专利名称：一种以L-苏氨酸为底物生产α-酮基丁酸的方法α-酮基丁酸是一种重要的中间体，可应用于化学和药物等领域。例如，α-酮基丁酸可用于生产L-异亮氨酸1、1-丙醇23、食品香料组分4以及D- α -羟基丁酸5。其中，D- α -羟基丁酸可用来制备azinothricin家族抗癌抗生素以及高聚物聚α -羟基丁酸 [Ρ(2ΗΒ)6。另外，α-酮基丁酸可转变为L-α-氨基丁酸，而后者是合成左乙拉西坦等抗癫痫药物的手性前体78。α -酮基丁酸的生产方法分为传统的化学法和微生物催化法。前者指的是由草酸二乙酯和丙酸乙酯混合水解而成0-酮基丁酸9。而文献中报道的后者包括以下几种以 1，2_丁二醇为起始底物，以马红球菌IF03730全细胞为催化剂，最终产物浓度为153. 8毫摩尔/升，摩尔转化率为68%，生产强度为4. 8毫摩尔/升/小时1°；以巴豆酸为起始底物， 以锇和恶臭假单胞菌全细胞为催化剂，最终产物浓度为47毫摩尔/升，生产强度为9. 4毫摩尔/升/小时9；以DL-2-羟基丁酸为底物，以施氏假单胞菌SDM为催化剂，最终产物浓度为434. 9毫摩尔/升，摩尔转化率为91. 5%，生产强度为18. 1毫摩尔/升/小时11；以苏氨酸为底物，粗糙脉胞菌的ilv-3突变体发酵产α -酮基丁酸78. 4毫摩尔/升，摩尔转化率> 90%，生产强度为0. 7毫摩尔/升/小时4。1，2- 丁二醇、巴豆酸及DL-2-羟基丁酸只能通过化学法获得，不能实现α-酮基丁酸的绿色生产。而苏氨酸可以通过微生物发酵大规模获得，全世界L-苏氨酸的产量达到20，000吨12，非常适合作为α -酮基丁酸的起始底物。由L-苏氨酸转化生成α-酮基丁酸，经过了 L-苏氨酸脱水酶催化的脱氨和脱水过程13。L-苏氨酸脱水酶(L-苏氨酸脱氨酶)分为合成型和降解型两种。合成型L-苏氨酸脱水酶在有氧条件下组成性表达，受到L-异亮氨酸的抑制；降解型L-苏氨酸脱水酶厌氧条件下受L-苏氨酸诱导表达，不受L-异亮氨酸的抑制141516。经检索发现，利用以含合成型L-苏氨酸脱水酶的微生物完整细胞作为生物催化剂，以L-苏氨酸作为底物，生产 α-酮基丁酸的方法还未见报道。参考文献1Eggeling, I. , Codes, C. , Eggeling, L. , Sahm, H. , 1987. Regulation of acetohydroxy acid synthase in Corynebacterium glutamicum during fermentation of α -ketobutyrate to L-isoleucine. App1. Microbial. Biotechnol. 25,346-351.2Atsumi, S. , Hanai, T. , Liao, J. C. , 2008. Non-fermentative pathways for synthesis of branched—chain higher alcohols as biofuels. Nature 451,86-89.3Shen, C. R. , Liao, J. C. , 2008. Metabolic engineering of Escherichiacoli for 1-butanol and 1-propanol production via the keto-acid pathways. Metab. Eng. 10,312-320.4Zurbriggen， B. D. ， Rekhif， N. ， Mehlmann-De-Campos, Μ. ， Lerch, K. ,2006. Production of α -ketobutyrate. U. S. patent 7144715.5Simon，E. S.，Plante，R. ,Whitesides,G. Μ. , 1989. D-Iactate dehydrogenase. Substrate specificity and use as a catalyst in the synthesis of homochiral 2-hydroxy acids. App1. Biochem. Biotechnol. 22，169-179.6Gao， C. ， Zhang, W. ， Ma, C. ， Liu, P. ， Xu, P. ，2011. Kinetic resolution of 2-hydroxybutanoate racemic mixtures by NAD-independent L-lactate dehydrogenase. Bioresour. Technol. 