专利名称：一种成骨性种子细胞一体化动态接种培养配套生物反应器的制作方法目前，骨缺损是骨科临床中的常见问题。但在治疗过程中因软组织嵌入、不适当的内固定、缺乏血运、骨质疏松、代谢性疾病、感染等原因造成骨折延迟愈合或骨不连，需要行二次手术。骨移植术是治疗骨缺损和促进骨折愈合的重要手段之一，采用自体骨移植修复骨缺损因其能为成骨细胞和骨组织的生长提供支架(骨传导性)、诱导周围组织中的成骨前体细胞向缺损区域内的移行和向成骨细胞分化(骨诱导性)、直接提供可参与成骨活动、形成新骨的成骨细胞(骨生成性)等特点，至今仍是骨移植的“金标准”。但是，自体骨骨量有限，取骨手术增加了患者的创伤和痛苦、延长了手术时间，且存在供区感染、出血、疼痛等并发症。组织工程概念的提出和骨组织工程技术的发展为骨缺损的临床治疗提供了一种新的骨移植物组织工程骨。利用组织工程技术在体外构建骨组织，主要是将成骨性种子细胞复合到各种支架材料上，再联合物理、化学和生物因子等因素的作用，促进细胞生长、 增殖和成骨性分化，最终形成组织的过程。因此，它兼具骨传导性、骨诱导性和骨生成性，是 “理想的骨移植物”。同时，组织工程骨不受骨量的限制，无供区并发症和免疫排斥反应、细菌和病毒性疾病传播的危险。细胞静态接种与培养是应用最早和最普遍的工程化组织体外构建方法。该方法简便易行，许多研究也使用静态方法体外构建组织工程骨并在动物体内异位成骨或骨缺损修复实验中取得了成功。但是随着组织工程研究逐渐转向临床应用以及对组织工程骨体积、 形态和成骨性能等方面要求的提高，静态接种和培养方法自身固有的缺陷逐渐显露出来。 静态接种的细胞通常依靠重力、负压或毛细管作用进入支架，难以对其进行控制，导致细胞接种效率低和在支架内分布不均勻。静态培养的细胞生长所需的营养供应和气体交换通过物质的浓度梯度差即弥散作用实现，这使得营养物质和氧气向支架内部的传输效率和范围均十分有限，造成支架内部营养和氧气供应不足，导致细胞仅能在支架周边存活，出现构建组织的“空心化”。此外，细胞接种和细胞培养普遍为两个相互独立的环节，需要人工将接种细胞的支架材料转移入培养容器内，这显然增加了微生物污染的危险性，也影响了组织构建效果。发明内容针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本实用新型的目的在于，提供一种成骨性种子细胞一体化动态接种培养配套灌注式生物反应器。为了实现上述任务，本实用新型采取如下的技术解决方案[0007]—种成骨性种子细胞一体化动态接种培养配套生物反应器，其特征在于，由蠕动泵、灌流室和贮液瓶通过连接管和第一、第二、第三、第四通道转换器构成；其中，蠕动泵与灌流室通过第三通道转换器一端相连，灌流室的另一端通过第一通道转换器分成两路，一路通过第二通道转换器和防水型蠕动泵连通，另一路连接贮液瓶；贮液瓶还通过第四通道转换器与第二通道转换器连接。本实用新型的其它特点是所述的蠕动泵通过第三通道转换器和灌流室连通，灌流室通过第一通道转换器和贮液瓶连通，贮液瓶通过第二通道转换器和第四通道转换器与蠕动泵连通构成培养环路；所述的蠕动泵通过第三通道转换器和灌流室连通，灌流室通过第一通道转换器和第二通道转换器与蠕动泵连通构成接种环路。 所述的蠕动泵为防水型蠕动泵。所述的连接管为透气性管。