专利名称：前列腺素F2α及类似物用于愈合角膜和结膜损害的用途的制作方法角膜和结膜损害是向医生就诊的患者中诊断的最多的疾病之一，并且是失明主要原因之一。这些损害可以有不同的原因，但是它们主要是因为变态反应、感染(细菌、病毒 和真菌)、干眼症、手术和其它创伤。这些损害是有害的并且是非常疼的。这些损害的症状可以是干燥、燃烧样和沙-砾样眼刺激。症状还可以描述为眼睛发痒、刺痒、刺痛或者疲劳。其它症状有眼睛疼痛、发红、胀痛和眼底压迫感。眼睛表面的损伤增加了对强光的不适和敏感。眼睛表面的损害需要治疗和极其快速地治愈以避免状况恶化和出现并发症例如溃疡形成，在大多数严重病例中溃疡形成会导致视敏度丧失和失明。对于因干眼症而致损害的治疗，存在许多起润滑作用的溶液和吸水水凝胶。然而，这些产品仅缓解症状而不能加速损害的愈合过程。对于更深的损害，有一些维生素A溶液可帮助愈合但是效率有限。除此之外，增强黏蛋白分泌的组合物是引人关注的。黏蛋白是对上皮细胞，特别是角膜和结膜上皮细胞提供保护和润滑作用的细胞外蛋白质(跨膜或者分泌的蛋白质)。已经证明，黏蛋白由人眼杯状细胞和角膜上皮细胞囊泡分泌并且释放在结膜上皮表面上(Greiner等，Mucus Secretory Vesicles in Conjunctival Epithelial Cells of Wearers ofContact Lenses, Archives of Ophthalmology,98 :1843-1846(1980)；以及 Dilly 等，Surface Changes in the Anaesthetic Conjunctiva in Man， with Special Referenceto the Production of Mucus from a Non-Goblet-Cell Source， British Journal ofOphthalmology,65 :833-842(1981))。当对角膜和结膜损害进行治疗时，问题在于活化和促进愈合的自然机制，例如细胞增殖和生长因子、黏蛋白和糖基氨基-聚糖分泌。另一个问题是促进/增强愈合过程和缓解与干眼病有关或无关的症状。舒而坦 (Xalatan )是目前世界上处方开具最多的抗青光眼药物。其包含0. 005%浓度的前列腺素F2 α类似物拉坦前列素(Iatanoprost)。该产品以通过0. 02%苯扎氯铵(benzalkonium chloride)防腐的5ml多剂量瓶销售。尽管舒而坦 对于青光眼的治疗非常不错，但是它具有副作用，一些副作用可能源于防腐剂的存在。在用舒而坦 滴眼剂对这种慢性终身性疾病治疗数月之后，舒而坦 滴眼剂开始刺激和损害眼睛表面。因此，患有青光眼的患者随后会患有角膜和结膜损害。还怀疑长期使用这种产品会引起干眼病(Erb等,2008 ；Eamon等，J Glaucoma, 2008年8月)。因此,对于患有眼睛表面疾病的青光眼患者不考虑使用经防腐处理的药物，包括舒而坦 。对于具有眼睛表面疾病并且还患有青光眼的患者，存在的问题是在实现对青光眼进行有效治疗的同时还治疗(并且不恶化)他们的眼睛表面损害或疾病。US 2005124699描述了局部应用前列腺素E用于治疗或预防角膜和/或结膜上皮细胞疾病的用途。该专利更加特别地描述单独的或者组合的前列腺素El或者E2，或者与抗炎药组合的用途。前列腺素F2a既没有被公开也没有被建议作为对角膜和结膜疾病的可能的治疗。前列腺素E可以用于治疗角膜和结膜损害。然而，在对治疗产生变态反应或者抗性的病例中对患者进行替代治疗常常是有益的。