102，4595-4599.7Zhang，K.，Li，H.，Cho, K. Μ.，Liao，J. C. , 2010. Expanding metabolism for total biosynthesis of the nonnatural amino acid L-homoalanine. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 107,6234-6239.8Park，E.，Kim，M.，Shin，J. S.，2010. One-pot conversion of L-threonine mto L-homoalanine :biocatalytic production of an unnatural amino acid from a natural one. Adv. Synth. Catal. 352，3391-3398.9Furuyoshi，S.，Nawa, Y.，Kawabata, N. , 1991. Microbial production of 2-oxobutyric acid from crotonic acid. Agric. Biol. Chem. 55,123-128.10Nakahara，T.，Nakajima-kambe，T.，and Sato，S. , 1994. Production of 2-ketobutyric acid from 1，2—butanediol by resting cells ofRhodococcus equi IFO 3730. Biotechnol. Lett. 16，263-268.llGao，C. ， Zhang, W. ， Lv, C. ， Li， L. ，Ma, C. ，Hu, C. ，Xu, P. ，2010. Efficient production of 2-oxobutyrate from 2-hydroxybutyrate by using whole cells of Pseudomonas stutzeri stram SDM. Appl. Envrion. Microbiol. 76,1679-1682.12Debabov，V. G. ,2003. The threonine story. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 79，113-136.13Husain，A. ， Jeelani, G. ， Sato, D. ， Ali， V. ， Nozaki, Τ. , 2010. Characterization of two isotypes of L-threonine dehydratase from Entamoeba histolytica. Mol. Biochem. Parasito 1. 170,100—104.14Lam，V.M.S.，Chan，I.P.R.，Yeung，Y.G.，1980.Roleof L-threonine deaminase and L-threonine 3一dehydrogenase in the utilization of L-threonine by Pseudomonas aeruginosa· J. Gen. Microbiol. 117，539—542.15Umbarger，H. Ε. ,1956. Evidence for a negative-feedback mechanism in the biosynthesis of isoleucine.Science 123,848.16Luginbuhl，G.H.，Hofler，J. G.，Decedue，C. J.，Burns，R. 0.， 1974. Biodegradative L-threonine deaminase of Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 120，559-561.发明内容针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种以含合成型L-苏氨酸脱水酶的微生物完整细胞作为生物催化剂，以L-苏氨酸作为底物，生产α -酮基丁酸的方法。本发明所述的以L-苏氨酸作为底物生产α-酮基丁酸的方法，步骤是(1)制备含生物催化剂的悬液选取假单胞菌属、棒杆菌属或芽孢杆菌属等含合成型L-苏氨酸脱水酶的菌株，在 LB培养基中以常规摇瓶或者发酵罐方式有氧培养；分离并收集菌体，用PH 7. 2 7. 