采用本实用新型的成骨性种子细胞一体化动态接种培养的配套生物反应器，在组织工程骨构建必需的细胞接种及培养过程中，通过灌注式生物反应器进行细胞的一体化动态接种及培养，增强细胞接种效率和均勻度，增大营养和氧气供应范围和效率，同时对成骨细胞提供剪应力刺激，使细胞接种和培养在同一稳定环境中一体化进行，避免了转换环节， 较现有细胞接种及培养技术而言为细胞粘附、生长、分布、分化和组织构建提供更适宜的环境，显著加强了组织工程骨构建的效果。图1是本实用新型所涉及的灌注式生物反应器结构及其工作状态示意图；图中的连接管路用标记9表示，粗箭头标记10表示灌注培养状态，细箭头标记11表示灌注接种状态。以下结合附图对本实用新型作进一步的详细说明。参照图1，本实用新型的成骨性种子细胞一体化动态接种培养的配套生物反应器， 由防水型蠕动泵1、灌流室2、贮液瓶3、第一、第二、第三和第四通道转换器(4，5，6，7)和连接管9组成灌注接种环路10和灌注培养环路11的双环路结构。其中，蠕动泵1与灌流室 2通过第三通道转换器6 —端相连，灌流室2的另一端通过第一通道转换器4分成两路，一路通过第二通道转换器5和防水型蠕动泵1连通，另一路连接贮液瓶3 ；贮液瓶3还通过第四通道转换器7与第二通道转换器5连接。使用过程中，通过调节第一通道转换器4和第二通道转换器5即可在两个环路间进行切换蠕动泵1通过第三通道转换器6和灌流室2连通，灌流室2通过第一通道转换器 4和贮液瓶3连通，贮液瓶3通过第二通道转换器5和第四通道转换器7与防水型蠕动泵1 连通构成培养循环环路11 ；蠕动泵1通过第三通道转换器6和灌流室2连通，灌流室2通过第一通道转换器 4和第二通道转换器5与防水型蠕动泵1连通构成接种循环环路10 ；蠕动泵1为防水型蠕动泵，由防水型蠕动泵提供灌注动力，灌流室2内放置支架材料8，贮液瓶3内贮存培养液，连接在灌流室2入管上的第三通道转换器6用于加注细胞悬液，连接在贮液瓶3出管上的第四通道转换器7用于更换培养液和取样检测。环路中的连接管9均为透气性管，可保持生物反应器内、外自由的气体交换。采用本实用新型的成骨性种子细胞一体化动态接种培养的配套生物反应器，在用于组织工程骨构建的成骨性种子细胞一体化动态接种培养时，根据支架材料的不同选取相应的灌流室，支架材料8预装入灌流室2后连接整个环路使之完全密闭，灌注式生物反应器整体消毒后将第一通道转换器4和第二通道转换器5调节成灌注接种状态(图中的粗箭头 10表示的回路)，关闭灌注培养环路11并经第三通道转换器6向接种循环环路10内注满培养液。将接种循环环路安装在蠕动泵1上，置于5%C02，37°C培养箱内1 后更换新鲜培养液，通过第三通道转换器6向环路内注入细胞悬液5mL，开启蠕动泵1，以设定速率进行灌注接种。灌注接种完毕后关闭接种循环环路10，向贮液瓶3内添加培养液，开通灌注培养环路11，以设定速率进行灌注培养，直到细胞在支架材料内增殖复合，得到细胞-支架复合体。得到的细胞-支架复合体移植入动物或人体内进行研究或治疗。在组织工程骨构建的细胞接种及培养过程中，采用该成骨性种子细胞一体化动态接种培养的配套生物反应器进行细胞的一体化动态接种及动态培养，增强细胞接种效率和均勻度，增大营养和氧气供应范围和效率，同时对成骨细胞提供剪应力刺激，使细胞接种和培养在同一稳定环境中一体化进行，避免了转换环节，较现有细胞接种及培养技术而言为细胞粘附、生长、分布、分化和组织构建提供更适宜的环境，显著加强了组织工程骨构建的效果。