申请人:解决了上述技术问题，并且配制了用于治疗角膜和/或结膜损害的新组合物，其中组合物包含治疗量的，优选占总组合物O. 0001 %至O. 005 % w/w范围内的浓度的前列腺素F2 α类似物或其衍生物，所述组合物为适宜在眼睛表面局部应用的形式并且无任何类型的有害防腐剂。本发明的组合物在眼睛表面改变的动物模型中测试以评价它们可能的毒性。如所预期，申请人注意到，本发明的组合物对角膜表面没有显示出毒性征兆，但是令人惊奇地是，组合物具有眼睛愈合特性。这些愈合特性在使用舒而坦 时没有观察到，尽管舒而坦 使用前列腺素(PG)F2a作为活性剂。这最有可能是因为舒而坦⑧中所用的防腐剂充当了PG类似物愈合特性的掩蔽剂。因此本发明的组合物适宜治疗眼睛表面疾病，包括角膜和结膜损害，更加特别地是源于不同原因(手术、PRK、LASIK、感染等)的创伤和干眼症(源于医源性原因、免疫学原因或者环境原因)。本发明的组合物还具有更多的优点。例如，前列腺素F2ci已经在眼科中使用多年并且它们的毒性、副作用和药物代谢动力学特征众所周知。使用前列腺素F2a开发的本发明的组合物可以快速地应用于患者，因为关于这些治疗剂积累了很多知识。由于迫切需要治疗角膜和结膜损害，选择前列腺素F2 α似乎是恰当的。组合物的另一个优点在于它组合了不同的作用机制。在本发明的一个实施方案中，组合物是低渗性的以校正干燥的结果。渗透保护剂例如赤藓糖醇可加入到组合物中以保护角膜细胞不会渗透性外流。还可加入增稠剂和/或增湿剂以产生润滑效果和湿润效果O在另一个实施方案中，本发明的组合物是等渗的。前列腺素可以作为滴眼剂或人工泪液；凝胶，优选粘稠凝胶；固体插入物或者软膏剂局部施用。组合物可以是溶液形式，例如水溶液，胶束溶液；或者悬浮液形式；或者阴离子或阳离子乳状液形式。根据一个优选的实施方案，组合物是阳离子乳状液。不希望被任何理论所联系，申请人证明，前列腺素F2ci的效果可以根据下列机制解释前列腺素F2ci类似物可活化FP受体(细胞表面上的前列腺素F受体)。这种结合可活化黏蛋白MUC5AC从杯状细胞分泌，因此增加了眼睛表面的水化作用和保护了眼睛表面(Chung WC, Ryu SH, Sun H，Zeldin DC，Koo JS. CREB mediates prostaglandinF2alpha_induced MUC5AC overexpres sion. J Immunol. 2009 ; 182 (4) :2349-56)。前列腺素可同时增加基质金属蛋白酶(MMP)分泌，这有利于创伤愈合过程中的细胞重塑和细胞形状改变(Mietz H，Esser JM, Welsandt G，Kociok N，Hueber A，Joussen A，Esser P，Krieglstein GK. Latanoprost stimulates secretion of matrix metalloproteinasesin tenon fibroblasts both in vitro and in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003 ；44(12) :5182-8)。 前列腺素还通过诱导EGR-I (早期生长应答因子-I)改善创伤愈合(Xu W，ChouCL，Sun H，Fujino H，Chen QM, Regan JW. FP prostanoid receptor-mediated inductionof the expression of early growth response factor-1 by activation of a Ras/Raf/mitogen-activated protein kinase signaling cascade. Mol Pharmacol. 2008 ;73 (I)111-8)o下面图示说明接触前列腺素F2 α后连续的级联事件(+)代表“活化”。PGF2a — (+) FP 受体—(+) PLC, PKC, Ca2+ 信号传导 i(+)
IP.S 和 DAG
U+) 4 ㈩
增加 Ca2+ PKC
i(+)
SPLA2 (具有创伤愈合活性)
PGF2a (+) EGF + EGFR (+)细胞增殖
4 (+)