5磷酸钾缓冲液洗涤菌体2 4次，分离得到的微生物完整细胞即为生物催化剂；将生物催化剂重悬于上述磷酸钾缓冲液或者去离子水中，使生物催化剂浓度达到200克湿细胞/升，即得到含生物催化剂的悬液，4°C储存备用；(2)转化将步骤(1)中制得的含生物催化剂的悬液与L-苏氨酸水溶液混合，并使混合物中 L-苏氨酸的浓度为10 80克/升、生物催化剂浓度为40 150克湿细胞/升；在20 65°C,pH7. 0 11. 0条件下，以50 250转/分钟振荡反应1 30小时，得转化液；(3)制取含α -酮基丁酸的溶液将步骤O)的转化液以5，000 14，000转/分离心5 25分钟，或者用200 400目滤布过滤，去除步骤O)中加入的生物催化剂，所得清液即为含α-酮基丁酸的溶液；(4) α -酮基丁酸和L-苏氨酸检测将上述含α-酮基丁酸的溶液于100°C加热10分钟，以5，000 14，000转/分离心1 10分钟，将所得清夜用4%磺基水杨酸稀释，4°C静置过夜，离心后所得上清即为样PΡΠ Oα -酮基丁酸含量测定采用高效液相色谱AgilentllOO系统，层析柱为Aminex ΗΡΧ-87Η(美国)，分析条件为以10毫摩尔/升硫酸为流动相，柱温55°C，流速为0. 4毫升/ 分钟，进样量5微升，采用示差折光检测器。α -酮基丁酸的鉴定采用质谱检测。测定L-苏氨酸浓度用氨基酸分析仪(Hitachi，L-8900，日本)。转化率=(产生的α -酮基丁酸的物质的量浓度+原L-苏氨酸的物质的量浓度)X 100%。上述以L-苏氨酸为底物生产α -酮基丁酸的方法中步骤(1)所述含合成型L-苏氨酸脱水酶的菌株优选施氏假单胞菌(I^eudomonas stutzeri) SDM CCTCC NO :M206010、谷氨酸棒杆菌 ATCC13032 或枯孢杆菌 ATCC23857。步骤( 所述L-苏氨酸的浓度优选20 60克/升；所述生物催化剂浓度优选 60 120克湿细胞/升；所述温度优选30 60°C ；所述pH范围优选8. 0 10. 0 ；所述反应时间优选为2 M小时。本发明选用含合成型L-苏氨酸脱水酶的微生物完整细胞作为生物催化剂，以 L-苏氨酸作为底物，成功实现了 α-酮基丁酸的高效生产。本发明方法具有以下特点(1)菌体培养及反应周期均较短。(2)底物L-苏氨酸生成α-酮基丁酸的转化率高，可达99.6%以上。(3)产物α -酮基丁酸可积累到较高浓度。(4)所用菌株不需破碎，可直接用完整细胞进行转化，操作方便。(5)利用完整细胞催化，无需添加价格昂贵的辅因子。5(6)生物催化剂可以通过过滤或离心去除，并且产物成分简单，有利于后续分离提取。


图1 α -酮基丁酸高效液相色谱检测结果。其中a为标准品，b为反应样品。图2 产生的α -酮基丁酸质谱检测结果。图3 氨基酸分析仪检测氨的生成。

所得清夜即为含α-酮基丁酸的溶液。(4) α -酮基丁酸和L-苏氨酸检测将上述含α -酮基丁酸的溶液于100°C加热10分钟，以10，000转/分离心10分
钟，将所得清夜用4%磺基水杨酸稀释，4°C静置过夜，离心后所得上清即为样品。α -酮基丁酸含量测定采用高效液相色谱AgilentllOO系统，层析柱为Aminex ΗΡΧ-87Η(美国)，分析条件为以10毫摩尔/升硫酸为流动相，柱温55°C，流速为0. 4毫升/ 分钟，进样量5微升，采用示差折光检测器。α -酮基丁酸的鉴定采用质谱检测。测定L-苏氨酸浓度用氨基酸分析仪(Hitachi，L-8900,日本)。转化率=(产生的α -酮基丁酸的物质的量浓度+原L-苏氨酸的物质的量浓度)X 100%。经检测，转化液中α-酮基丁酸的浓度为34.2克/升，转化率为49.9%。α-酮基丁酸的高效液相色谱检测结果如图1所示，质谱检测结果如图2所示，证实产物有α-酮基丁酸的生成。氨基酸分析仪测定样品中有氨的生成，如图3所示。产物为α-酮基丁酸和氨，证明本发明的以L-苏氨酸作为底物生产α-酮基丁酸的过程是由L-苏氨酸脱水酶催化的脱水脱氨过程。另外，由于微生物细胞是在有氧条件下培养，且培养过程不需要添加诱导剂，所以催化过程涉及到的L-苏氨酸脱水酶为合成型的。实施例2 (1)制备含生物催化剂的悬液
选取枯草芽孢杆菌ATCC23857，在LB培养基中以常规摇瓶或者发酵罐方式有氧培养；分离并收集菌体，用PH 7. 4磷酸钾缓冲液洗涤菌体3次，分离得到的微生物完整细胞即为生物催化剂。生物催化剂重悬于磷酸钾缓冲液或者去离子水中，使生物催化剂浓度达到 200克湿细胞/升，即得到含生物催化剂的悬液，4°C储存备用；(2)转化将步骤(1)中制得的含生物催化剂的悬液与L-苏氨酸水溶液混合，并使混合物中 L-苏氨酸的浓度为10克/升、生物催化剂浓度为60克湿细胞/升；在30°C, pH 8. 0条件下，以200转/分钟振荡反应M小时，得转化液；(3)制取含α -酮基丁酸的溶液将上述转化液，以12，000转/分离心20分钟，去除步骤( 中加入的生物催化剂，
