066347 和下文所定义的 1IVN. PDB 和/或1DE0. PDB的结构比对而获得的。在其它实施方案中，用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码脂酰基转移酶变体，其可以被表征为所述酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种L、A、V、I、F、Y、H、Q、Τ、N、M或S，且其中酶变体相对于亲本序列在第2组所教导的一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸修饰，所述第2组是在将所述亲本序列与pfam共有序列(SEQ ID No. 2-图3)比对时被鉴定出来的，并根据Ρ10480的结构模型进行修饰以确保如W02005/066347和下文所定义的最佳符合交叠(best fit overlap)。适合地，当用于本发明宿主细胞、载体、方法和/或应用中任一项的编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码可包含以下氨基酸序列的脂酰基转移酶变体，其中所述氨基酸序列如 SEQ ID No. 34、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6、SEQ IDNo. 7、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、SEQ IDNo. 13、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. USEQ ID No. 15、SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 26、SEQ IDNo. 27、SEQ ID No. 28、SEQ ID No. 29、SEQ ID No. 30、SEQ ID No. 32 或 SEQ ID No. 33 所示，并在第2组、第4组、第6组或第7组限定的一个或多个氨基酸残基处有一个或多个氨基酸修饰(如W02005/066347和下文所定义)，所述组是通过与SEQ ID No. 34的序列比对而鉴定出来的。
或者，编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码包含以下氨基酸序列的脂酰基转移酶变体，其中所述氨基酸序列如SEQ ID No. 34,SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6,SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 19,SEQ ID No. 10,SEQ ID No. IUSEQID No. 12、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. USEQ ID No. 15、SEQ ID No. 25、SEQID No. 26、SEQ ID No. 27、SEQ ID No. 28、SEQ ID No. 29、SEQ ID No. 30、SEQ ID No. 32 或SEQ ID No. 33所示，并在第2组、第4组、第6组或第7组限定的一个或多个氨基酸残基处有一个或多个氨基酸修饰(如W02005/066347和下文所定义)，所述组是通过所述亲本序列与本文定义的P10480的结构模型在结构上进行比对而鉴定出来的，其优选是通过P10480晶体结构等同物与如W02005/066347和下文所教导的1IVN. PDB和/或1DE0. PDB的结构比对而获得的。或者，编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码包含以下氨基酸序列的脂酰基转移酶变体，其中所述氨基酸序列如SEQ ID No. 34,SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 19、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. USEQ ID No. 15、SEQ ID No. 25、SEQ ID No. 26,SEQ ID No. 27,SEQ ID No. 28,SEQ ID No. 29,SEQ ID No. 30,SEQ ID No. 32或SEQ ID No. 33所示，并在第2组所教导的一个或多个氨基酸残基处有一个或多个氨基酸修饰，所述第2组是在将所述亲本序列与pfam共有序列(SEQ ID No. 2)比对时被鉴定出来的，并根据P10480的结构模型进行修饰以确保如W02005/066347和下文所教导的最佳符合交叠。优选地，所述亲本酶是包含SEQ ID No. 34和/或SEQ ID No. 15和/或SEQ IDNo. 35所示氨基酸序列或与它们同源的酶。优选地，编码脂酰基转移酶的核苷酸序列可以编码包含以下氨基酸序列的脂酰基转移酶变体，其中所述氨基酸序列如SEQ ID No. 34或SEQ ID No. 35所示，并在如W02005/066347和下文所定义的第2组、第4组、第6组或第7组限定的一个或多个氨基酸残基处有一个或多个氨基酸修饰。组的定义第1组氨基酸第1组氨基酸(注意这些是图53和图M的IIVN中的氨基酸)Gly8. Asp9. SerlO. LeulU Serl2、Tyrl5、Gly44、Asp45、Thr46、Glu69、Leu70、Gly7U Gly72、Asn73、Asp74、Gly75、Leu76、Glnl06、Ilel07、Argl08、Leul09、ProllO、Tyrll3、Phel21、Phel39、Phel40、Metl41、Tyrl45、Metl51、Aspl54、Hisl57、Glyl55、Ilel56、Pro158从第1组中不包含高度保守的基序，如⑶和催化残基(标有下划线的残基)。为了避免争议，第1组定义了 IIVN模型活性位点中在甘油的中心碳原子10 A以内的氨基酸残基。第2组氨基酸第2组氨基酸(注意氨基酸的编号是指P10480成熟序列中的氨基酸)Leu 17、Ly s22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Ly s82、Asn87、Asn88、Trp 111、Val 112、Alall4、Tyrll7、Leull8、Prol56、Glyl59、Glnl60、Asnl61、Prol62、krl63、Alal64、Argl65、Serl66、Glnl67、Lysl68、Vall69、Vall70、Glul71、Alal72、Tyrl79、Hisl80、Asnl81、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289 和 Val290。
第1组和第2组中所选残基的比较表


本发明涉及脂酰基转移酶的制备方法，步骤包括(i)提供地衣芽孢杆菌细胞；(ii)用编码脂酰基转移酶的异源核苷酸序列转化地衣芽孢杆菌细胞；和(iii)在启动子序列的控制下在细胞中表达脂酰基转移酶。此外，本发明还涉及地衣芽孢杆菌在表达脂酰基转移酶中的应用，包含异源脂酰基转移酶的地衣芽孢杆菌宿主细胞，和包含编码脂酰基转移酶的核苷酸序列的载体，所述核苷酸序列可操作地连接与地衣芽孢杆菌同源的启动子序列。