15-HETE (具有黏蛋白的促分泌活性)
4 (+)
LXA4 (是抗炎性的并且有利于再次形成上皮)这些级联的活化会导致黏蛋白分泌，这有效促进损害的愈合(Landreville S，Coulombe S，Carrier P，Gelb MH,Guerin SL，Salesse C. Expression of phospholipasesA2 and C in human corneal epithelial cells.Invest Ophthalmol Vis Sci.2004 年11 月；45 (11) :3997-4003 ；Gronert K.Lipid autacoids in inflammation and injuryresponses a matter of privilege. Mol Interv. 2008 ；8 (I) :28-35)。根据本发明，申请人选择但不限于前列腺素F2a或其类似物和衍生物，更优选拉坦前列素、拉坦前列素游离酸、15-酮-拉坦前列素、拉坦前列素氮氧化物、乌诺前列酮(unoprostone)、比马前列素(bimatoprost)、曲伏前列素(travoprost)、他氟前列素(tafIuprost)和其它衍生物作为活性物质。根据一个实施方案，组合物中的前列腺素浓度在O. 0001%和O. 005%重量/重量之间。根据另一个实施方案，组合物是未经防腐的。
根据一个实施方案，组合物在室温下是稳定的。根据另一个实施方案，组合物通过温和防腐剂防腐。温和防腐剂可以是山梨酸、硼酸、EDTA、硫酸锌、过硼酸钠、purite或者聚六亚甲基双胍。眼用组合物可以包含抗氧化剂(抗坏血酸、维生素E、EDTA)。根据一个实施方案，本发明的组合物是无菌的。根据一个优选的实施方案，本发明的组合物通过加热或者过滤除菌。根据一个实施方案，组合物是低渗性的。组合物可以是前列腺素F2 α或其类似物和衍生物与增稠剂和/或增湿剂的组合，所述增稠剂和/或增湿剂是例如用于缓解干眼症的聚合物，例如但不限于聚乙烯醇、葡聚糖、聚卡波非(polycarbophil)、羟丙基甲基纤维素、羧基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、PEG-400、卡波普(carbopols)、轻丙基甲基纤维素(hypromellose)、聚山梨酸酯80、羟丙基瓜尔胶、透明质酸、壳聚糖、葡聚糖及其它。这些聚合物可以单独或者与其它成分一起加入到组合物中。组合物可以与渗透保护剂组合，诸如甘油、右旋糖、丙二醇、谷氨酸、胆碱、N-乙酰天冬氨酸、甘氨酸、甜菜碱、海藻糖、脯氨酸、L-肉碱、肌氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、二甲基甘氨酸、牛磺酸、β -丙氨酸、赤藻糖醇、葡萄糖和麦芽糖。组合物可含有一种或更多种渗透保护剂。组合物还可以与其它愈合剂相组合，诸如乙酰基半胱氨酸、维生素A、D、E和K、叶黄素、芦荟提取物例如aloine、氰基钴胺素和衍生物。组合物可以与可阻止感染或者活化上皮生长因子的其它试剂，即促分泌剂，诸如15(S)_HETE、前列腺素E和Fl α，或者可通过与F2 α前列腺素互补的作用机制帮助损害愈合的抗炎剂相组合。这些试剂可以是抗生素，诸如氯霉素(chloramphenicol)、环丙沙星(ciprofloxacin)、庆大霉素(gentamycin)、红霉素(erythromycin)、万古霉素(vancomycine)、亚胺硫霉素(imipeneme)、磺胺卩密I淀(sulfadiazine);抗真菌剂，诸如两性霉素 B (amphotericin