所得清夜即为含α-酮基丁酸的溶液。(4) α -酮基丁酸和L-苏氨酸检测经检测，转化液中α -酮基丁酸的浓度为0. 64克/升，转化率为7. 5%。实施例3 (1)制备含生物催化剂的悬液选取施氏假单胞菌(P. stutzeri) SDM CCTCC NO :Μ206010，在LB培养基中以常规摇瓶或者发酵罐方式有氧培养；分离并收集菌体，用PH 7. 4磷酸钾缓冲液洗涤菌体3次，分离得到的微生物完整细胞即为生物催化剂。生物催化剂重悬于磷酸钾缓冲液或者去离子水中，使生物催化剂浓度达到200克湿细胞/升，即得到含生物催化剂的悬液，4°C储存备用；(2)转化将步骤(1)中制得的含生物催化剂的悬液与L-苏氨酸水溶液混合，并使混合物中 L-苏氨酸的浓度为60克/升、生物催化剂浓度为120克湿细胞/升；在65°C，pH 7. 0条件下，以200转/分钟振荡反应M小时，得转化液；(3)制取含α -酮基丁酸的溶液将上述转化液，以12，000转/分离心20分钟，去除步骤( 中加入的生物催化剂，
所得清夜即为含α-酮基丁酸的溶液。(4) α -酮基丁酸和L-苏氨酸检测经检测，转化液中α-酮基丁酸的浓度为19.6克/升，转化率为38. 1%。实施例4 (1)制备含生物催化剂的悬液选取谷氨酸棒杆菌ATCC13032，在LB培养基中以常规摇瓶或者发酵罐方式有氧培养；分离并收集菌体，用PH 7. 4磷酸钾缓冲液洗涤菌体3次，分离得到的微生物完整细胞即为生物催化剂。生物催化剂重悬于磷酸钾缓冲液或者去离子水中，使生物催化剂浓度达到 200克湿细胞/升，即得到含生物催化剂的悬液，4°C储存备用；(2)转化将步骤(1)中制得的含生物催化剂的悬液与L-苏氨酸水溶液混合，并使混合物中 L-苏氨酸的浓度为20克/升、生物催化剂浓度为40克湿细胞/升；在60°C，pH 10. 0条件下，以200转/分钟振荡反应20小时，得转化液；(3)制取含α -酮基丁酸的溶液
将上述转化液，以12，000转/分离心20分钟，去除步骤( 中加入的生物催化剂，
所得清夜即为含α-酮基丁酸的溶液。(4) α -酮基丁酸和L-苏氨酸检测经检测，转化液中α -酮基丁酸的浓度为12. 1克/升，转化率为70. 6%。实施例5 (1)制备含生物催化剂的悬液选取施氏假单胞菌(P. stutzeri) SDM CCTCC NO :Μ206010，在LB培养基中以常规摇瓶或者发酵罐方式有氧培养；分离并收集菌体，用PH 7. 4磷酸钾缓冲液洗涤菌体3次，分离得到的微生物完整细胞即为生物催化剂。生物催化剂重悬于磷酸钾缓冲液或者去离子水中，使生物催化剂浓度达到200克湿细胞/升，即得到含生物催化剂的悬液，4°C储存备用；(2)转化将步骤(1)中制得的含生物催化剂的悬液与L-苏氨酸水溶液混合，并使混合物中 L-苏氨酸的浓度为30克/升、生物催化剂浓度为60克湿细胞/升；在50°C, pH 8. 0条件下，以200转/分钟振荡反应6小时，得转化液；(3)制取含α -酮基丁酸的溶液将上述转化液，以12，000转/分离心20分钟，去除步骤( 中加入的生物催化剂，
所得清夜即为含α-酮基丁酸的溶液。(4) α -酮基丁酸和L-苏氨酸检测经检测，转化液中α -酮基丁酸的浓度为25. 6克/升，转化率为99. 6%。本发明中涉及的含合成型L-苏氨酸脱水酶的菌株施氏假单胞菌(P. stutzeri) SDMCCTCC NO :M206010为申请人实验室保藏菌株，该菌株先前已进行了专利保护与保藏；谷氨酸棒杆菌ATCC13032及枯草芽孢杆菌ATCC23857购自美国模式培养物集存库 (American type culture collection)。


本发明公开了一种以L-苏氨酸为底物生产α-酮基丁酸的方法，其中产物α-酮基丁酸是以含合成型L-苏氨酸脱水酶的微生物完整细胞作为生物催化剂，以L-苏氨酸为底物，在20～65℃，pH 7.0～11.0条件下，以50～250转/分钟振荡转化后获得。本发明的方法具有以下特点(1)采用生物催化的方法，反应体系简单，反应条件温和，步骤简短，操作简便；生物催化剂可以容易地除去，便于后续产物分离纯化；(2)底物L-苏氨酸生成α-酮基丁酸的转化率高，可达99.6％以上，产物α-酮基丁酸可积累到较高浓度；(3)底物L-苏氨酸价格低廉，易于获得。本发明为实现α-酮基丁酸的高效生产奠定了基础。