B)、酮康唑(ketoconazole)、益康唑(econazole)、氟康唑(fluconazole)、咪康唑(iconazole);抗病毒剂，诸如碘苷(idoxuridine)、阿昔洛韦(acyclovir)、更昔洛韦(ganciclovir)、西多福韦(cidofovir)、干扰素、DDI> AZT、磷甲酸(foscarnet)、阿糖腺苷(vidarabine);抗炎性剂,诸如非类固醇抗炎性剂,诸如水杨酸盐(salicylate)、卩引哚美辛(indomethacin)、布洛芬(ibuprofen)、双氯酌·酸(diclofenac) >氟比洛芬(flurbiprofen)、卩比罗昔康(piroxicam),或者类固醇治疗剂，包括但不限于倍氯米松(beclomethasone)、倍他米松(betamethasone)、皮质酮(corticosterone)、可的松(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、地塞米松掠榈酸酯(dexamethasonepalmitate)、二氟泼尼酯(difIuprednate)、氟米松(fIumethasone)、醋酸氟轻松(fluocinolone acetonide)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone)、利美索龙(rimexolone)、替可的松(tixocortol)、去炎松(triamcinolone)及其类似物、衍生物、前体药物、盐和亲脂性酯、前列腺素E2衍生物。 在另一个实施方案中，治疗剂可以与愈合剂相组合，所述愈合剂包括但不限于维生素A、维生素E、维生素D和维生素K、α -生育酚衍生物、视黄醇衍生物、叶黄素、芦荟提取物诸如aloine、ω-3脂肪酸、氰钴胺、L-胱氨酸、吡哆醇、乙酰基半胱氨酸、精油诸如金盏花、雪松、薰衣草的油，及其类似物和衍生物根据一个实施方案，可以通过包含合适的缓冲液诸如磷酸盐或硼酸盐缓冲液而缓冲组合物以维持PH稳定性。本发明的组合物可以包含增稠剂和/或增湿剂。根据一个实施方案，组合物包装在单次使用瓶、多剂量滴管或无防腐剂多剂量滴管内。使用方法本发明的另一个目标是用于治疗眼睛表面疾病的方法，包含向需要治疗的患者施用如上所述的本发明的组合物，组合物中前列腺素F2a的治疗量范围以重量计优选占组合物总重量的O. 0001 %至O. 005 %。在该实施方案中，本发明的组合物优选每天至少一次施用，每天最多4滴。本发明的另一目标是用于治疗眼睛表面疾病，优选角膜和/或结膜损害的方法，包含向需要治疗的患者施用本发明的组合物，即包含治疗量的前列腺素F2a或其类似物或衍生物的组合物。在本发明的方法的一个优选实施方案中，组合物中前列腺素F2a或其类似物或衍生物的治疗量范围以重量计占组合物总重量的O. 0001%至O. 005%。有利地，在本发明方法中使用的组合物无有害的防腐剂。在一个实施方案中，前列腺素F2 a类似物选自由拉坦前列素、拉坦前列素游离酸、15-酮-拉坦前列素、拉坦前列素氮氧化物、乌诺前列酮、比马前列素、曲伏前列素、他氟前列素组成的群组。根据一个实施方案，组合物是水溶液、粘稠或半粘稠凝胶、悬浮液、固体插入物或者阴离子或阳离子乳状液。优选地，组合物是滴眼剂、人工泪液、凝胶或软膏剂形式。在本发明方法中使用的组合物可以是等渗的或者低渗的。组合物还可包含渗透保护剂，或其它愈合剂、缓冲液、增稠剂、增湿剂和抗氧化剂。如在方法中所使用，本发明的组合物可以是未经防腐的、无防腐剂的、自身防腐的或者用温和防腐剂防腐。根据本发明的方法，组合物可以每天至少一次施用，每天最多4滴。在一个实施方案中，组合物在3至5天过程中施用。根据本发明的方法，组合物还可包含抗青光眼试齐IJ、抗炎剂、抗生素、抗病毒剂或抗真菌剂和其它促分泌化合物。根据第一实施方案，患者没有患青光眼。在该实施方案中，本发明组合物中前列腺素F2 a ,优选拉坦前列素的治疗量范围以重量计占组合物总重量的O. 0001%至O. 004%或者至小于O. 004%，优选O. 0005%至O. 002% ;在该实施方案中，优选地，组合物在3至5天过程中施用。根据第二实施方案，患者患有青光眼。在该实施方案中，本发明组合物中前列腺素F2 a ,优选拉坦前列素的治疗量范围以重量计占组合物总重量的O. 004%至O. 005%或者从大于O. 004%至小于O. 005%。在该适应症中，剂量方案优选每天一滴。牛产过稈水溶液前列腺素以足够的浓度置于水中并通过磁力搅拌混合。如果前列腺素难以溶解，可以将溶液经高剪切混合器混合10分钟。还可加入表面活性剂或者共溶剂或者将溶液稍微加热至50°c帮助溶解。乳状液本发明的乳状液可以根据下列步骤制备
-通过混合前列腺素和饱和油(诸如MCT)制备油相，-通过混合水溶性成分(渗透保护剂、稠化剂、缓冲液)和纯化水制备水相；-将油相掺入到水相中；-快速加热所得到的粗制乳状液，优选在75°C下；-通过本领域技术人员已知的任何适宜方法，例如通过剪切混合降低乳状液微滴大小；-使用冰浴将乳状液优选冷却至大约20V ；-将冷却的乳状液均匀化处理；-任选地，通过使用例如NaOH或HCl调节pH至生理pH；-任选地通过高压蒸汽灭菌法将乳状液灭菌。[定义]在本发明的意图中，下列术语具有下列含义温和防腐剂防腐剂是保持在使用阶段过程中组合物中无微生物的化合物。温和防腐剂是对眼睛表面没有有害作用的防腐剂。其包括山梨酸、硼酸、EDTA、硫酸锌、过硼酸钠、purite或者聚六亚甲基双胍。其排除以通常浓度使用的苯扎氯铵、硫柳汞、聚季铵盐、对轻基苯甲酸甲酯和丙酯、三氯叔丁醇、西卩比氯铵(cetylpyridinium chloride)、苯扎溴铵(benzododecinium bromide)。有害防腐剂是在一次至多次应用后损伤眼睛表面的防腐剂，或者充当掩蔽剂以阻止前列腺素使角膜和结膜损害愈合的防腐剂。它们包括以通常浓度，即从O. 006%至O. 2%范围内的浓度使用的苯扎氯铵、硫柳汞、聚季铵盐、对羟基苯甲酸甲酯和丙酯、三氯叔丁醇、西吡氯铵、苯扎溴铵。治疗量意思是指活性物质足以对眼睛疾病产生治疗效果，以致于与未治疗眼睛相比减少或者防止所述眼睛疾病症状的量或者浓度。多剂量的无防腐剂瓶是系统可以不使用防腐剂而维持无菌的多剂量容器。渗透保护剂渗透保护剂是通过穿透进入细胞内并调节渗透流量防止细胞在渗透休克时爆裂或者质壁分离的化合物。这些化合物包括甘油、右旋糖、丙二醇、谷氨酸、胆碱、N-乙酰天冬氨酸、甘氨酸、甜菜碱、海藻糖、脯氨酸、L-肉碱、肌氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、二甲基甘氨酸、牛磺酸、β -丙氨酸、赤藻糖醇、葡萄糖和麦芽糖。角膜和结膜损害定义为通过变态反应、来自医源性原因、免疫学原因或者环境原因的干眼症、化学烧伤、来自病毒、细菌或真菌来源的感染、损伤或手术(PRK、LASIK)或者其它物理和化学损伤或创伤引起的角膜和结膜细胞/组织的任何损害、创伤、损伤或刺激。未经防腐的是表示滴眼剂没有通过欧洲和美国药典抗菌有效性测试。根据一个实施方案，未经防腐的组合物是无任何防腐剂的。可药用载体是指当配制时其是安全的并正确递送有效量前列腺素F2 α至眼睛表面的任何媒介物。前列腺素F2a或前列腺素F2 a类似物前列腺素是从脂肪酸酶促衍生并在体内具有重要功能的一组脂质化合物的成员。每一前列腺素F2 a包含20个碳原子，包括一个 5碳环。它们是介导物并具有许多种强的生理效应。存在许多不同的前列腺素家族，每一家族对于特定的受体具有特异性，产生特定的效应。前列腺素F2a及类似物结合前列腺素F2a受体。类似物可代表不同的同种型，诸如5-6反式、15-酮、15-表(epi)、15(S)前列腺素F2a、修饰的前列腺素诸如酯、醚、酰胺、氮氧化物、肽基，诸如拉坦前列素、曲伏前列素、乌诺前列酮、比马前列素和其它。愈合剂是启动、促进、改善、增强或者利于人体内损害天然愈合过程的化合物。它们包括乙酰基半胱氨酸、维生素A、D、E和K、叶黄素、芦荟提取物诸如aloine、氰钴胺。缓冲液是维持组合物pH为规定值的化合物它们可包括磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐或硼酸盐缓冲液或其组合。增稠剂和/或增湿剂是用于缓解干眼症的化合物。它们可包括但不限于聚乙烯醇、葡聚糖、聚卡波非、羟丙基甲基纤维素、羧基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、PEG-400、卡波普、羟丙基甲基纤维素、聚山梨酸酯80、羟丙基瓜尔胶、透明质酸、壳聚糖、葡聚糖和其它，或者它们的组合。
抗氧化剂是阻止或延缓由空气中所存在的氧导致产物变质的化合物。它们可包括维生素C、维生素E、EDTA、亚硫酸氢钠或其组合。促分泌化合物是引起另一物质以受控方式分泌的物质，诸如前列腺素E，它促进黏蛋白的分泌。


图I.在大鼠中角膜去上皮后4天时的眼睛表面疤痕。图2.在治疗期结束时测量的角膜疤痕面积。*，当与舒而坦@或O. 02% BAK相比时 P < O. 05。图3.在第4天时，所治疗眼睛表面的表面上皮的体外共聚焦显微镜图像，并且与第O天时的基础情况相比较。图4.所治疗大鼠角膜的苏木精-曙红染色。*定位角膜上的上皮。图5.在实验阶段结束时结膜中的杯状细胞计数。#，当与PBS相比时P < 0.02 ;*，当与PBS或者本发明的拉坦前列素乳状液相比时P < O. 0001。图6.所治疗眼睛结膜上的MUC5AC免疫组织学定位。图7.行刮术和滴眼剂刺激后2小时不同治疗对细胞存活和迁移的有效性。图8.行刮术和滴眼剂刺激后24小时不同治疗对细胞存活和迁移的有效性。图9.行刮术后2小时和24小时时的创伤闭合，测量为单细胞层边缘之间的距离。*，当与PBS或本发明的拉坦前列素乳状液比较时P < O. 01 ;#，当与PBS或本发明的拉坦前列素乳状液比较时P < O. 002。图10.所治疗细胞的Ki67免疫组织学鉴定。注意图片上表现出灰色至白色的分裂细胞。

孔板中并培养直到汇合。在汇合时，用黄色移液管尖刮擦细胞单层，去除培养基并用1/10稀释的不同测试物品(PBS(磷酸盐缓冲溶液)，舒而坦 (O. 005%的拉坦前列素水溶液)，O. 02% BAK(苯扎氯铵水溶液)，和本发明的拉坦前列素乳状液(含O. 005%拉坦前列素))孵育30分钟。在治疗之后，去除测试物品稀释液并换成新鲜的培养基。在治疗后2小时和24小时时评价刮伤的闭合。对行刮术后培养24小时的细胞还开展增殖标志物(Ki67)的免
疫组织学。MM :行刮术后2小时和24小时时，拍摄细胞单层的照片以评价不同治疗对刮伤后闭合的有效性。明显地，本发明的拉坦前列素乳状液表现出对细胞存活和迁移具有积极的效果(图7和8)。使用本发明的拉坦前列素乳状液时，存在较少的死亡细胞并且仅在刮术后24小时完成了裂口的闭合，而舒而坦 , O. 02% BAK溶液甚至PBS表现出不闭合或者仅较少闭合。对于测试中不同条件的这些数据的汇总表明，本发明的拉坦前列素乳状液能够增加创伤闭合速度，而舒而坦@和O. 02% BAK溶液均改变体外创伤愈合过程。使用后面的两种测试物品没有观察到闭合(见图9)，如通过刮术后24小时的创伤闭合％仍保持很低所证明，对于舒而坦@和O. 02% BAK溶液分别为6%和8%。相反，拉坦前列素乳状液具有85%的创伤闭合％。这通过增殖标志物Ki67的免疫组织学数据(见图10)证实。在用本发明的拉坦前列素乳状液处理的平板中，在刮伤创伤边缘附近出现更多的Ki67阳性细胞(即分裂细胞)。这表明了本发明的组合物对角膜细胞的愈合特性。实施例3 :前列腺素F2 α的组合物组合物I


本发明涉及用于治疗角膜和结膜损害的组合物，其中组合物包含治疗量的前列腺素F2α或类似物，所述组合物为适宜在眼睛表面局部应用的形式并且无有害的防腐剂；本发明还涉及用于治疗需要治疗的患者中眼睛表面疾病的方法，包含施用本发明的组合物。